本發(fā)明涉及制藥領(lǐng)域，具體涉及一種鼠婦纖溶活性蛋白及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

血栓是三大致死性心血管疾病(心臟病、中風(fēng)和靜脈血栓栓塞癥)的根源，發(fā)病率較高，在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)漸增之勢(shì)。國(guó)際血栓與止血學(xué)會(huì)提供的資料顯示，在美國(guó)，每年有10萬(wàn)-30萬(wàn)人死于靜脈血栓；在歐洲，每年有50萬(wàn)人死于靜脈血栓，超過(guò)艾滋病、乳腺癌、前列腺癌和高速公路交通事故死亡人數(shù)之和；在中國(guó)，因血栓性疾病及其并發(fā)癥死亡的人數(shù)也眾多。目前，臨床應(yīng)用的抗栓藥物雖然能大幅度降低死亡率和致殘率，但是這些溶栓藥物仍然存在缺點(diǎn)，諸如出血副作用大，劑量難以控制，可能出現(xiàn)再阻塞和再梗死。此外，在臨床治療血栓性疾病過(guò)程中，一般先使用溶栓藥物將已經(jīng)形成的血栓溶解，然后使用抗凝藥物，避免血栓再次形成。然而，目前市場(chǎng)上很少有口服藥物同時(shí)具有溶栓和抗凝作用，因此，尋找一種副作用小，避免再阻塞和再梗死的溶栓抗凝藥物勢(shì)在必行。

鼠婦為甲殼綱等足目鼠婦科動(dòng)物鼠婦Porcellio scaber Latreille的干燥蟲(chóng)體，別名潮蟲(chóng)，地虱，西瓜蟲(chóng)，豌豆蟲(chóng)等，始載于《神農(nóng)本草》，具有破血利水，解毒止痛之功效。鼠婦是一味傳統(tǒng)的蟲(chóng)類(lèi)中藥，可用于治療中重度癌性疼痛，扁平疣，痔瘡，百日咳等。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種鼠婦纖溶活性蛋白，不僅具有溶栓和抗凝活性，且適于口服給藥。

本發(fā)明的另一目的是提供上述鼠婦纖溶活性蛋白在制備治療血栓性疾口服病藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)。

一種鼠婦纖溶活性蛋白，是將鼠婦粉碎物依次采用胃蛋白酶、和胰蛋白酶酶解后分離得到，其分子量為8k-10k Da，具有溶栓和抗凝活性。

鼠婦粉碎物酶解后，依次采用離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析和超濾濃縮，分離得到纖溶活性蛋白。

所述離子交換層析中采用HiTrap Capto Q離子交換層析柱進(jìn)行分離，采用1.5-3個(gè)柱體積的含有0.1-0.3mol/L NaCl的洗脫劑進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。

凝膠過(guò)濾層析中采用的色譜柱為SephacrylS-200HR凝膠層析柱和Superdex75pg凝膠層析柱。

所述SephacrylS-200HR凝膠層析柱分離過(guò)程中，洗脫劑為pH7-8、10-30mmol/L的Tris-HCl緩沖液，洗脫劑流速為0.5-1mL/min，收集具有纖溶活性的洗脫液。

所述Superdex75pg凝膠層析柱分離過(guò)程中，洗脫劑為pH7-8、10-30mmol/L的Tris-HCl緩沖液，洗脫劑流速為0.5-1mL/min，收集具有纖溶活性的洗脫液。

