本發(fā)明涉及水稻基因及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種水稻穗發(fā)芽相關(guān)基因LOC_Os01g50420及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

穗萌或穗發(fā)芽(preharvest sprouting)，是種子在收獲前遇到陰雨天氣或高溫潮濕環(huán)境條件時在母體植株上發(fā)芽的現(xiàn)象。一旦出現(xiàn)穗發(fā)芽，種子儲存物大量消耗，直接導(dǎo)致減產(chǎn)；甚至造成加工品質(zhì)、營養(yǎng)品質(zhì)、食用品質(zhì)和種子活力下降，失去商用價值。水稻是重要的糧食作物，是我國第一大糧食作物。穗發(fā)芽對水稻生產(chǎn)造成不同程度的危害。我國稻米主產(chǎn)區(qū)的長江流域和華南一帶，早秈稻的收獲季節(jié)正好趕上當(dāng)?shù)氐拿酚昙竟?jié)，高溫、高濕的環(huán)境條件更易導(dǎo)致穗發(fā)芽。據(jù)資料統(tǒng)計，我國水稻每年因穗發(fā)芽造成的損失率達5％以上，嚴(yán)重影響早稻稻谷的產(chǎn)量和品質(zhì)。我國南方雜交稻的制種過程中，廣泛使用赤霉素，削弱了種子休眠性，加上收獲季節(jié)的高溫高濕條件，穗發(fā)芽現(xiàn)象嚴(yán)重。因此，研究解決水稻穗發(fā)芽抗性問題對促進水稻生產(chǎn)、確保我國的糧食安全有重大意義。

穗發(fā)芽抗性與種子休眠性密切相關(guān)。目前通過資源篩選并進行遺傳分析，已經(jīng)定位了大量休眠性數(shù)量性狀位點(QTL)，但只有少數(shù)幾個被克隆。因此能應(yīng)用于實際生產(chǎn)的基因非常少?，F(xiàn)已克隆的休眠性相關(guān)基因有的影響其它農(nóng)藝性狀，如qSD1-2；有的功能性標(biāo)記不明確，如sdr4；造成生產(chǎn)應(yīng)用不方便。我們在研究水稻穗發(fā)芽性狀時發(fā)現(xiàn)過表達LOC_Os01g50420基因促進水稻穗發(fā)芽，在資源材料中找到的該基因變異材料抗穗發(fā)芽。因此該基因具有調(diào)控水稻穗發(fā)芽的功能。提高種子休眠性，解決水稻穗發(fā)芽問題是水稻生產(chǎn)中的一個重要研究方向?；谏鲜鰡栴}及發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提出了水稻穗發(fā)芽相關(guān)基因LOC_Os01g50420及其應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的：第一是提供一種水稻穗發(fā)芽調(diào)控基因LOC_Os01g50420，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；第二個是提供一種水稻穗發(fā)芽調(diào)控蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，由SEQIDNO.1編碼；第三個是提供基因LOC_Os01g50420應(yīng)用于改善水稻抗穗發(fā)芽能力。

水稻穗發(fā)芽相關(guān)基因LOC_Os01g50420是水稻種子休眠性調(diào)控基因；

所述水稻穗發(fā)芽相關(guān)基因LOC_Os01g50420變異材料，在編碼區(qū)第1377位堿基由A突變?yōu)門，導(dǎo)致第459位氨基酸由亮氨酸突變?yōu)楸奖彼?，休眠性分析實驗表明這些材料都具有一定休眠性，生產(chǎn)中具有抗穗發(fā)芽能力，將發(fā)生這種突變的基因型記為LOC_Os01g50420-T，是休眠型基因，自然材料中也可能存在其它LOC_Os01g50420休眠型變異。

