本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種從動(dòng)物組織得到的蛋白以及在生物制藥中的用途。

背景技術(shù)：
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生物分子的氧化是一個(gè)自由基介導(dǎo)的過程，它對(duì)食品和生物系統(tǒng)會(huì)造成許多不利的影響。在好氧器官內(nèi)，與動(dòng)脈硬化、癌癥等多種疾病相關(guān)的游離自由基不可避免的隨著氧代謝的過程而產(chǎn)生。另外，氧化應(yīng)激被認(rèn)為與多種疾病例如老年癡呆癥、帕金森氏癥，這此病理系引發(fā)于糖尿病、由糖尿病引起的并發(fā)癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥引發(fā)的神經(jīng)退行性變有關(guān)(Food Chemistry,2008,107,1485–1493)。在食品中，營養(yǎng)成分的氧化會(huì)產(chǎn)生過氧化物，其不僅會(huì)影響食品營養(yǎng)價(jià)值，造成食品品質(zhì)的下降，嚴(yán)重的甚至還會(huì)導(dǎo)致攝入者的身體疾病(Journal of Food Science,1999,64,1000–1004)。因此尋找安全的抗氧化劑以抑制過氧化物產(chǎn)生一直是生化營養(yǎng)學(xué)的研究熱點(diǎn)。由于BHT、BHA和沒食子酸丙酯等化學(xué)合成抗氧化劑比天然抗氧化劑具有更好的效果和更便宜的價(jià)格，因此被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)中，但是，目前有研究發(fā)現(xiàn)合成抗氧化劑對(duì)人體肝、脾、肺等器官有積蓄性致癌左右，從而引起了人們對(duì)其安全性的擔(dān)憂，并且開始慢慢限制起在食品中的使用，于是讓人們把目光轉(zhuǎn)向天然的抗氧化劑(Food Processing,1993,12,54–56)。α-生育酚是一種普遍適用的天然抗氧化劑，它能有效保持食品中油脂的穩(wěn)定性，但卻不利于食品保存。因此有必要尋找其他來源的天然抗氧化劑。

由于兩棲動(dòng)物居住環(huán)境的特殊性，他們有時(shí)會(huì)受到自由氧等損害，這些活性自由氧能通過氧化脂肪、變性蛋白、破壞核酸，導(dǎo)致對(duì)代謝的嚴(yán)重后果和對(duì)組織和細(xì)胞的大量破壞。為了抵消這種氧化損害生存下來，兩棲動(dòng)物已經(jīng)進(jìn)化形成了抗氧化防御系統(tǒng)，抗氧化多肽是其中的一類重要組分。目前，從R.pleuraden、R.catesbeiana、O.livida等物種中鑒定了是十幾中具有抗氧化活性的多肽(Chem Rev.2015,115(4):1760-1846)。因此，兩棲動(dòng)物皮膚是天然抗氧化多肽的重要來源。能作為藥物遞呈的載體的凝集素已經(jīng)被研究了幾十年，很少從兩棲動(dòng)物皮膚中被鑒定，但是具有海藻糖結(jié)合活性的odorranalectin已經(jīng)從O.grahami皮膚中被鑒定(PLoS One.2008,3(6):e2381)，意味著兩棲動(dòng)物皮膚也是凝集素的重要來源。

中國博大的多物種天然生物資源是結(jié)構(gòu)多樣性小分子有機(jī)化合物的重要來源，其中一些生物活性物質(zhì)早已被中醫(yī)記載和采用。很多兩棲類動(dòng)物作為中國傳統(tǒng)中藥和民族藥物而廣泛應(yīng)用，如，花姬蛙(Microhyla pulchra)是傳統(tǒng)中藥材，其成體被白酒內(nèi)浸泡或加酒搗敷后能用于治療骨折、腰痛、風(fēng)濕痹痛、體弱無力、跌打損傷、瘡癰潰后化膿和久不封口等多種病癥。但是由于花姬蛙個(gè)體小和捕捉困難，目前對(duì)其皮膚藥理活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能研究在世界范圍內(nèi)還未見報(bào)道，其作為中藥療效的物質(zhì)基礎(chǔ)仍不為人們所知。

