本發(fā)明涉及化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及金屬配位化合物。

背景技術(shù)：

microRNA(miRNA)是一類由18～25個(gè)核苷酸組成，并且參與基因調(diào)控的內(nèi)源性RNA分子。miRNA通過(guò)與靶基因互補(bǔ)配對(duì)，在翻譯水平調(diào)控基因的表達(dá)。其廣泛表達(dá)于各種組織和器官，在細(xì)胞的增殖和凋亡、器官形成、發(fā)育等生命過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用miRNA。不同發(fā)育階段、不同組織中miRNA的表達(dá)水平有著顯著差異。近年來(lái)有科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)，很多疾病的發(fā)生與miRNA的表達(dá)水平息息相關(guān)，如2015年Shu&Liu等發(fā)現(xiàn)胃癌患者外周血中miR-185表達(dá)顯著上調(diào)，并推斷miR-185很可能作為潛在的胃癌診斷的生物標(biāo)記物。因此，miRNA作為對(duì)疾病預(yù)測(cè)及診斷的新型生物標(biāo)記物受到了科研工作者廣泛的關(guān)注，對(duì)不同物種中miRNA表達(dá)進(jìn)行識(shí)別對(duì)預(yù)防和診斷相關(guān)疾病具有重要意義。

檢測(cè)miRNA最常用的方法有靈敏度高的qRT-PCR(實(shí)時(shí)熒光定量PCR)特異性強(qiáng)的northern blot(諾瑟雜交法)，高效快速的microarrays(基因芯片)，但這些方法需經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程來(lái)識(shí)別，過(guò)程復(fù)雜，成本高且耗時(shí)。近年來(lái)所報(bào)道RCA(滾環(huán)擴(kuò)增法)，LAMP(環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法)及LCR(連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))等方法雖然在一定程度上提高了識(shí)別靈敏度，但仍未克服耗時(shí)長(zhǎng)且高成本等缺點(diǎn)。

多吡啶釕金屬配合物作為一種高效的熒光淬滅劑，在熒光光譜學(xué)原理作用下，基于多吡啶釕金屬配合物常被應(yīng)用于一些熒光光譜學(xué)實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，但大部分基于多吡啶釕金屬配合物應(yīng)用于核酸分子探針以及DNA光裂解方面，尚未見報(bào)道多吡啶釕金屬配合物用于miRNA檢測(cè)方面的研究。

基于上述結(jié)構(gòu)，多吡啶釕金屬配合物因其較大的極性，使得此類化合物具有較好的水溶性。選用多吡啶釕金屬配合物源于其具有許多優(yōu)勢(shì)，金屬釕配合物是六配位八面體結(jié)構(gòu)，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不易發(fā)生配體取代；配合物的光化學(xué)和光物理信息豐富；有機(jī)配體通過(guò)引入金屬釕不僅保留了有機(jī)配體的活性，并且提高了其溶解度；結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣性更有利于針對(duì)復(fù)雜的生物體系設(shè)計(jì)合成特異性強(qiáng)的小分子探針。目前，多吡啶釕金屬配合物作為熒光探針識(shí)別miRNA的研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種多吡啶釕金屬配合物，該金屬配位化合物具有良好的水溶性，可檢測(cè)胃癌患者外周血中高表達(dá)的miRNA。

本發(fā)明解決上述問題的技術(shù)方案是：

一種多吡啶釕金屬配合物，該金屬配合物的結(jié)構(gòu)為下式(Ⅰ)所示，該配合物的核磁共振氫譜數(shù)據(jù)為：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ9.68(dd,J₁＝8.4,J₂＝9.2Hz,2H),8.93(dd,J₁＝8.4,J₂＝8.8Hz,4H),8.53(d,J＝3.6Hz,1H),8.36(d,J＝5.6Hz,1H),8.29(d,J＝5.6Hz,1H),8.24(t,J＝7.6Hz,2H),8.17(d,J＝9.2Hz,2H),8.12(d,J＝6.0Hz,1H),8.09(m,2H),7.83(d,J＝5.2Hz,2H),7.74(m,2H),7.62(t,J＝7.2Hz,2H),7.45(m,1H),7.41(dd,J₁＝8.0,J₂＝8.0Hz,2H)。