優(yōu)選的，所述水稻基因LOC_Os01g50420包含SEQNO.1所包含的核苷酸序列或其互補序列。

優(yōu)選的，所述通過功能標(biāo)記輔助篩選休眠型材料的后代，選擇具有休眠型LOC_Os01g50420基因的后代。

優(yōu)選的，所述功能標(biāo)記輔助篩選的具體操作方法為：以含LOC_Os01g50420-T基因材料作為親本進行雜交，在后代中擴增包含編碼區(qū)1377位的DNA片段，測序擴增產(chǎn)物；依據(jù)測序結(jié)果篩選含LOC_Os01g50420-T基因的材料，再從這些后代中選擇具有優(yōu)異農(nóng)藝性狀的材料，最后篩選具有LOC_Os01g50420-T基因的純合材料，該材料的種子休眠性提高，具有抗穗發(fā)芽特性，也可在LOC_Os01g50420附近開發(fā)連鎖標(biāo)記，用連鎖標(biāo)記輔助篩選LOC_Os01g50420休眠型基因。

優(yōu)選的，所述的水稻穗發(fā)芽相關(guān)基因LOC_Os01g50420，通過基因編輯技術(shù)編輯LOC_Os01g50420基因，破壞LOC_Os01g50420基因功能，獲得的后代具有抗穗發(fā)芽表型。

優(yōu)選的，所述基因編輯技術(shù)的具體操作方法為：

A、敲除載體構(gòu)建：參照CRISPR/Cas9編輯技術(shù)，選定靶標(biāo)序列，根據(jù)靶標(biāo)序列合成引物，通過PCR合成表達盒DNA片段，再利用邊切邊接法，把表達盒插入多靶點載體pYLCRISPR/Cas9Pubi-H，測序驗證其表達盒序列正確；

B、采用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將敲除載體轉(zhuǎn)入易穗發(fā)芽材料，轉(zhuǎn)化T₀代，用潮霉素溶液浸泡葉片的辦法進一步確認(rèn)陽性單株；

C、提取陽性單株DNA，擴增靶標(biāo)序列上下游300bp的區(qū)段，測序，以野生型為參照，選擇LOC_Os01g50420基因突變株，繁種，自交得到T₁代株系，經(jīng)PCR擴增檢測篩選沒有潮霉素標(biāo)記的植株，再測序分析靶標(biāo)序列附近區(qū)段DNA，篩選LOC_Os01g50420基因變異純合株，該材料具有抗穗發(fā)芽特性。

優(yōu)選的，所述擴增操作的具體條件為：提取植株DNA，以此為模板，用引物pkF和pkR進行PCR擴增，其中pkF：5'-AGAGTTCGCGGTGATATGCC-3'，pkR：5'-GTGCGAGATCACGAGAGAGGA-3'，PCR所用的聚合酶為KODFX，反應(yīng)體系為25uL，按照KODFX的說明書配制PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：94℃5min；94℃30sec，59℃30sec，68℃30sec，32個循環(huán)；68℃5min，PCR擴增獲得約510bp的片段。

本發(fā)明通過試驗證明，LOC_Os01g50420的變異后代具有明顯的種子休眠性，表現(xiàn)出抗穗發(fā)芽的潛力；過表達LOC_Os01g50420導(dǎo)致穗發(fā)芽現(xiàn)象增加，由此說明，本發(fā)明的基因LOC_Os01g50420是水稻穗發(fā)芽調(diào)控基因。

本發(fā)明相比于現(xiàn)有技術(shù)，其有益效果如下：

1.本發(fā)明提供了利用ubi啟動子過表達基因LOC_Os01g50420的水稻轉(zhuǎn)化載體，該載體轉(zhuǎn)化水稻后能大幅提高基因LOC_Os01g50420的表達量(圖1)，伴隨著表達量的提高，轉(zhuǎn)化植株的成熟后期穗發(fā)芽現(xiàn)象有明顯的提高，并且轉(zhuǎn)基因植株在生長狀態(tài)及農(nóng)藝性狀上沒有明顯的改變，因此明確了LOC_Os01g50420調(diào)控穗發(fā)芽的生物學(xué)功能。