進(jìn)入21世紀(jì)以來，基因組學(xué)的飛速發(fā)展及合成生物學(xué)的興起大大促進(jìn)了天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)與功能研究；本發(fā)明利用基因組學(xué)方法和藥理學(xué)研究獲得花姬蛙抗氧化肽編碼基因，發(fā)明人將本發(fā)明的花姬蛙抗氧化肽編碼基因經(jīng)基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同基因。發(fā)明人將本發(fā)明的花姬蛙抗氧化肽全序列結(jié)構(gòu)經(jīng)蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索比較未發(fā)現(xiàn)有任何相同的多肽。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的是基于上述技術(shù)背景，針對(duì)天然抗氧化劑的不足和人工合成抗氧化劑的安全性問題，提供一種新的具有抗氧化和紅細(xì)胞凝集活性的花姬蛙抗氧化肽及其基因和它在制備抗氧化功效的藥物和食品添加劑中的應(yīng)用。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種花姬蛙抗氧化肽，所述花姬蛙抗氧化肽的序列如SEQ ID No.1所示。

KTCVYLPLPICS SEQ ID NO.1

一種花姬蛙抗氧化肽，所述的花姬蛙抗氧化肽是由12個(gè)氨基酸組成的多肽，分子量1334.91道爾頓，等電點(diǎn)8.002，其氨基酸序列為：Lys Thr Cys Val Tyr Leu Pro Leu Pro Ile Cys Ser(KTCVYLPLPICS)(SEQ ID NO.1)，上述多肽的第三位半胱氨酸和第十一位半胱氨酸形成分子內(nèi)二硫鍵。

所述花姬蛙抗氧化肽的編碼基因由225個(gè)核苷酸組成，自5’端至3’端序列為其序列為(SEQ ID NO.4)：

SEQ ID NO.4

序列中第187-222位核苷酸編碼具有功能的成熟花姬蛙抗氧化肽。

一種編碼上述的花姬蛙抗氧化肽的核苷酸。

所述花姬蛙抗氧化肽可在制備抗氧化功效的藥物和食品添加劑中的應(yīng)用。

所述花姬蛙抗氧化肽在制備在制備清除自由基藥物或美容用品中的用途。

所述花姬蛙抗氧化肽在制備預(yù)防或治療與胃炎或胰腺炎的藥物中的用途，優(yōu)選，所述胃炎或胰腺炎為炎癥相關(guān)的胃炎或炎癥相關(guān)的胰腺炎。

所述花姬蛙抗氧化肽在制備靶向藥物載體中的用途。

所述花姬蛙在制備治療神經(jīng)退行性疾病的藥物的用途，優(yōu)選神經(jīng)退行性疾病為治療帕金森病。

本發(fā)明的有益效果在于:

由花姬蛙抗氧化肽編碼基因推導(dǎo)其氨基酸結(jié)構(gòu)，合成的花姬蛙抗氧化肽具有顯著的紅細(xì)胞凝集和抗氧化作用。該花姬蛙抗氧化肽具有結(jié)構(gòu)簡單、人工合成方便、毒性低的有益特點(diǎn)。

附圖說明：

圖1為本發(fā)明花姬蛙抗氧化肽HPLC純化鑒定結(jié)果；

圖2為本發(fā)明花姬蛙抗氧化肽質(zhì)譜鑒定結(jié)果；

圖3為本發(fā)明花姬蛙抗氧化肽清除DPPH和ABTS自由基“量-效”關(guān)系曲線；

圖4為本發(fā)明花姬蛙抗氧化肽凝集紅細(xì)胞結(jié)果。

具體實(shí)施方式：

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明：

本發(fā)明的花姬蛙抗氧化肽，所述的花姬蛙抗氧化肽由12個(gè)氨基酸組成的環(huán)肽，分子量1334.91道爾頓，等電點(diǎn)8.002，其氨基酸序列為：Lys Thr Cys Val Tyr Leu Pro Leu Pro Ile Cys Ser(KTCVYLPLPICS)(SEQ ID NO.1)，上述多肽的其第三位半胱氨酸和第十一位半胱氨酸形成分子內(nèi)二硫鍵。