采用超濾濃縮獲得分子量大于5kDa小于10kDa的組分。

酶解時(shí)，所述胃蛋白酶、胰蛋白酶與鼠婦粉碎物的質(zhì)量比為0.5-1.5:1。

酶解溫度為37.5-38.5，酶解時(shí)間為3.5-4.5小時(shí)。

所述鼠婦纖溶活性蛋白在制備治療血栓性疾病口服藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的鼠婦纖溶活性蛋白，不僅具有溶栓和抗凝活性，且適于口服給藥。本發(fā)明鼠婦纖溶活性蛋白是將鼠婦粉碎物依次采用胃蛋白酶、和胰蛋白酶酶解后分離得到，因此適于口服給藥。本發(fā)明鼠婦纖溶活性蛋白在溶栓和抗凝方面的活性顯著強(qiáng)于PSLTro01，且經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證大鼠口服后具有較強(qiáng)的體內(nèi)抗血栓活性。本發(fā)明鼠婦纖溶活性蛋白并非是直接溶解纖維蛋白，而是通過(guò)激活纖溶酶原，使纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶，進(jìn)而溶解纖維蛋白，因此，該鼠婦纖溶活性蛋白的溶栓作用相對(duì)溫和，因而不會(huì)出現(xiàn)大量出血傾向，降低了組織大出血的風(fēng)險(xiǎn)。另外，本發(fā)明所提供鼠婦纖溶活性蛋白，制備方法行之有效，工藝過(guò)程簡(jiǎn)便，易操作，適應(yīng)于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明鼠婦纖溶活性蛋白還可以應(yīng)用于制備治療血栓性疾病口服藥物。

附圖說(shuō)明

圖1是SephacrylS-200HR凝膠層析結(jié)果，▉表示A280nm值，◆表示纖溶活性，橫坐標(biāo)為收集管數(shù)。

圖2是Superdex 75pg凝膠層析結(jié)果，▉表示A280nm值，◆表示纖溶活性，橫坐標(biāo)為收集管數(shù)。。

圖3是PSLTro02分離純化過(guò)程中各步驟所得組分的電泳圖，各泳道分別為：1.鼠婦粉碎物的酶解物；2.過(guò)HiTrap Capto Q離子交換層析柱后所得組分F-A；3.過(guò)Sephacryl S-200HR凝膠層析柱后所得組分F-C；4.過(guò)Superdex75pg凝膠層析柱后所得組分F-E；5.采用超濾離心管純化后所得組分F-F；M.蛋白Marker。

圖4是HPLC檢測(cè)PSLTro02的色譜圖。

圖5 MALDI-TOF MS質(zhì)譜法分子量測(cè)定圖譜

圖6顯示了PSLTro02的一級(jí)質(zhì)譜圖。

圖7顯示了PSLTro02的二級(jí)質(zhì)譜圖。

圖8顯示溫度對(duì)PSLTro02纖溶活性影響.

圖9顯示PSLTro02的溫度穩(wěn)定性，不同顏色的柱狀圖表示不同處理時(shí)間。

圖10金屬離子對(duì)PSLTro02纖溶活性影響

圖11各物質(zhì)纖溶活性的比較，a：尿激酶；b：胰蛋白酶；c：蚓激酶；d：胃蛋白酶；e：鼠婦纖溶粗蛋白；f：PSLTro01；g:PSLTro02；h:生理鹽水。

具體實(shí)施方式

實(shí)施本發(fā)明可以按如下實(shí)施例進(jìn)行，但并不意味著對(duì)本發(fā)明范圍的限制。

實(shí)施例1鼠婦粉碎物及其酶解物

1.鼠婦濕法超微粉碎物的制備

稱(chēng)取干燥鼠婦100.0g，加入鼠婦質(zhì)量8倍的蒸餾水，在25℃水浴中浸泡1h后，加入超微粉碎機(jī)中在25℃條件下采用濕法超微粉碎10min。將粉碎后得到的漿料在4℃條件下，10000r/min離心10min，取上清液，冷凍干燥可得鼠婦濕法超微粉碎物9.6g。

1.鼠婦粉碎物的酶解物的制備

稱(chēng)取鼠婦濕法超微粉碎物500mg，復(fù)懸于50mL人工胃液(見(jiàn)于2010版中國(guó)藥典人工胃液的配制，胃蛋白酶濃度為10mg/mL)中，保證人工胃液中胃蛋白酶(批號(hào)313A0313，Solarbio公司)與鼠婦濕法超微粉碎物質(zhì)量相等，放入恒溫38℃搖床酶解4h，12000r/min離心10min，上清液即為人工胃液酶解液。冷凍干燥成凍干粉，再?gòu)?fù)懸于50mL人工腸液中，保證人工腸液(見(jiàn)于2010版中國(guó)藥典人工腸液的配制，胰蛋白酶濃度10mg/ml)中胰蛋白酶(批號(hào)112B1220，Solarbio公司)與鼠婦濕法超微粉碎物質(zhì)量相等，放入恒溫38℃搖床酶解4h，12000r/min離心10min，上清液即為人工腸液酶解液，冷凍干燥后，得到鼠婦粉碎物的酶解物。