本發(fā)明所述的多吡啶釕金屬配合物的分子式為Ru(bpy)₂(thtp)Cl₂，式中的bpy為2’,2-聯(lián)吡啶，thtp為配體3-噻吩-1,2,4-三嗪并[5,6-f]1,10-鄰菲咯啉。上述多吡啶釕金屬配合物在常溫下為橙紅色固體粉末，具有較好的水溶性和水穩(wěn)定性。

本發(fā)明所述的多吡啶釕金屬配合物采用本領(lǐng)域常用的制備方法，如將配體3-噻吩-1,2,4-三嗪并[5,6-f]1,10-鄰菲咯啉與前體Ru(bpy)₂Cl₂反應(yīng)得到。本發(fā)明人推薦的方法，由以下步驟組成：

(1)將2-氰基噻吩溶解在體積濃度為95％的乙醇中，加入大大過(guò)量的水合肼(80％)，反應(yīng)得到配體thtp；

(2)將1,10-鄰菲羅啉-5,6-二酮加熱溶于無(wú)水乙醇中，再向其中加入2-噻吩甲酰胺腙，反應(yīng)得到黃色沉淀為配體thtp；

(3)稱RuCl₃·3H₂O，2’,2-聯(lián)吡啶，氯化鋰溶解于DMF中，氬氣保護(hù)下120℃回流8h。反應(yīng)完全后冷卻至室溫，加入50ml丙酮冷凍過(guò)夜。溶液抽濾，沉淀用冰水洗至滴下來(lái)的水幾乎沒有顏色，得紫黑色固體Ru(bpy)₂Cl₂為前體；

(4)將前體溶于乙醇：水＝3:1(v:v)的混合體系中，加入1.1倍摩爾量的配體，升溫至90℃反應(yīng)12h，然后冷卻至室溫，旋蒸大部分溶劑，將產(chǎn)物溶于乙腈用中性氧化鋁(200mesh)柱分離即可得到所述橙紅色固體Ru(bpy)₂(thtp)Cl₂。

本發(fā)明的所述的多吡啶釕金屬配合物具有檢測(cè)胃癌患者外周血中高表達(dá)microRNA的性能。檢測(cè)原理如下：配合物首先通過(guò)靜電、π-π堆積和(或)氫鍵作用等非共價(jià)鍵作用與probe-DNA(帶有熒光標(biāo)記物質(zhì)的miRNA的逆轉(zhuǎn)錄DNA，簡(jiǎn)稱為P-DNA)結(jié)合形成復(fù)合體系并產(chǎn)生熒光淬滅現(xiàn)象。在加入miRNA后，miRNA與P-DNA通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的作用形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的雜化雙鏈DNA/RNA。由于雜化雙鏈螺旋骨架的保護(hù)作用，使得雜化雙鏈與配合物的相互作用明顯弱于P-DNA單鏈與配合物之間的作用，使得配合物與之分離開來(lái)，體系的熒光也隨著PET機(jī)制消失而復(fù)蘇，實(shí)現(xiàn)了對(duì)miRNA的檢測(cè)。

本發(fā)明的所述的多吡啶釕金屬配合物可以用于檢測(cè)胃癌患者外周血中高表達(dá)miR-185，具體檢測(cè)方法包括以下步驟：

(1)金屬配合物與probe-DNA結(jié)合熒光淬滅能力

用100μM Tris-HCl緩沖溶液將100μM的P-DNA溶液稀釋成50nM，作為待滴定液；將化合物溶解在100μM Tris-HCl緩沖溶液配成500μM(含50nM P-DNA)的溶液為滴定液。取P-DNA待滴定液2mL于常量熒光比色皿中，將滴定液按體積梯度加入比色皿中，記錄體系熒光強(qiáng)度的變化(激發(fā)波長(zhǎng)＝480nm，發(fā)射波長(zhǎng)＝518nm)直到熒光淬滅達(dá)到飽和。熒光淬滅效率Q_E用公式1.1計(jì)算。

Q_E＝(1-F_M/F₀)×100％ (1.1)

