本發(fā)明涉及一株卷曲乳桿菌菌株，具體說(shuō)是一株分離自SPF雞嗉囊的分泌植酸酶的卷曲乳桿菌菌株及其應(yīng)用。屬于功能性益生菌及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

近年來(lái)我國(guó)畜牧業(yè)發(fā)展迅速，抗生素濫用現(xiàn)象普遍，食用動(dòng)物的抗生素濫用容易導(dǎo)致抗生素在動(dòng)物體內(nèi)積累，產(chǎn)生抗藥性細(xì)菌，嚴(yán)重威脅人類健康。目前，歐盟等國(guó)家已嚴(yán)格限制甚至禁止抗生素作為促生長(zhǎng)劑的使用，推動(dòng)動(dòng)物使用益生菌解決這些問(wèn)題。傳統(tǒng)意義的益生菌往往功能泛泛，沒(méi)有明確和顯著的效果。

植酸即肌醇六磷酸，是谷物、豆類等作物中磷的主要貯存形式，但單胃動(dòng)物和人缺乏分解植酸的酶而難以利用該種形式的磷。為了滿足正常生長(zhǎng)、代謝的需要，需要在動(dòng)物飼料中添加無(wú)機(jī)磷如磷酸氫鈣，不僅造成了磷資源的浪費(fèi)，不能消化吸收的隨動(dòng)物糞便排出體外的植酸容易造成環(huán)境污染；同時(shí)，植酸在動(dòng)物胃腸道消化吸收過(guò)程中會(huì)與多種金屬離子如Zn²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺及蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)因子螯合成不容性復(fù)合物，降低了營(yíng)養(yǎng)因子的利用率，被稱為是抗?fàn)I養(yǎng)因子。由于磷礦石資源有限，相關(guān)原輔材料漲價(jià)以及環(huán)保要求的提高，磷酸氫鈣的生產(chǎn)成本大大提高。植酸酶即肌醇六磷酸酶，可以將植酸分解為肌醇和無(wú)機(jī)磷，可以增加磷的利用率，降低磷污染并解除植酸的抗?fàn)I養(yǎng)作用。

在單胃動(dòng)物的飼料中添加植酸酶的效果已經(jīng)被證實(shí)，植酸酶成為一種取代磷酸氫鈣的新型飼料添加劑，然而植酸酶在天然植物中含量較低，提取成本昂貴；構(gòu)建畢赤酵母工程菌株，發(fā)酵生產(chǎn)、提取運(yùn)輸和使用也成本高，污染和浪費(fèi)嚴(yán)重，并且該酶的生物學(xué)特性如熱穩(wěn)定性、抗蛋白酶特性低，無(wú)法抵抗顆粒飼料加工過(guò)程的高溫高壓，對(duì)貯藏條件有較高要求。

禽類嗉囊的生理功能是暫時(shí)儲(chǔ)存和軟化食物，以利于禽類對(duì)食物充分消化和吸收。嗉囊是良好的內(nèi)源益生菌棲息場(chǎng)所，定殖著大量益生菌，分子生態(tài)學(xué)分析表明乳桿菌科細(xì)菌在嗉囊粘膜樣品中占99.74％，在嗉囊和盲腸內(nèi)容物中分別占62.75％和3.09％，而在糞便中則占23.51％，其中唾液乳桿菌和卷曲乳桿菌最為普遍，對(duì)于維持動(dòng)物腸道微生態(tài)平衡具有重要作用。

如果能從嗉囊中分離到產(chǎn)植酸酶益生菌，在嗉囊中天然定殖，大量、持續(xù)、原位發(fā)酵，可以直接降解植酸，釋放無(wú)機(jī)磷，克服體外表達(dá)植酸酶的一些不足。作為新型的微生態(tài)添加劑，將從根本上改觀飼料酶的格局，節(jié)約成本，減少污染和浪費(fèi)，是飼料行業(yè)的福音。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一株新的分泌植酸酶的卷曲乳桿菌菌株，該菌株分離自無(wú)特定病原(簡(jiǎn)稱SPF)雞嗉囊，具有產(chǎn)植酸酶的特性，可以用于研制開(kāi)發(fā)動(dòng)物用益生菌制劑。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明卷曲乳桿菌菌株，分離自SPF雞嗉囊內(nèi)容物，經(jīng)MRS固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，分離純化后獲得一株卷曲乳桿菌菌株(Lactobacillus crispatus)MSY，于2016年9月2日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCC No.12928。