2.酶解物中胃蛋白酶和胰蛋白酶的酶活

酶解物在進(jìn)行柱層析前按以下步驟滅活胃蛋白酶和胰蛋白酶：酶解物凍干粉先加入到pH7.0緩沖液(例如10-30mmol/L、pH7.0的磷酸緩沖液或Tris-HCl緩沖液)中滅活胃蛋白酶，然后加入到含有25mg/mL TLCK(對(duì)甲苯磺酰-L-賴(lài)氨酰氯甲酮)和1mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸)的溶液(溶劑為10-30mmol/L、pH7.2的磷酸緩沖液或Tris-HCl緩沖液)中滅活胰蛋白酶。

實(shí)施例2具有溶栓抗凝活性的鼠婦提取物的制備

(1)HiTrap Capto Q離子交換層析

HiTrap Capto Q離子交換層析柱(100ml，購(gòu)買(mǎi)于美國(guó)GE Healthcare)用5個(gè)柱體積的平衡緩沖液Ⅰ(pH8.0、濃度為20mmol/L Tris-HCl緩沖液)平衡，流速為1.0mL/min。將鼠婦粉碎物酶解物的凍干粉(已滅活胃蛋白酶和胰蛋白酶)，用20mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0)配制成10mg/mL的溶液，上樣于平衡后的HiTrap Capto Q離子交換層析柱，先用平衡緩沖液Ⅰ洗脫未吸附的蛋白，洗脫至基線(xiàn)后再用洗脫緩沖液Ⅰ(含1mol/LNaCl的pH8.0、20mmol/LTris-HCl緩沖液)與平衡緩沖液Ⅰ進(jìn)行洗脫，洗脫2個(gè)柱體積，洗脫緩沖液Ⅰ與平衡緩沖液Ⅰ的體積比為1:4，每2mL為一管收集。洗脫流速為1.0mL/min。各管蛋白液在280nm處測(cè)定吸光度并進(jìn)行纖溶活性檢測(cè)，經(jīng)檢測(cè)，各管均具有纖溶活性(檢測(cè)方法同申請(qǐng)?zhí)枮?01510043911.7的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng))，混合后冷凍干燥，得到組分F-A。

(2)SephacrylS-200HR凝膠層析

SephacrylS-200HR凝膠層析柱用5個(gè)柱體積的平衡緩沖液Ⅱ(pH7.4、20mmol/L Tris-HCl緩沖液)平衡，流速為0.5mL/min。組分F-A用平衡緩沖液Ⅱ配制成5mg/mL的溶液，通過(guò)系統(tǒng)泵以流速0.5mL/min上樣于層析柱頂部進(jìn)行凝膠分離。用平衡緩沖液Ⅱ進(jìn)行洗脫，流速為0.5mL/min，每3mL為一管進(jìn)行收集。各管蛋白液在280nm處測(cè)定吸光度并進(jìn)行纖溶活性檢測(cè)，收集具有纖溶活性的洗脫液并混合，冷凍干燥，得到組分F-C。見(jiàn)圖1。

(3)Superdex75pg凝膠層析

Superdex75pg凝膠層析柱用5個(gè)柱體積平衡緩沖液Ⅱ(pH7.4、20mmol/L Tris-HCl緩沖液)平衡，流速為0.5mL/min；將組分F-C用平衡緩沖液Ⅱ配制成5mg/mL溶液，通過(guò)系統(tǒng)泵以流速0.5mL/min上樣于層析柱頂部進(jìn)行凝膠分離。用平衡緩沖液Ⅱ以相同的流速進(jìn)行洗脫，每2mL為一管進(jìn)行收集。各管蛋白液在280nm處測(cè)定吸光度并進(jìn)行纖溶活性檢測(cè)。將具有纖溶活性的洗脫液混合，得到組分F-E，見(jiàn)圖2。將組分F-E過(guò)截留分子量為10kDa的超濾離心管( ultra-15)，取透過(guò)液過(guò)截留分子量為5kDa的超濾離心管(ultra-15)，取截留液，獲得組分F-F。將組分F-F命名為鼠婦纖溶活性蛋白PSLTro02。鼠婦纖溶活性蛋白PSLTro02的電泳圖，如圖3。從圖3可以看出,纖溶活性蛋白PSLTro02，分子量在8.0-10.0kDa范圍內(nèi)。