所述花姬蛙抗氧化肽的基因序列SEQ ID NO.4的第187-222位核苷酸編碼。本發(fā)明的花姬蛙抗氧化肽及其基因的制備過程包括如下步驟：

實(shí)施例1，花姬蛙抗氧化肽基因克?。?/p>

I、花姬蛙皮膚總RNA提?。夯铙w花姬蛙用水清洗干凈，放入液氮中速凍4h，取皮膚組織，稱重，取300mg皮膚組織，加入10m1總RNA提取緩沖液(Trizol溶液，美國GIBCOBRL公司產(chǎn)品)，于20m1玻璃勻漿器中勻漿30min。加入等體積酚/氯仿溶液，劇烈混勻，室溫放置10min，4℃，12000rpm離心10min，棄除沉淀。向上清中加入等體積的異丙醇，室溫放置10min，4℃，12000rpm離心10min，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底的沉淀物即為花姬蛙皮膚總RNA。

II、花姬蛙皮膚mRNA的純化：花姬蛙皮膚mRNA分離純化采用美國PROMEGA公司的 mRNA Isolation Systems試劑盒。具體如下：取花姬蛙皮膚總RNA 500μg溶于500μl DEPC水中，放入65℃水浴10min，加人3μl Oligo(dT)探針和13μl 20×SSC溶液，混勻，放置室溫冷卻，稱為A液。將磁珠輕彈混勻，至磁力架吸附30S，棄上清，加0.5×SSC 0.3m1，至磁力架吸附30S，最后加0.1ml 0.5×SSC懸浮，稱之為B液。將A液加入B液中，室溫放置10分鐘，至磁力架吸附30sec，棄上清，用0.1×SSC洗滌4次，最后棄上清，加0.L ml DEPC水懸浮，至磁力架上吸附30sec，將上清移至新的試管，再加入0.15m1DEPC水重新懸浮，至磁力架吸附30S，移上清至上述試管，則上清中為純化的花姬蛙皮膚mRNA。加入1/10體積3M乙酸鈉，pH5.2，等體積異丙醇，于-70℃放置30分鐘，4℃，12000rpm離心10min，棄上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中得到花姬蛙皮膚mRNA。

III、花姬蛙皮膚cDNA文庫構(gòu)建：采用CLONTECH公司Creator^TM SMART^TM cDNA Library Construction Kit質(zhì)粒cDNA文庫構(gòu)建試劑盒。

A.cDNA第一鏈合成(mRNA反轉(zhuǎn)錄)：在0.5ml無菌的離心管加入1μl花姬蛙皮膚mRNA、1μl SMART IV寡聚核苷酸、1μl CDS III/3’PCR引物，加2μl去離子水使總體積達(dá)到5μl?；靹螂x心管中的試劑并以12000rpm離心15sec，72℃保溫2min。將離心管在冰上孵育2min。在離心管中加入以下試劑2.0μl 5×第一鏈緩沖、1.0μl 20mM二硫蘇糖醇、1.0μl 10mM dNTP混合物、1.0μl PowerScript反轉(zhuǎn)錄酶?；旌想x心管中試劑并以12000rpm離心15sec，在42℃保溫1h。將離心管置于冰上中止第一鏈的合成。從離心管取2μl所合成的cDNA第一鏈備用。

B.采用長末端聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LD-PCR)方法擴(kuò)增第二鏈：95℃預(yù)熱PCR儀。將2μl cDNA第一鏈(mRNA反轉(zhuǎn)錄)、80μl去離子水、10μl 10×Advantage 2PCR緩沖、2μl 50×dNTP混合物、2μl 5’PCR引物、2μl CDS III/3’PCR引物以及2μl大腸桿菌聚合酶離心管進(jìn)行反應(yīng)。在PCR儀中按以下程序擴(kuò)增：95℃20sec，95℃5sec，68℃6min，22個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后，將離心管中合成的cDNA雙鏈進(jìn)行抽提。

C.PCR產(chǎn)物用PROMEGA公司的 SV Gel and PCR Clean-Up System試劑盒進(jìn)行抽提回收，步驟如下：將通過PCR得到的cDNA雙鏈加入等體積的膜結(jié)合緩沖顛倒混勻，然后將混和液轉(zhuǎn)入離心純化柱，室溫靜置5分鐘，使DNA充分與硅膠膜結(jié)合。以12000rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液。加入700μl的洗脫液(含乙醇)于離心純化柱中，以12000rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液。重復(fù)步驟上述步驟。12000rpm離心5min。將離心純化柱置于新的離心管中。加入30μl超純水，在室溫下靜置5min。以12000rpm離心30sec，管底溶液即為所純化過的cDNA雙鏈。