本發(fā)明通過(guò)以下方法從SPF雞嗉囊內(nèi)容物中分離得到上述卷曲乳桿菌菌株：將無(wú)菌蒸餾水稀釋的取自SPF雞的嗉囊內(nèi)容物在MRS固體培養(yǎng)基上劃線，挑取特征明顯的菌落反復(fù)劃線分離，直至分離出形態(tài)、大小一致的菌落，進(jìn)行革蘭氏染色，對(duì)菌體形態(tài)進(jìn)行顯微觀察。反復(fù)接種純化后獲得。

該菌株在MRS平板上的菌落為白色，邊緣不整齊，片狀，中央凸起半球形，革蘭氏染色觀察，該菌株為典型革蘭氏陽(yáng)性，染色較深，顯微鏡下呈細(xì)長(zhǎng)桿狀，微彎成鏈出現(xiàn)，無(wú)鞭毛，無(wú)芽孢。在MRS液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，呈均勻渾濁生長(zhǎng)，12小時(shí)在試管底部出現(xiàn)白色沉淀。最適生長(zhǎng)溫度為37℃。

經(jīng)16s rDNA序列分析法對(duì)菌種進(jìn)行鑒定，本發(fā)明所分離得到的卷曲乳桿菌菌株MSY的分類地位屬于：乳桿菌屬卷曲乳桿菌(Lactobacillus crispatus)。

本發(fā)明分離獲得的MSY菌株可以分泌植酸酶，植酸酶活性約為0.21U/ml。能夠抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，表明本發(fā)明菌株MSY可以用于制備抗菌劑。該菌株在pH＝3.0的培養(yǎng)液中仍有一定的生長(zhǎng)，具有較強(qiáng)的抗酸能力，還具有一定的耐膽鹽能力。MSY菌劑飼喂動(dòng)物，能提高鈣磷利用率，改善生產(chǎn)性能、腸道微生態(tài)平衡。

本發(fā)明具有如下有益效果：

(1)本發(fā)明MSY菌株，經(jīng)16s rDNA序列分析法鑒定為卷曲乳桿菌(Lactobacillus crispatus)，該菌株能夠分泌植酸酶，植酸酶活性約為0.21U/ml。為首次分離得到的能夠分泌植酸酶的卷曲乳桿菌。

(2)本發(fā)明MSY菌株是嗉囊優(yōu)勢(shì)定殖菌株，具有耐酸、耐膽鹽特性。通過(guò)牛津杯法體外抑菌試驗(yàn)表明，該菌株對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌及革蘭氏陽(yáng)性菌均具有較強(qiáng)的抑菌作用，呈現(xiàn)廣譜抗菌效果，該菌株可以用于研制開(kāi)發(fā)動(dòng)物用益生菌制劑。

(3)本發(fā)明MSY菌株可以用于調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道菌群，將該菌劑飼喂動(dòng)物(包括雞、鴨、豬等單胃動(dòng)物)具有促進(jìn)生長(zhǎng)作用，可以保持動(dòng)物腸道內(nèi)微生態(tài)平衡。提高動(dòng)物對(duì)飼料中鈣磷的吸收率，降低日糧中的鈣磷添加量和減少動(dòng)物糞便中鈣磷排放量，保護(hù)生態(tài)環(huán)境。

(4)本發(fā)明MSY菌株與產(chǎn)植酸酶的工程菌株和飼喂芽孢桿菌相比，作為飼料添加劑飼喂雛雞有很好優(yōu)勢(shì)：其本身是嗉囊優(yōu)勢(shì)定殖菌株，原位發(fā)酵，不需要工廠的各種成本；一次飼喂定殖后，可以源源不斷增殖和分泌植酸酶，不需要持續(xù)地從飼料添加；天然優(yōu)勢(shì)菌株，安全方便。