(4)纖溶活性蛋白PSLTro02的分離純化結(jié)果及鑒定

①分離純化結(jié)果

從3000mg鼠婦粉碎物的酶解物中分離純化得到了0.86mg纖溶活性蛋白PSLTro02，其相對(duì)效價(jià)為1509.8U/mg，回收率為9.6％，純化倍數(shù)334.8。詳細(xì)結(jié)果如表1。

表1鼠婦纖溶活性蛋白PSLTro02的純化結(jié)果

②HPLC純度檢測(cè)

如圖4所示HPLC檢測(cè)得到一個(gè)對(duì)稱(chēng)峰，其峰面積積分結(jié)果提示分離純化所得纖溶活性蛋白PSLTro02的純度達(dá)到93.86％。

③MALDI-TOF MS質(zhì)譜法分子量測(cè)定

PSLTro02經(jīng)過(guò)MALDI-TOF MS質(zhì)譜法測(cè)定，蛋白的相對(duì)分子量為8480.55Da，如圖5，這與SDS-PAGE結(jié)果吻合。

④MALDI-TOF MS質(zhì)譜法蛋白質(zhì)鑒定

將PSLTro02送上海中科院生命科學(xué)院檢測(cè)中心，采用MALDI-TOF MS質(zhì)譜法對(duì)其進(jìn)行鑒定，一級(jí)質(zhì)譜圖和二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖6、7。在National Center for Biotechnology Information(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)里下載同種屬纖溶活性蛋白的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，利用Mascot軟件分析PSLTro02質(zhì)譜數(shù)與所下載質(zhì)譜數(shù)據(jù)的匹配情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PSLTro02與同種屬Porcellio scaber和Armadillidium vulgare中獲得的蛋白匹配度均低于20％，因此可以確定，纖溶活性蛋白PSLTro02與目前數(shù)據(jù)庫(kù)里收錄的同種屬間的蛋白均不同，即PSLTro02是目前首次酶解鼠婦纖溶活性蛋白獲得的一種新的纖溶活性蛋白。

實(shí)施例2纖溶活性蛋白PSLTro02的酶學(xué)性質(zhì)

1、pH對(duì)其纖溶活性的影響

鼠婦纖溶活性蛋白PSLTro02在不同的pH環(huán)境下纖溶活性差異明顯。在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿環(huán)境下，纖溶活性急劇下降，在pH6-pH8之間活性較強(qiáng)，在pH＝7其纖溶活性達(dá)到最強(qiáng)，而且在堿性環(huán)境中的纖溶活性強(qiáng)于酸性環(huán)境中活性。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)PSLTro02在堿性和中性環(huán)境中穩(wěn)定性高于在酸性環(huán)境中穩(wěn)定性。在強(qiáng)酸條件下，隨著時(shí)間的推移，纖溶活性逐漸下降。人體中血液的pH一般維持在7.34-7.45，體液環(huán)境也為弱堿性環(huán)境，這與PSLTro02的最適反應(yīng)pH相吻合。此結(jié)果同時(shí)也驗(yàn)證了胃蛋白酶最優(yōu)失活條件對(duì)其活性無(wú)影響。

2、溫度對(duì)其纖溶活性的影響

溫度對(duì)PSLTro02纖溶活性的影響見(jiàn)圖8，可以看出，溫度對(duì)其影響較大，尤其溫度在超過(guò)50℃時(shí)，活性急劇下降，超過(guò)60℃，其活性幾乎降到0。溫度低于10℃時(shí)其活性也降至0。但在40℃時(shí)，其活性達(dá)到了最大。

考察PSLTro02在不同的溫度下處理不同時(shí)間對(duì)其纖溶活性的影響，即考察PSLTro02的穩(wěn)定性。從圖9可以看出，在溫度為20℃時(shí)，其活性最穩(wěn)定，溫度在超過(guò)20℃后，隨著處理時(shí)間的推移，其活性逐漸緩慢下降，在超過(guò)50℃后，隨著處理時(shí)間的推移，活性急劇下降。所以保存PSLTro02最適溫度最好在20℃。