D.酶切、連接以及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化：在微量離心管中加入1μl Takara pMD18-T載體、4μl花姬蛙cDNA雙鏈溶液，全量為5μl。加入5μl的連接酶緩沖混合物。16℃反應(yīng)2h。全量(10μl)加入至100μl DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30min。42℃加熱90Sec后，再在冰中放置1分鐘。加入37℃孵育過的LB培養(yǎng)基890μl，37℃緩慢振蕩培養(yǎng)60min。取200μl涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)16h，形成單菌落。每個(gè)LB平皿用5m1LB液體培養(yǎng)基洗滌菌落，加30％甘油凍存。構(gòu)建的cDNA大約含1×10⁶個(gè)單獨(dú)克隆。

Ⅳ、花姬蛙抗氧化肽基因克隆篩選：擴(kuò)增引物長度為25個(gè)核苷酸，其序列為5’ATGTTCACCTTGAAGACATC CCTG 3’(SEQ ID NO.2)，PCR另一擴(kuò)增引物為CLONTECH公司SMART^TMcDNA Library Construction Kit中的3’PCR Primer引物，其序列為5’ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3’(SEQ ID NO.3)。PCR反應(yīng)在如下條件下進(jìn)行：94℃30sec，50℃45sec和72℃2.5min，35個(gè)循環(huán)。

首先滴定構(gòu)建的細(xì)菌cDNA文庫，然后用含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)?shù)募?xì)菌濃度(大約5000個(gè)細(xì)菌/毫升和30個(gè)細(xì)菌/毫升分別用于首輪篩選第二輪篩選)，在96孔培養(yǎng)板上按8×8矩陣鋪板(共64孔，每孔100μ1),37℃過夜培養(yǎng)。按行、列分別合并細(xì)菌培養(yǎng)液，有16個(gè)樣品進(jìn)行PCR鑒定，交叉陽性孔細(xì)菌樣品進(jìn)入第二輪篩選。

Ⅴ、花姬蛙抗氧化肽基因序列測定和結(jié)果：提取質(zhì)粒DNA用雙脫氧法測定核苷酸序列，使用儀器為美國Applied Biosystems 373A全自動(dòng)核苷酸序列測定儀，測序引物為BcaBESTTM Sequencing Primer RV-M和BcaBESTTM Sequencing Primer M13-47，BcaBESTTM Sequencing Primer RV-M序列：5`GAGCGGATAACAATTTCACACAGG 3’(SEQ ID NO.5)，BcaBESTTM Sequencing Primer M13-47：5’CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3’(SEQ ID NO.6)?；驕y序結(jié)果自5’端至3’端序列為(SEQ ID NO.4):

花姬蛙抗氧化肽基因核苷酸的序列表為：序列長度為225個(gè)堿基；序列類型：核酸；鏈數(shù)：單鏈；拓?fù)鋵W(xué)：直鏈狀；序列種類：cDNA；來源：花姬蛙皮膚。

根據(jù)花姬蛙抗氧化肽的基因推斷編碼由功能的成熟活分泌肽為第133-261位核苷酸，氨基酸序列為：KTCVYLPLPICS(見序列SEQ ID NO.1)

實(shí)施例2，花姬蛙抗氧化肽的制備：

Ⅰ、花姬蛙抗氧化肽的制備方法：根據(jù)花姬蛙抗氧化肽的基因推斷編碼由功能的成熟活分泌肽氨基酸序列后用自動(dòng)多肽合成儀合成多肽。二硫鍵的形成采用空氣氧化法，具體為在燒瓶中將多肽溶解按照0.1mg/ml于0.1％醋酸溶液中后用氫氧化銨滴定成pH 7.8,然后室溫?cái)嚢柽^夜。通過HPLC反相C18柱層析脫鹽、純化。純化時(shí)A液體為0.05％TFA+2％CH₃CN，B液為0.05％TFA+90％CH₃CN，B液梯度為20min內(nèi)30-50％，檢測波長為220nm，多肽出現(xiàn)在12.962分鐘。

Ⅱ、分子量測定采用快原子轟擊質(zhì)譜法(Fast atom bombardment mass spectrometry,FAB-MS)，以甘油:間硝基芐醇:二甲亞砜(1:1:l，V:V:V，體積比)為底物，Cs+作為轟擊粒子，電流為1μA，發(fā)射電壓為25Kv。