植酸酶作為一種優(yōu)良的食品和飼料添加劑，受到越來(lái)越多的重視。由于天然來(lái)源的植酸酶或者提取困難，或者分泌量太低，或者成本太高，難以滿足生產(chǎn)需要。目前一般通過(guò)構(gòu)建能高效表達(dá)植酸酶的菌株——如，畢赤酵母植酸酶工程菌來(lái)生產(chǎn)植酸酶。然而在利用該工程菌來(lái)發(fā)酵生產(chǎn)、提取運(yùn)輸和使用過(guò)程中也存在成本高，污染和浪費(fèi)嚴(yán)重的問(wèn)題。并且該酶的生物學(xué)特性如熱穩(wěn)定性、抗蛋白酶特性低，無(wú)法抵抗顆粒飼料加工過(guò)程的高溫高壓，對(duì)貯藏條件有較高要求。而飼喂產(chǎn)植酸酶的芽孢桿菌的方法，同樣存在需要持續(xù)不斷往飼料中添加芽孢桿菌才能滿足動(dòng)物需要的問(wèn)題。由此，通過(guò)比較可以看出，本發(fā)明MSY菌株具有顯而易見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明卷曲乳桿菌(Lactobacillus crispatus)MSY革蘭氏染色圖。

圖2為本發(fā)明卷曲乳桿菌(Lactobacillus crispatus)MSY抗病原菌試驗(yàn)結(jié)果；

其中，A為MSY抑制大腸桿菌(Escherichia coli ATCC 25922)生長(zhǎng)結(jié)果；

B為MSY抑制金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 25913)生長(zhǎng)結(jié)果。

圖3為本發(fā)明卷曲乳桿菌(Lactobacillus crispatus)MSY耐酸試驗(yàn)結(jié)果；

圖4為本發(fā)明卷曲乳桿菌(Lactobacillus crispatus)MSY的16s rDNA基因V3區(qū)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體試驗(yàn)方法和附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案及其所產(chǎn)生的技術(shù)效果進(jìn)行進(jìn)一步的闡述，下述說(shuō)明僅是為了解釋本發(fā)明，但不以任何方式對(duì)本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明中所使用的方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為本領(lǐng)域常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1：SPF雞嗉囊中乳酸菌的分離

試驗(yàn)材料：

SPF雞：無(wú)特定病原雞(SPF)，中國(guó)山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽所SPF研究中心。

培養(yǎng)基的配制：

MRS固體培養(yǎng)基：為一種培養(yǎng)乳酸菌所用的選擇性培養(yǎng)基，每L含蛋白胨10.0g，牛肉粉5.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖20.0g，硫酸鎂0.1g，醋酸鈉5.0g，檸檬酸三銨2.0g，磷酸氫二鉀2.0g，硫酸錳0.05g，吐溫1.0g，瓊脂15g。

試驗(yàn)方法：

(1)樣品的采集

宰殺120日齡SPF雞，無(wú)菌打開(kāi)雞的嗉囊,用無(wú)菌手術(shù)刀取雞嗉囊內(nèi)容物放入無(wú)菌的離心管中，用無(wú)菌生理鹽水稀釋。

(2)雞嗉囊中乳酸菌的分離培養(yǎng)

從無(wú)菌生理鹽水稀釋液中取3～4接種環(huán)，分別劃線于MRS固體選擇培養(yǎng)基上，然后置于37℃燭缸中培養(yǎng)12～24h后，分別挑取特征明顯的菌落反復(fù)劃線分離，直至分離出形態(tài)、大小一致的菌落，將所分離菌株進(jìn)行革蘭氏染色，對(duì)菌體形態(tài)進(jìn)行顯微觀察。所得菌株命名為MSY。

試驗(yàn)結(jié)果：在MRS平板上的菌落為白色，邊緣不整齊，片狀，中央凸起半球形，革蘭氏染色觀察，該菌株為典型革蘭氏陽(yáng)性，染色較深，顯微鏡下呈細(xì)長(zhǎng)桿狀，微彎成鏈出現(xiàn)，無(wú)鞭毛，無(wú)芽孢，結(jié)果見(jiàn)圖1。