3、金屬離子對(duì)其纖溶活性的影響

將PSLTro02加入到不同的金屬離子(0.1mmol/L)中，考察金屬離子對(duì)PSLTro02纖溶活性的影響見(jiàn)圖10，可以看出Na⁺，K⁺，Mg²⁺對(duì)PSLTro02纖溶活性沒(méi)有影響，Cu²⁺，Mn²⁺，F(xiàn)e²⁺，Ca²⁺，Zn²⁺，Al³⁺，F(xiàn)e³⁺均有不同程度抑制其纖溶活性，尤其是Fe²⁺，F(xiàn)e³⁺明顯抑制其活性，與PSLTro02作用后，殘余酶的活力僅為空白對(duì)照的12.5％以下。

4、酶抑制劑和表面活性劑對(duì)其纖溶活性的影響

PepstainA(胃蛋白酶抑制劑A)、KTI(大豆胰蛋白酶抑制劑)、SBTI(大豆蛋白酶抑制劑)、Aprotinin(抑肽酶)、β-mercaptoethanol(β-巰基乙醇)對(duì)PSLTro02纖溶活性影響較大。但PMSF(苯甲基磺酰氟，0.1-100mmol/L)，TLCK(對(duì)甲苯磺酰-L-賴(lài)氨酰氯甲酮，0.1-50mg/ml)，TPCK(對(duì)甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲酮，0.1-50mg/mL)，EDTA(乙二胺四乙酸，0.5-50mmol/L)，EGTA(乙二醇-雙-(2-氨基乙醚)四乙酸，0.5-50mmol/L)和SDS各濃度對(duì)PSLTro02的纖溶活性基本沒(méi)有影響。

5鼠婦纖溶活性蛋白PSLTro02對(duì)發(fā)色底物特異性的確定

在96孔板的各孔中分別加入175μL的PSLTro01溶液(含有1μg的PSLTro02，溶劑為pH 7.2、20mmol·L^-1的Tris-HCl緩沖液)，然后分別加入25μL濃度為0.5mmol·mL^-1的凝血酶特異性發(fā)色底物S-2238(H-D-Phe-Pip-Arg-pNA)、纖溶酶特異性發(fā)色底物S-2251(H-D-Val-Leu-Lys-pNA)或尿激酶特異性發(fā)色底物S-2444(pyro-Glu-Gly-Arg-pNA)溶液(溶劑為pH 7.2、20mmol·L^-1的Tris-HCl緩沖液)(發(fā)色底物均購(gòu)自法國(guó)HYPHEN BioMed公司)。將96孔板放入EnSpire Multimode Plate Reader酶標(biāo)儀控溫測(cè)試區(qū)，測(cè)試區(qū)溫度始終保持在37℃，保溫5min后，在405nm紫外波長(zhǎng)下連續(xù)掃描5mim測(cè)定釋放出的pNA(對(duì)硝基苯胺)的吸光度。通過(guò)各孔內(nèi)溶液吸光度的變化來(lái)計(jì)算pNA的釋放量。PSLTro02活性定義為：在37℃條件下，每毫克鼠婦纖溶酶在1min內(nèi)水解發(fā)色底物釋放1μmol pNA的蛋白量為1U。

鼠婦纖溶活性蛋白PSLTro02對(duì)這三種發(fā)色底物均有水解作用，結(jié)果見(jiàn)表2，從表中可以看出，PSLTro02對(duì)纖溶酶最適底物H-D-Val-Leu-Lys-pNA的水解活性最大，對(duì)凝血酶最適底物H-D-Phe-Pip-Arg-pNA和尿激酶最適底物pyro-Glu-Gly-Arg-pNA的水解活性相當(dāng)，但都低于對(duì)纖溶酶最適底物的水解活性，由此結(jié)果可以推測(cè)出PSLTro02的特異性水解產(chǎn)物為S-2251。

表2PSLTro02作用于發(fā)色底物的酰胺水解活性(n＝5)