Ⅲ、純化的花姬蛙抗氧化肽用高效液相色譜(HPLC)方法鑒定其純度，等電聚焦電泳測定等電點(diǎn)，用自動(dòng)氨基酸測序儀測定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。

花姬蛙抗氧化肽是中國兩棲類動(dòng)物花姬蛙抗氧化肽基因編碼的含12個(gè)氨基酸的環(huán)肽，分子量1334.91道爾頓，等電點(diǎn)8.002，其氨基酸序列為：Lys Thr Cys Val Tyr Leu Pro Leu Pro Ile Cys Ser(KTCVYLPLPICS)(SEQ ID NO.1)，上述多肽的其第三位半胱氨酸和第十一位半胱氨酸形成分子內(nèi)二硫鍵。

實(shí)施例3，花姬蛙抗氧化肽的活性實(shí)驗(yàn)

Ⅰ、抗氧化能力測定

1)DPPH自由基清除能力的測定

利用DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl)自由基清除率測定法研究抗氧化多肽。配制濃度為1×10-5mol/L的DPPH乙醇溶液，避光保存。將2ml，0.1mM的DPPH無水乙醇溶液加入到含有2ml不同酶解樣品的潔凈試管中，混勻。室溫下放置30min后，于517nm處測定吸光度，吸光值越小，表明自由基清除能力越強(qiáng)。

清除率(％)＝【1-(A_i-A_j)/A₀】*100％

式中，A₀為2ml，0.1mM的DPPH無水乙醇溶液+2ml的樣品試劑，空白對(duì)照，A_i為2ml,0.1mM的DPPH無水乙醇溶液+2ml的樣品，A_j為2ml的無水乙醇+2ml的樣品。

2)ABTS自由基清除活性的測定

以去離子水將ABTS溶解，使ABTS濃度達(dá)到7mmol/L，加入過硫酸鉀，使過硫酸鉀的濃度為2.45nmol/L。之后將該溶液在室溫下置于暗處過夜12～16h。將生成的ABTS自由基溶液用磷酸緩沖液(PBS，0.2mol/L，pH 7.4)稀釋，使其在734nm下的吸光值為0.70。取0.1ml酶解液與2.9ml ABTS自由基液混合，搖勻30秒鐘，暗處反應(yīng)10分鐘，然后在734nm下測定反應(yīng)液的吸光值。以蒸餾水代替水解液作空白。

清除率(％)＝(A_i-A_j)/A₀*100％

式中，A₀為2.9ml ABTS試劑與0.1ml蒸餾水混合液的吸光值，A_j為2.9ml ABTS+0.1ml的酶解液混合液的吸光值。

自由基氧化在老年癡呆癥、帕金森氏癥、糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥引發(fā)的神經(jīng)退行性疾病中有重要作用?；芸寡趸哪芎芎玫那宄杂苫苷f明其能應(yīng)用于自由基氧化導(dǎo)致的相關(guān)疾病的治療。另外，為了防止自由基對(duì)皮膚造成的損害，在美容護(hù)膚品中添加自由基清除劑必不可少。因此，花姬蛙抗氧化肽也可以應(yīng)用于美容護(hù)膚品中。

Ⅱ、紅細(xì)胞凝集活性

在96孔血凝板中，初始濃度為3mg/ml的花姬蛙抗氧化肽用25μl PBS倍比稀釋，室溫靜置5-10min，加入75μl 1％雞紅細(xì)胞懸液，在4℃靜置1h，陽性對(duì)照每孔加入75μg/ml odorranalectin，陰性對(duì)照孔加入等體積的PBS，觀察血凝結(jié)果如圖4所示，花姬蛙抗氧化肽能凝集紅細(xì)胞，凝集常數(shù)為11.7μg/ml?；芸寡趸木哂心貥踊钚裕軌蚰t細(xì)。凝集素通常能特異性識(shí)別哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面的糖基序?qū)⑺幬镞f呈到特定的靶點(diǎn)促進(jìn)藥效，因此其能作為藥物的載體使用。Odorranalectin納米顆粒對(duì)帕金森病的治療有很好的促進(jìn)作用。因而從凝集紅細(xì)胞功能的角度看，花姬蛙抗氧化肽對(duì)治療帕金森病等神經(jīng)退行性疾病的治療有很好的促進(jìn)作用。