其中F₀為P-DNA初始熒光強(qiáng)度；F_M是加入釕配合物后體系熒光淬滅達(dá)到飽和時(shí)的熒光強(qiáng)度。

配體和金屬離子結(jié)合P-DNA的熒光淬滅實(shí)驗(yàn)亦采用此方法完成。

(2)復(fù)合體系與miRNA結(jié)合熒光復(fù)蘇能力

復(fù)合體系檢測(cè)時(shí)間確定：在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，將稀釋后的miRNA溶液(10μM)加入到熒光淬滅達(dá)到飽和的復(fù)合體系中，使miRNA在體系中濃度達(dá)到25nM，監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化，確定體系熒光復(fù)蘇檢測(cè)miRNA的最佳時(shí)間。

熒光復(fù)蘇效率的測(cè)定：以復(fù)合體系的最佳檢測(cè)時(shí)間為標(biāo)準(zhǔn)，記錄復(fù)合體系熒光強(qiáng)度隨miRNA濃度增加而復(fù)蘇的程度，直到熒光復(fù)蘇達(dá)到飽和。熒光復(fù)蘇效率R_E用公式1.2計(jì)算。

R_E＝F_T/F_M-1 (1.2)

其中F_T為加入miRNA后復(fù)蘇達(dá)到飽和時(shí)的熒光強(qiáng)度。

檢測(cè)限的計(jì)算：用公式1.3計(jì)算復(fù)合體系對(duì)miRNA的檢測(cè)限(Limit of Detection，LOD)。

LOD＝3σ/S (2.3)

其中σ為未加入miRNA前的熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)偏差，S為校正熒光復(fù)蘇曲線斜率。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)本發(fā)明產(chǎn)物原料價(jià)格低廉，容易獲??；

(2)本發(fā)明產(chǎn)物合成方法的反應(yīng)步驟較少，時(shí)間短，合成過(guò)程中溶劑無(wú)需特殊處理；產(chǎn)率達(dá)65％以上；

(3)本發(fā)明所述的多吡啶釕金屬配合物中金屬釕的引入顯著增強(qiáng)了金屬配合物的水溶性，為進(jìn)一步的活性研究提供了前提條件，結(jié)構(gòu)中金屬配合物的配體對(duì)miRNA識(shí)別能力具有較大的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，本發(fā)明所述的多吡啶釕金屬配合物對(duì)胃癌患者外周血中高表達(dá)的miR-185具有良好的檢測(cè)作用。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明所述多吡啶釕金屬配合物的低分辨質(zhì)譜和核磁共振氫譜圖。

圖2是本發(fā)明所述多吡啶釕金屬配合物濃度與熒光標(biāo)記的P-DNA的熒光強(qiáng)度變化曲線圖。

圖3是本發(fā)明所述多吡啶釕金屬配合物形成的復(fù)合體系與miRNA(25nM)在不同時(shí)間的熒光強(qiáng)度變化曲線圖。

圖4是本發(fā)明所述多吡啶釕金屬配合物形成的復(fù)合體系與miRNA在不同濃度的存在下的熒光強(qiáng)度變化曲線圖。

圖5是本發(fā)明所述多吡啶釕金屬配合物對(duì)miR-185特異性識(shí)別作用的結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

1、多吡啶釕金屬配合物的制備

步驟一、將2-氰基噻吩(0.5g，4.58mmol)溶解在體積濃度為95％的乙醇中，加入大大過(guò)量的水合肼(80％)2ml，反應(yīng)24h得到2-噻吩甲酰胺腙。

步驟二、將1,10-鄰菲羅啉-5,6-二酮(0.28g，1.35mmol)加熱溶于無(wú)水乙醇中，再向其中加入2-噻吩甲酰胺腙(0.19g，1.35mmol)，回流2h，反應(yīng)得到黃色沉淀為配體thtp。其結(jié)果如下：ESI-MS：m/z＝315[M+1]⁺。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)：δ9.75(dd,J₁＝1.6,J₂＝2.0Hz,1H),9.63(dd,J₁＝J₂＝1.6Hz,1H),9.42(dd,J₁＝2.0,J₂＝1.6Hz,1H),9.37(dd,J₁＝J₂＝1.6Hz,1H),8.46(dd,J₁＝J₂＝1.2Hz,1H),7.91(m,2H),7.72(dd,J₁＝0.8,J₂＝1.2Hz,1H),7.34(dd,J₁＝3.6,J₂＝4.0Hz,1H)；