實(shí)施例3纖溶活性蛋白PSLTro02溶栓抗凝活性

1、體內(nèi)抗血栓活性

取SD大鼠40只，雌雄各半，隨機(jī)分為5組：生理鹽水組(即空白對(duì)照組)，尿激酶組和蚓激酶組(陽(yáng)性對(duì)照組)，纖溶活性蛋白PSLTro02高劑量組和低劑量組，各組連續(xù)灌胃5天，每天1次，劑量見(jiàn)表3。用2％戊巴比妥鈉溶液(按40mg/kg)麻醉上述5組SD大鼠，制作動(dòng)靜脈環(huán)路血栓模型，大鼠仰臥位固定于手術(shù)板上，分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈和左側(cè)頸外靜脈，在注滿(mǎn)肝素鈉生理鹽水(50U/mL)的聚乙烯管中放一根長(zhǎng)約8cm的已稱(chēng)重的手術(shù)線(xiàn)，用該聚乙烯管連通右側(cè)頸總動(dòng)脈和左側(cè)頸外靜脈，用藥30min后開(kāi)放動(dòng)靜脈環(huán)路15min，中斷血流形成血栓。15min后取出血栓，在濾紙上來(lái)回滾動(dòng)，來(lái)去除多余浮血，放置于已稱(chēng)重的載玻片上稱(chēng)重，減去載玻片和手術(shù)線(xiàn)的重量即是血栓濕重，并計(jì)算血栓抑制率。在75℃干燥箱中80min后，待其冷卻后稱(chēng)其干重，求出血栓抑制率。

血栓抑制率(％)＝(空白對(duì)照組血栓重量-實(shí)驗(yàn)組血栓重量)/空白對(duì)照組血栓重量×100％。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)方法：采用SPSS軟件計(jì)算機(jī)處理，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以(表示平均值，s表示標(biāo)準(zhǔn)偏差)表示，組間差距顯著性用T檢驗(yàn)判定。

表3PSLTro02對(duì)大鼠動(dòng)靜脈環(huán)路血栓形成重量的影響(n＝5)

注：表3中，與空白對(duì)照組相比，^*P<0.05，^**P<0.01。

從表3可以看出，PSLTro02高劑量組的抑制率明顯比陽(yáng)性對(duì)照尿激酶組的抑制率高，具有非常好的體內(nèi)抗血栓活性。

2、體外抗凝血活性

選擇日本大耳兔雄性，以鹽酸普魯卡因局部麻醉，頸動(dòng)脈插聚乙烯管取血，按體積比1：9加入3.8％的檸檬酸鈉溶液后輕輕混勻，3000r/min離心10min，收集上清血漿備用。采用購(gòu)自北京中勤世帝科學(xué)儀器有限公司體外診斷試劑盒:TT(批號(hào)STY50301-35)，APTT(批號(hào)STY50201-36)，PT(批號(hào)STY50101-58)，分別檢測(cè)凝血酶時(shí)間(TT)、凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血酶時(shí)間(APTT)。

檢測(cè)中，纖溶活性蛋白PSLTro02溶液分為小、中和大三個(gè)劑量組，PSLTro02的終濃度分別為5μg·mL^-1，10μg·mL^-1，20μg·mL^-1；空白對(duì)照組中加入去離子水，陽(yáng)性對(duì)照組中加入肝素鈉(終濃度為1U·mL^-1)。鼠婦纖溶酶PSLTro01按照申請(qǐng)?zhí)枮?01510043911.7的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)中方法制備。

從表4可以看出，PSLTro02可以明顯延遲TT、PT、APTT的時(shí)間，但延遲作用不盡相同。在PSLTro02濃度達(dá)到10ug/mL時(shí)，對(duì)TT的延遲作用時(shí)間基本與肝素鈉等效，在其濃度達(dá)到20ug/mL時(shí)，對(duì)PT的延遲作用時(shí)間與肝素鈉等效，尤其是對(duì)APTT的延遲作用時(shí)間隨著濃度的遞增延遲作用時(shí)間最明顯。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PSLTro02同時(shí)作用于凝血過(guò)程中TT、PT、APTT三個(gè)途徑，主要是抑制內(nèi)源性凝血途徑和共同凝血途徑，延遲血漿凝固時(shí)間，而且隨著PSLTro02濃度的增大，抗凝作用越強(qiáng)。同時(shí)與鼠婦纖溶酶PSLTro01在同樣環(huán)境下進(jìn)行抗凝活性對(duì)比，體外抗凝活性差異顯著。