2.本發(fā)明首次證明了水稻基因LOC_Os01g50420是水稻穗發(fā)芽調(diào)控基因，本發(fā)明在資源材料中篩選到的LOC_Os01g50420變異材料都有明顯的種子休眠性(表1)，具有抗穗發(fā)芽的能力。

附圖說明

圖1 LOC_Os01g50420過表達株系種子mRNA表達分析。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步解說。

案例一：

本發(fā)明提出的水稻穗發(fā)芽相關(guān)基因LOC_Os01g50420，是水稻種子休眠性調(diào)控基因。統(tǒng)計分析3000份種質(zhì)材料中LOC_Os01g50420基因的變異，其中編碼區(qū)第1377位SNP可能影響其功能(把這種基因型記為LOC_Os01g50420-T)。這種類型變異材料很少，約占9.6％，這類材料大多分布于南亞地區(qū)。我們從自有的種質(zhì)資源中篩選到5份LOC_Os01g50420-T型種質(zhì)，這5份材料的休眠性均較強(表1)。

通過功能標(biāo)記輔助篩選休眠型材料的后代，選擇具有LOC_Os01g50420-T休眠型基因的后代，具體操作方法為：以含LOC_Os01g50420-T型基因作為親本進行雜交，在后代中利用引物pkF和pkR擴增，測序；依據(jù)測序結(jié)果篩選含LOC_Os01g50420-T型基因的材料，再從這些后代中選擇具有優(yōu)異農(nóng)藝性狀的材料，最后篩選具有LOC_Os01g50420-T的純合材料，這種材料具有抗穗發(fā)芽特性。

表1 LOC_Os01g50420-T型種質(zhì)材料種子休眠性考察結(jié)果

案例二：

通過基因編輯技術(shù)編輯LOC_Os01g50420基因，破壞LOC_Os01g50420基因功能，獲得的后代具有抗穗發(fā)芽表型；具體操作方法為：

A、敲除載體構(gòu)建：參照CRISPR/Cas9編輯技術(shù)，合成引物Cris1u6aF和Cris1u6aR(Cris1u6aF：5'-CCAATCGGCCGCTCGGAGTcggcagccaagccag-3'，Cris1u6aR：5'-ACTCCGAGCGGCCGATTGGgttttagagctagaaat-3')，利用該引物通過PCR合成表達盒，再利用邊切邊接法，把表達盒導(dǎo)入pYLCRISPR/Cas9多靶點載體，測序驗證其表達盒序列正確；

B、采用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將過表達載體轉(zhuǎn)入易穗發(fā)芽材料，轉(zhuǎn)化T0代，提取DNA，用引物HygBioF和HygBioR擴增(HygBioF：5'-acggtgtcgtccatcacagtttgcc-3'，HygBioR：5'-ttccggaagtgcttgacattgggga-3')，退火溫度58℃，延伸時間30秒。檢測擴增產(chǎn)物，擴增條帶清晰的為陽性轉(zhuǎn)化植株；

C、以陽性株DNA為模板，利用引物pkdecF和pkdecR(pkdecF：5'-CCAGGAACATCATGGTCGGC-3'，pkdecR：5'-AGCATTCGGCGTTCAGCGT-3'),擴增測序(退火溫度60℃，延伸時間30秒)，以野生型為參照，選擇LOC_Os01g50420基因突變株繁種，自交得到T1代株系，每個株系選擇10株經(jīng)PCR擴增檢測篩選沒有潮霉素標(biāo)記的植株，再以無潮霉素標(biāo)記DNA為模板，利用引物pkdecF和pkdecR擴增LOC_Os01g50420基因片段，測序篩選發(fā)生變異的單株；自交繁殖，提取葉片DNA，利用引物pkdecF和pkdecR擴增，測序，依據(jù)測序結(jié)果，篩選LOC_Os01g50420基因變異純合株，該材料具有抗穗發(fā)芽特性。