步驟三、稱RuCl₃·3H₂O(1.56g，6mmol)，2’,2-聯(lián)吡啶(1.87g，12mmol)，氯化鋰(1.68g，28mmol)溶解于DMF中，氬氣保護(hù)下120℃回流8h。反應(yīng)完全后冷卻至室溫，加入50ml丙酮冷凍過(guò)夜。溶液抽濾，沉淀用冰水洗至滴下來(lái)的水幾乎沒有顏色，得紫黑色固體Ru(bpy)₂Cl₂為前體。

步驟四、將前體(0.20g，0.38mmol)溶于乙醇：水＝3:1(v:v)的混合體系中，加入1.1倍摩爾量的配體thtp(0.13g，0.42mmol)，升溫至90℃反應(yīng)12h，然后冷卻至室溫，旋蒸大部分溶劑，將產(chǎn)物溶于乙腈用中性氧化鋁(200mesh)柱分離即可得到所述橙紅色固體Ru(bpy)₂(thtp)Cl₂(經(jīng)測(cè)算產(chǎn)率：65％)。

2、多吡啶釕金屬配合物的鑒定

通過(guò)下述ESI-MS和核磁共振氫譜分析鑒定，上述步驟所得到的橙紅色固體為本發(fā)明所述的多吡啶釕金屬配合物，其分子式為Ru(bpy)₂(thtp)Cl₂，式中的式中的bpy為2’,2-聯(lián)吡啶，thtp為3-噻吩-1,2,4-三嗪并[5,6-f]1,10-鄰菲咯啉。鑒定結(jié)果如下：

(1)ESI-MS分析理論值:m/z 365([M-2Cl]²⁺)；計(jì)算值:m/z 364.9([M-2Cl]²⁺)。

(2)核磁共振氫譜：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ9.68(dd,J₁＝8.4,J₂＝9.2Hz,2H),8.93(dd,J₁＝8.4,J₂＝8.8Hz,4H),8.53(d,J＝3.6Hz,1H),8.36(d,J＝5.6Hz,1H),8.29(d,J＝5.6Hz,1H),8.24(t,J＝7.6Hz,2H),8.17(d,J＝9.2Hz,2H),8.12(d,J＝6.0Hz,1H),8.09(m,2H),7.83(d,J＝5.2Hz,2H),7.74(m,2H),7.62(t,J＝7.2Hz,2H),7.45(m,1H),7.41(dd,J₁＝8.0,J₂＝8.0Hz,2H)。

實(shí)施例2

本實(shí)施例采用實(shí)施例1中得到的多吡啶釕金屬配合物對(duì)miR-185識(shí)別作用進(jìn)行研究。

本發(fā)明所述的金屬配合物溶解性：在25℃條件下，該金屬配合物可配置成1mM的溶液。

(1)通過(guò)miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)確認(rèn)miR-185的成熟序列，人工合成作為待檢序列，即target miRNA(簡(jiǎn)稱為T)。考慮到RNA相對(duì)的不穩(wěn)定性，我們將T-RNA各自對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)鏈置換成其互補(bǔ)DNA(complementary DNA，cDNA)，并對(duì)cDNA序列利用FAM進(jìn)行熒光標(biāo)記，可得Probe DNA。并利用左邊一個(gè)堿基、中間一個(gè)堿基以及完全不匹配的miRNA作為干擾序列。具體實(shí)驗(yàn)方案與之前的檢測(cè)miR-185相同，僅改變檢測(cè)的miRNA序列。結(jié)果見圖5，T₁，T₂，T₃序列如下，分別的熒光復(fù)蘇R_E值為0.3,0.1,0.08。)考察該金屬配合物能否選擇性識(shí)別miR-185。

miR-185:

Probe DNA序列互補(bǔ)鏈(P-DNA)：5’-TCA GGA ACT GCC TTT CTC TCC A-FAM-3’

Target RNA序列(T)：5’-UGG AGA GAA AGG CAG UUC CUG A-3’

One base pair mutated miR-185(T₁)左邊一個(gè)堿基:

5'-U¹G²A³A⁴G⁵A⁶G⁷A⁸A⁹A¹⁰G¹¹G¹²C¹³A¹⁴G¹⁵U¹⁶U¹⁷C¹⁸C¹⁹U²⁰G²¹A²²-3'

One base pair mutated miR-185(T₂)中間一個(gè)堿基:

5'-U¹G²G³A⁴G⁵A⁶G⁷A⁸A⁹A¹⁰U¹¹G¹²C¹³A¹⁴G¹⁵U¹⁶U¹⁷C¹⁸C¹⁹U²⁰G²¹A²²-3'

Scrambled non-specific RNA(T₃)完全錯(cuò)配:

5'-UAUUGCACUCGUCCCGGCCUCC-3'

(2)本發(fā)明所述多吡啶釕金屬配合物檢測(cè)miR-185

(a)配制金屬配合物水溶液

將金屬配合物溶于蒸餾水中配制成濃度為1mM的溶液并用無(wú)菌過(guò)濾器對(duì)溶液進(jìn)行除菌，密封保存待用。

(b)檢測(cè)的步驟

(I)金屬配合物與probe-DNA結(jié)合熒光淬滅能力

用100μM Tris-HCl緩沖溶液將100μM的P-DNA溶液稀釋成50nM，作為待滴定液；將化合物溶解在100μM Tris-HCl緩沖溶液配成500μM(含50nM P-DNA)的溶液為滴定液。取P-DNA待滴定液2mL于常量熒光比色皿中，將滴定液按體積梯度加入比色皿中，記錄體系熒光強(qiáng)度的變化(激發(fā)波長(zhǎng)＝480nm，發(fā)射波長(zhǎng)＝518nm)直到熒光淬滅達(dá)到飽和。熒光淬滅效率Q_E用公式1.1計(jì)算。

Q_E＝(1-F_M/F₀)×100％ (1.1)

其中F₀為P-DNA初始熒光強(qiáng)度；F_M是加入釕配合物后體系熒光淬滅達(dá)到飽和時(shí)的熒光強(qiáng)度。

配體和金屬離子結(jié)合P-DNA的熒光淬滅實(shí)驗(yàn)采用此方法完成。

(II)復(fù)合體系與miRNA結(jié)合熒光復(fù)蘇能力

復(fù)合體系檢測(cè)時(shí)間確定：在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，將稀釋后的miRNA溶液(10μM)加入到熒光淬滅達(dá)到飽和的復(fù)合體系中，使miRNA在體系中濃度達(dá)到25nM，監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化，確定體系熒光復(fù)蘇檢測(cè)miRNA的最佳時(shí)間。

熒光復(fù)蘇效率的測(cè)定：以復(fù)合體系的檢測(cè)時(shí)間為標(biāo)準(zhǔn)，記錄復(fù)合體系熒光強(qiáng)度隨miRNA濃度增加而復(fù)蘇的程度，直到熒光復(fù)蘇達(dá)到飽和。熒光復(fù)蘇效率R_E用公式1.2計(jì)算。

R_E＝F_T/F_M-1 (1.2)

其中F_T為加入miRNA后復(fù)蘇達(dá)到飽和時(shí)的熒光強(qiáng)度。

檢測(cè)限的計(jì)算：用公式1.3計(jì)算復(fù)合體系對(duì)miRNA的檢測(cè)限(Limit of Detection，LOD)。

LOD＝3σ/S (2.3)

其中σ為未加入miRNA前的熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)偏差，S為校正熒光復(fù)蘇曲線斜率。

(5)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

多吡啶釕金屬配合物對(duì)target miRNA逆轉(zhuǎn)錄的熒光標(biāo)記DNA(P-DNA)的熒光淬滅能力(見圖2)，形成的復(fù)合體系對(duì)miR-185的檢測(cè)時(shí)間為1min(見圖3)；熒光復(fù)蘇率(R_E)為0.70；檢測(cè)限為0.85nM(見圖4)。該結(jié)果表明本發(fā)明所述的多吡啶釕金屬配合物對(duì)胃癌病人外周血中過(guò)表達(dá)的miR-185具有較好的檢測(cè)作用。