實(shí)施例2：產(chǎn)植酸酶菌株的篩選

試驗(yàn)材料：

植酸鈉：購(gòu)自Sigma公司。

培養(yǎng)基配制：

MRS液體培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基為一種培養(yǎng)乳酸菌所用的培養(yǎng)基，每L含蛋白胨10.0g，牛肉粉10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，硫酸鎂0.1g，醋酸鈉5.0g，檸檬酸銨2.0g，磷酸氫二鉀2.0g，硫酸錳0.05g，吐溫1.0g。

試驗(yàn)方法：

(1)菌株培養(yǎng)

將實(shí)施例1分離得到的菌株按MRS液體培養(yǎng)基體積的10％的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48h。

(2)測(cè)定胞外分泌的植酸酶酶活

采用以分光光度法測(cè)定植酸酶活性，其基本原理是植酸酶在一定溫度和pH條件下，水解底物植酸鈉，生成正磷酸和肌醇衍生物，在酸性溶液中，用釩鉬酸銨處理會(huì)生成黃色的[(NH4)₃PO₄NH₄VO₃·16MoO₃]復(fù)合物，在波長(zhǎng)415nm下進(jìn)行比色測(cè)定。

收集MSY菌株的菌液，離心取200μL上清，與2mL植酸酶專一性底物植酸鈉(pH5.0，乙酸鈉緩沖液配制，終濃度為5.0mM)混勻，于37℃溫浴30min后，用2mL釩鉬酸銨終止液終止反應(yīng)，于415nm處測(cè)定吸光值，測(cè)定胞外植酸酶酶活。樣品在植酸鈉濃度為5.0mM、溫度為37℃、pH為5.0的條件下，每分鐘從植酸鈉中釋放1μmol無(wú)機(jī)磷，即為一個(gè)植酸酶活力單位，以U表示。

試驗(yàn)結(jié)果：實(shí)施例1分離獲得的MSY菌株可以分泌植酸酶，植酸酶活性約為0.21U/ml。

實(shí)施例3：MSY菌株的生化鑒定

試驗(yàn)材料：

指示菌：大腸桿菌(Escherichia coli ATCC 25922)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus 25913)。

豬膽鹽試劑：購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

培養(yǎng)基配制：

肉湯固體培養(yǎng)基：每L含牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂20g。

試驗(yàn)方法：

(1)MSY菌株的抗病原菌試驗(yàn)：

指示菌菌懸液：取待指示菌大腸桿菌(Escherichia coli ATCC 25922)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 25913)保存液于肉湯固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線(使其出現(xiàn)單菌落為準(zhǔn))，放于37℃恒溫培養(yǎng)16h，挑取0.8mm-1.0mm單菌落于1ml無(wú)菌生理鹽水中，用漩渦振蕩器振蕩1-2min，此時(shí)的菌液濃度約10⁷CFU/ml。

檢測(cè)平板的制備：將肉湯培養(yǎng)基加入瓊脂溶解均勻，高壓滅菌，冷卻到50℃左右，準(zhǔn)確量取20ml該培養(yǎng)基加入內(nèi)徑一致并預(yù)先水平放置的培養(yǎng)皿內(nèi)，凝固后并使培養(yǎng)皿中水份干燥透。

指示菌菌懸液的涂布：取20μl新鮮培養(yǎng)的指示菌大腸桿菌(Escherichia coli ATCC 25922)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 25913)菌懸液(10⁷CFU/ml)在平板上均勻涂布，并用鑷子將無(wú)菌的牛津杯輕輕放入培養(yǎng)皿中，在水平放置的平皿中均勻地放置牛津杯。

④加入MSY菌懸液：在牛津杯中分別加入80μl分離菌株MSY培養(yǎng)液，另一個(gè)牛津杯中加入80μl無(wú)菌的MRS液體培養(yǎng)基作對(duì)照，37℃培養(yǎng)24h。