>1

GAACACAGCAAGTGAGATCGATGGATGCGGCTGCGGTGATGCAGAAGCAGCTCAGGCGGCTCCGCACGCTCGGCCGCGGCGCGTCGGGCGCCGTGGTGTGGCTCGCGTCGGACGACGCGTCGGGGGAGCTGCTGGCGGTCAAGTCGGCGGCCGGCGAGGGCGGGGCGGAGCAGCTGCGGCGCGAGGGGCGCGTCATGTCGGGGCTCTGCTCCCCGCACATCGTCCCCTGCCTCGGGTCACGCGCCGCGGCGGGCGGGGAGTACCAGCTGTTCCTCGAGTTCGCGCCTGGCGGGTCGCTCGCCGACGAGGCCGCGAGGAGCGGGGGCCGCCTCGCGGAGCGCGCCATCAGCGCGTACGCGGCGGACGTGGCGAGGGCGCTGGCCTACCTCCACGGGAACTCGCTGGTGCACGGGGACGTCAAGGCCAGGAACATCATGGTCGGCGCCGACGGGCGGGCCAAGCTCGCGGACTTCGGGTGCGCGAGGAGGACTGACTCCGAGCGGCCGATTGGTGGCACGCCGGCGTTCATGGCGCCGGAGGTGGCGCGAGGCGAGGAGCAGGGACCGGCCGCCGACGTGTGGGCTCTCGGTTGCACGATCATCGAGATGGCCACAGGCCGCGTCCCGTGGAGCGACATGGACGACGTCTTCTCCGCCGTCCACCGGATCGGGTACACGGACGCTGTGCCAGAGATTCCCGAATGGCTCTCCCCGGAGGCGAAGAATTTCCTATCCAGATGCTTCACAAGGAACCCAAGCGACCGCCCCACTGCCGCGCAGCTACTGGAGCACCCATTTCTCGCATCCGCCTCCAGCGACATCGACGAAACGGCGCCGAAGCACGGCTGGGTGTCCCCCAAGAGCACGCTGAACGCCGAATGCTGGGAATCTGATGAAGACGACGAAGTAGAAGAAGGCATGTCACAGAGCGCAACCAAGAGGATCAGCGCATTGGCGATCACCTGCTCGGCGTTGCCGGACTGGGACTCCGAGGATGGCTGGATCGACTTGCAAAGCGACCCATCTGAAGTTTCGGAAACACCGGCGCCCATGGTGGTGACTACTGCAGATTTCGGTCTTTGGTGGGAGGAAGCATTGGACGCGGAGATTGATCTCCATTTCGTTGACGTGGACGGCGATGGCTATGTTACGCGAACTGTACGCGCGCGTGGTTTCATTGAGTACGACAGACAACTGAGTGTGAGAGTTCGCGGTGATATGCCGTTGTGCCCGGTTGATTGCCACCGGAGCGACACTGTAA AATTCGGTTGTCATTGTAACGGGAACAGAGTAATAAATTTCGAGTCTGCACAAATTTGCCTGTTGTTACCATTCATCTTGCAATCAAGGGCTCATAGATTGCATAGCGTTGAGCTCCCGGTAAAAACTTCCGTTTTAAAAAAAAAGGCCCCGGCAAAAACCGTTCAAAGAATTGGTTTAAGGCTGATTCTCACTGTTTTGACTAGAATGAGCAATTTTTAACCGAGTTGACATCTTTCCACCAAAACTTTAGAAGTTTAGAGCATGGTCATTCGGCCTAAAATAATATCCACTAAATTTCTTTTGGAATCTTTAATCAGAATTTATGGACTATAAAATATATACTACTTCTTTGCAAAAGATATCCTAAACTTAACACCCTAAAAAATAGGGCCACCTCAAATCTCTCCCCTCCTCCTGTGTTTTCGCGACTCCTCTCTCGTGATCTCGCACCCCTCCTTCCGTGCTATTAAGAATTGGTAGCAAGCACATTCCCACAAAAAATAGATAACAAGAAGTCCAGTATAAGGGCAACTAGTAAGCAAACCCGTGCAAATGCACACGACACTTATTTATTTTTCTATAAGAACAACACTGTAAAACTAAAATAGCTCATGAACTTTTATTACAAATTACCTTGCTATAAGCATCGGGAAAAAAAGAGAAAGGAGTTGAATCTTCTGAATGACAAAGTTTAGAAATTGCCTTTCTACAAGCATAGAAAAAAGAGGAAGGATTTCAATCTTCCAAACAACAAAAATGCACATGGATTCAAACATAAATCACTGCCAGTACTGCTCCCTCCTCAAAATATAGCACATATTAACTTTTTTTCACGGTCTTTAACATTATAGTTGAATATTATTGTAAATGTATTGTAAAAATACCACTTCTATGGTTCTACCACTTAACCGGATAATGCCGACATGATCCTGCACCCAGTGAAGTAGACTGCAATTGCCAAATCTTTCTTCTCTCGTGCGGTGAAGCCCTAGTTTGAGCATTGACACACTCCTTGAGATATACTCATGTGCTCACTCAAGTTCCTCGTAAACACACCCATCAGGCCCTTCACATTGGCTCGCTTCAATCTTCTCCGATGATATGAAGTCCAAGCTGATCCACCATCGATATGGCAGTTGCCCTTGAAACCTACACATGCTAGCTTCGCTATCAACAGACTTCCCGAGATTTTTATTTATACACCAATTCAATCTCCAAAAAGACACATCAATCTGATTCGTTGTATTGGCTTGCCTAAGTGAGATTTTGACATAATTCTTCACATCTAGCGCATAGTTTCTTGTAGTCCCACCCTAGAGGACTGCATTGTAAAATGTCCAATTGGCTTTGCCGCTACCGCAGGCCTCCCATTGGGCTCACCTCAGCCCGACTATTCACACACCTGCGATACCTACGTAAGCTATCCAAGTTGTGTTGTACATGCGTCAATGGGGACCATTGGGGACGGACAAAGAGAAGAGTCTGAGAGACATAGGGAAGATATGGAAGATCAAGAATTGAGAATATGCAGTGGTATCACTACGTGGAAGTTTTGA。