表4顯示PSLTro02和PSLTro01對(duì)TT、PT、APTT的影響(n＝5)

注：與空白對(duì)照相比：^*P<0.05，^**P<0.01。

3、體外抗血栓活性研究

稱(chēng)定100mg瓊脂糖，加入10mL PBS緩沖液(pH7.8)，加熱至沸騰使其充分溶解后，放置50℃的水浴鍋中至恒溫，得到瓊脂糖溶液。稱(chēng)定45mg纖維蛋白原，加入15mLPBS，放置50℃的水浴鍋中使其充分溶解，得到纖維蛋白原溶液。凝血酶一瓶為2000U，加入4mL生理鹽水充分溶解(500U/mL)50uL進(jìn)行分裝。取20uL凝血酶，加入3mL生理鹽水混勻，得到凝血酶溶液。依次將纖維蛋白原溶液，凝血酶溶液，瓊脂糖溶液倒入到培養(yǎng)皿中，快速混勻，室溫靜置1h，或者4℃冰箱靜置30mn至凝固完全，得到纖維蛋白平板。打孔器打孔，將尿激酶、蚓激酶(10mg/ml)、鼠婦粉碎物的酶解物(滅活胃蛋白酶和胰蛋白酶)(10mg/ml)、鼠婦纖溶酶PSLTro01(10mg/ml)、纖溶活性蛋白PSLTro02(10mg/ml)、胃蛋白酶(10mg/ml)、胰蛋白酶(10mg/ml)、生理鹽水分別取80uL點(diǎn)樣于平板孔內(nèi)，將平板置于37℃烘箱中，18h后觀察有無(wú)溶圈，比較大小。其中鼠婦纖溶酶PSLTro01、纖溶活性蛋白PSLTro02加入的質(zhì)量相等。

從圖11可以看出，纖溶活性比較：尿激酶>胰蛋白酶>蚓激酶>PSLTro02>PSLTro01>胃蛋白酶>鼠婦纖溶粗蛋白，PSLTro02與PSLTro01的纖溶活性差異顯著，溶圈面積PSLTro02明顯大于PSLTro01的溶圈面積。

4鼠婦纖溶活性蛋白PSLTro02溶栓機(jī)理

分析純纖維蛋白原中通常含有少許的纖溶酶原，這樣會(huì)導(dǎo)致配制的纖維蛋白平板含有微量的纖溶酶原，容易混淆樣品的纖溶機(jī)理，因此配制不加熱的平板稱(chēng)為陽(yáng)性平板。將陽(yáng)性平板置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中85℃加熱35min，可使纖溶酶原完全失活，制成不含纖溶酶原的纖維蛋白平板，即為陰性平板。在陽(yáng)性平板和陰性平板上打出若干直徑約為2mm的小孔，分別加入10μL鼠婦纖溶活性蛋白PSLTro02溶液(20ug/ml)，超純水，尿激酶溶液(濃度10U/ml)。放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中，18h后觀察纖維平板溶圈變化。結(jié)果：陽(yáng)性平板上可以明顯的看到尿激酶和PSLTro02有溶圈，而在陰性平板上，兩者均無(wú)溶圈出現(xiàn)，由此提示PSLTro02溶栓方式是激活纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶，再進(jìn)一步溶解纖維蛋白，而并不是直接溶解纖維蛋白。

5鼠婦纖溶活性蛋白PSLTro02對(duì)纖維蛋白原的裂解

取200μL濃度為5mg·mL^-1纖維蛋白原溶液和100μL濃度為0.2mg/mL PSLTro02纖溶活性蛋白溶液的充分混合后，放置于37℃恒溫水浴鍋中水浴5min，15min，30min，1h，4h，8h，16h，24h后取出20μL樣品液，加入4μL上樣緩沖液，進(jìn)行SDS-PAGE垂直板電泳(分離膠T＝12％)，電泳時(shí)以纖維蛋白原作空白對(duì)照。電泳結(jié)束后觀察凝膠成像，分析纖維蛋白原α，β，γ鏈的降解情況。從電泳圖可以看出PSLTro02降解纖維蛋白的順序是降解纖維蛋白原的α鏈，β鏈，γ鏈，這一點(diǎn)與人纖溶酶順次降解纖維蛋白各亞基的情況相似。