試驗(yàn)結(jié)果：分離菌株MSY能夠抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)，結(jié)果見(jiàn)圖2。表明本發(fā)明菌株MSY可以用于制備抗菌劑。

(2)菌株的耐酸試驗(yàn)：將分離MSY菌株按MRS液體培養(yǎng)基體積的1％的接種量分別接種于pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和6.5的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，測(cè)定OD_600nm值。

試驗(yàn)結(jié)果：本發(fā)明菌株在pH＝3.0的培養(yǎng)液中仍有一定的生長(zhǎng)，具有較強(qiáng)的抗酸能力，結(jié)果見(jiàn)圖3。

(3)菌株的耐膽鹽試驗(yàn)：將分離MSY菌株按MRS液體培養(yǎng)基體積的1％的接種量接種于豬膽鹽含量分別為0.03％、0.1％、0.2％、0.3％、的MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h后，稀釋10倍，取0.1ml涂MRS固體平板，進(jìn)行活菌平板菌落計(jì)數(shù)。平板計(jì)數(shù)法計(jì)算活菌數(shù)。

試驗(yàn)結(jié)果：本發(fā)明菌株具有一定的耐膽鹽能力結(jié)果見(jiàn)表1。

表1卷曲乳桿菌MSY在不同膽鹽濃度的存活情況

實(shí)施例4：MSY菌株的16S rDNA的種屬鑒定

試驗(yàn)材料：PCR試劑購(gòu)于TaKaRa生物公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(Bacterial DNAKit)購(gòu)于Omega公司；引物合成及測(cè)序由上海生工完成。

試驗(yàn)方法：利用試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，以基因組DNA作為模板，利用細(xì)菌16s rDNA通用引物27F(引物序列：SEQ ID NO.2)和1492R(引物序列：SEQ ID NO.3)，擴(kuò)增長(zhǎng)度為1500bp的16s rDNA可變區(qū)V3區(qū)序列，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生工測(cè)序，所得序列與NCBI的GeneBank中的已知序列進(jìn)行比對(duì)分析。

PCR擴(kuò)增體系為50μL：

PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性45s，57℃退火30s，72℃延伸2min，30個(gè)循環(huán)；最后72℃終延伸10min；4℃保存。

試驗(yàn)結(jié)果：經(jīng)比對(duì)，所得序列與卷曲乳桿菌同源性在99％以上，序列分析結(jié)果表明，本發(fā)明菌株MSY為卷曲乳桿菌。16s rDNA凝膠電泳圖，見(jiàn)圖4；16s rDNA核苷酸如SEQ ID NO.1所示。

實(shí)施例5：MSY菌株的飼喂試驗(yàn)

試驗(yàn)材料：

在大型肉雞場(chǎng)隨機(jī)選擇3棟雞舍，各單獨(dú)飼養(yǎng)肉雞500只，常規(guī)飼養(yǎng)。

飼喂六和肉雞飼料，基礎(chǔ)飼料配方見(jiàn)表2，保留基礎(chǔ)的無(wú)機(jī)鈣磷含量。對(duì)照組1飼喂基礎(chǔ)飼料，對(duì)照組2以基礎(chǔ)飼料添加KDN植酸酶600U/KG，試驗(yàn)組通過(guò)飲水添加MSY菌液10⁷cfu/ml，飼喂基礎(chǔ)飼料。

試驗(yàn)方法：

(1)生產(chǎn)性能試驗(yàn)：飼喂周期為6周，早晚各喂一次料，自由采食和飲水；每天觀察雞的精神狀態(tài)、糞便情況，42日齡時(shí)，統(tǒng)計(jì)死亡雞數(shù)量，計(jì)算成活率；統(tǒng)計(jì)三組各自飼料總消耗量和總體重，計(jì)算料重比。

試驗(yàn)結(jié)果：對(duì)照組1、2成活率為97.5％、96.8％，料重比為2.04:1、2.03:1；試驗(yàn)組成活率為97.3％，料重比為2.03:1。表明接種MSY對(duì)肉雞性能的影響方面，可以達(dá)到直接添加植酸酶的生產(chǎn)效果，見(jiàn)表3。