>2

MDAAAVMQKQLRRLRTLGRGASGAVVWLASDDASGELLAVKSAAGEGGAEQLRREGRVMSGLCSPHIVPCLGSRAAAGGEYQLFLEFAPGGSLADEAARSGGRLAERAISAYAADVARALAYLHGNSLVHGDVKARNI MVGADGRAKLADFGCARRTDSERPIGGTPAFMAPEVARGEEQGPAADVWALGCTIIEMATGRVPWSDMDDVFSAVHRIGYTDAVPEIPEWLSPEAKNFLSRCFTRNPSDRPTAAQLLEHPFLASASSDIDETAPKHGWVSPKSTLNAECWESDEDDEVEEGMSQSATKRISALAITCSALPDWDSEDGWIDLQSDPSEVSETPAPMVVTTADFGLWWEEALDAEIDLHFVDVDGDGYVTRTVRARGFIEYDRQLSVRVRGDMPLCPVDCHRSDTVKFGCHCNGNRVINFESAQICLLLPFILQSRAHRLHSVELPVKTSVLKKKAPAKTVQRIGLRLILTVLTRMSNF*

本發(fā)明提出的水稻穗發(fā)芽相關(guān)基因LOC_Os01g50420，調(diào)控種子休眠性，可用于解決水稻穗發(fā)芽問題，功能基因明確，生產(chǎn)應(yīng)用方便；本發(fā)明首次證明了水稻基因LOC_Os01g50420是水稻種子休眠性調(diào)控基因，LOC_Os01g50420-T型基因促進種子休眠，育種過程中可利用分子標(biāo)記輔助篩選穗發(fā)芽抗性，更為方便準(zhǔn)確；利用基因編輯技術(shù)改變LOC_Os01g50420基因，可以直接提高現(xiàn)有品種的休眠性，提供了改良穗發(fā)芽抗性的新途徑。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。