表2基礎(chǔ)飼料配方和營(yíng)養(yǎng)水平、鈣磷含量

營(yíng)養(yǎng)水平

表3肉雞生產(chǎn)性能

(2)鈣磷代謝試驗(yàn)：

分別于7、14、21日齡采集糞樣，用EDTA絡(luò)合法測(cè)定糞排放鈣含量；用鉬酸銨法測(cè)定磷的含量。

①樣品的分解：稱取2～5g樣品(準(zhǔn)確至0.0002g),在電爐上低溫炭化至無(wú)煙為止。再將其放入高溫爐于(550±20℃)下灼燒3h。在盛有灰分的坩堝中加入1:3鹽酸溶液10mL和濃硝酸數(shù)滴，小心煮沸。將此溶液轉(zhuǎn)入100mL容量瓶，并以熱蒸餾水洗滌坩堝及漏斗中的濾紙，冷卻至室溫后，定容，搖勻，為試樣分解液。

②樣品鈣測(cè)定：準(zhǔn)確分取10～20mL試樣分解液(含鈣2～25mg)于150mL三角瓶中，蒸餾水50mL，10g/L淀粉溶液10mL，三乙醇胺溶液2mL，乙二胺溶液1mL，每加完一種試劑要充分搖勻，然后加孔雀石指示劑1滴，搖勻，滴加200g/L氫氧化鉀溶液至無(wú)色，再加氫氧化鉀溶液2mL，加入0.1g鹽酸羥胺，搖勻溶解后，加鈣黃指示劑少許，使顏色呈墨綠色，在黑色背景下，立即用0.01mol/L EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至綠色熒光消失，呈紫紅色為滴定終點(diǎn)。同時(shí)做試劑空白試驗(yàn)。

③樣品磷測(cè)定：準(zhǔn)確移取試樣分解液1-10mL(含磷量50-70μg)于50mL容量瓶中，加釩鉬酸銨顯色試劑10mL，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，放置10min以上。以空白為參比，用10mL比色池在420nm波長(zhǎng)下，用分光光度計(jì)測(cè)定試樣分解液的吸光度。用標(biāo)準(zhǔn)曲線查得試樣分解液的含磷量。

試驗(yàn)結(jié)果：試驗(yàn)組與添加植酸酶的對(duì)照組2相近，無(wú)顯著差異，鈣磷排放較少；與對(duì)照組1差異顯著。

表4肉雞糞排放的鈣磷含量(％)

(3)對(duì)腸道菌群影響試驗(yàn)：

分別于14日齡采集盲腸，用無(wú)菌剪刀剪掉盲腸開(kāi)口端，小心擠出內(nèi)容物到離心管，用無(wú)菌生理鹽水連續(xù)進(jìn)行10倍稀釋至10-8，選擇合適范圍稀釋度，用表5培養(yǎng)基培養(yǎng)，菌落計(jì)數(shù)。

試驗(yàn)結(jié)果：三組絕大多數(shù)菌株差異顯著，試驗(yàn)組需氧菌、腸桿菌、腸球菌與添加植酸酶對(duì)照組相近，與對(duì)照組1差異顯著；乳酸桿菌、雙歧桿菌、類桿菌、總厭氧菌的含量依次為試驗(yàn)組、對(duì)照組2(植酸酶)、對(duì)照組1(空白)，且差異顯著。

表5盲腸菌群測(cè)定培養(yǎng)基

表6 MSY對(duì)14日齡肉雞盲腸菌群影響(lgcfu/g糞便)

綜上研究結(jié)果表明：接種少量MSY達(dá)到了添加KDN植酸酶600U/KG的生產(chǎn)效果，對(duì)肉雞生產(chǎn)性能提高明顯；且鈣磷排放較少，提高了飼料中鈣磷的吸收利用率；提高腸道中益生菌：乳酸桿菌、雙歧桿菌、類桿菌、總厭氧菌的含量。可以看出本發(fā)明MSY菌株具有包括但不限于以下方面的用途：MSY菌劑飼喂雞、鴨、豬，能提高鈣磷利用率，改善生產(chǎn)性能、腸道微生態(tài)平衡。