本發(fā)明屬于中成藥質(zhì)量控制技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用SMRT測序技術(shù)及DNA條形碼分子鑒定技術(shù)監(jiān)測中成藥生物物種組成的方法。

背景技術(shù)：

現(xiàn)行版《中國藥典》對中成藥質(zhì)量控制的方法主要包括顯微鑒別、薄層色譜鑒別、含量測定、指紋圖譜等。然而，薄層色譜鑒別和含量測定僅可對中成藥中是否含有目標(biāo)化學(xué)成分進(jìn)行定性或定量監(jiān)測，無法判定該目標(biāo)化學(xué)成分是來源于中成藥處方中的相應(yīng)藥材或是人為添加。

DNA條形碼分子鑒定法是利用基因組中一段公認(rèn)的相對較短的DNA序列極性物種鑒定的一種分子生物學(xué)技術(shù)，是傳統(tǒng)鑒定方法的有效補(bǔ)充。2015年版《中國藥典》收載中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則，將其作為中藥材質(zhì)量控制方法之一，現(xiàn)已獲得廣泛應(yīng)用。單分子測序技術(shù)，又稱第三代測序技術(shù)，包括單分子熒光測序和納米孔測序兩大類，如美國太平洋生物公司(Pacific Bioscience)的Pacbio RSII測序平臺，美國螺旋生物公司(Helicos)的Heliscope單分子測序平臺，英國牛津納米孔公司(Oxford Nanopore Technologies)的MinION測序平臺等，均具有讀長長、速度快、精度高等特點。目前該技術(shù)主要應(yīng)用于基因組測序、DNA甲基化研究、SNP檢測等方面。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種基于SMRT測序技術(shù)的中成藥生物物種組成成分的監(jiān)測方法，該方法能夠?qū)ΜF(xiàn)有中成藥質(zhì)量控制方法進(jìn)行有效補(bǔ)充，維護(hù)臨床用藥安全。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)措施來實現(xiàn)的：一種基于SMRT測序技術(shù)的中成藥生物物種組成成分的監(jiān)測方法，其包括如下步驟：

1)提取待檢樣品基因組DNA。

2)以上述DNA為模板，擴(kuò)增其ITS2序列和psbA-trnH序列。

3)基于Pacbio RSII測序平臺，依照該平臺標(biāo)準(zhǔn)操作流程，對上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行文庫構(gòu)建，并進(jìn)行SMRT測序。

4)應(yīng)用SMRT Analysis Server 2.3.0軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，并基于RS_ReadsOfInsert.1操作流程獲得環(huán)狀一致性序列(circular-consensus sequencing，CCS)，用CD-HIT軟件將CCS序列進(jìn)行聚類，最終獲得可用于后續(xù)分析的ITS2和psbA-trnH序列。

5)將上述序列放入中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)(http：//www.tcmbarcode.cn/china/)，進(jìn)行BLAST比對，獲得物種鑒定結(jié)果。

擴(kuò)增引物使用的ITS2序列引物，其序列為：

正向引物：ATGCGATACTTGGTGTGAAT；

反向引物：GACGCTTCTCCAGACTACAAT。

擴(kuò)增引物使用的psbA-trnH序列引物，其序列為：

正向引物：GTTATGCATGAACGTAATGCTC

反向引物：CGCGCATGGTGGATTCACAATCC

上述引物用于擴(kuò)增中成藥中各個藥材的ITS2序列和psbA-trnH序列。

本發(fā)明還提供含有上述引物的中成藥生物物種組成成分監(jiān)測相關(guān)試劑盒。

本發(fā)明方法適用性廣，能檢測所有能擴(kuò)增出ITS2序列或psbA-trnH序列的中成藥樣品。因此，能夠?qū)崿F(xiàn)中成藥的生物物種組成成分的監(jiān)測，對現(xiàn)有中成藥質(zhì)量控制方法進(jìn)行有效補(bǔ)充，維護(hù)臨床用藥安全。

具體實施方式

下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，而并非對發(fā)明的限定，依照本領(lǐng)域公知的現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的實施方式并不限于此，因此凡依照本公開內(nèi)容所做出的本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實施例1

1.材料：

試驗材料為中成藥九味羌活丸，本實施例所用材料為依照《中國藥典》中該中成藥處方的規(guī)定劑量及制法，在實驗室自制。此外，為驗證本方法的靈敏度，根據(jù)該處方中劑量最小的一味藥材細(xì)辛的用量，加入等量人參藥材作為陽性對照。

2.實驗步驟：

1)中成藥九味羌活丸處方由羌活、防風(fēng)、黃芩、細(xì)辛、地黃、川芎、蒼術(shù)、白芷和甘草共9味中藥組成。本實施例所用到的各個藥材均已經(jīng)過形態(tài)學(xué)及DNA條形碼鑒定，以確保其物種的準(zhǔn)確性，因蒼術(shù)和白芷未能獲得DNA條形碼序列，故由形態(tài)學(xué)鑒定其物種。依照《中國藥典》規(guī)定劑量及制法，將上述藥材及陽性對照藥材人參混合粉碎并過篩，制成丸劑。

2)DNA提取

取120mg上述樣品，用MM400高通量組織研磨儀(德國Retsch)研磨，用核分離液漂洗至上清液無色，用植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取基因組DNA。

3)PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物回收

分別擴(kuò)增所提取DNA的ITS2序列和psbA-trnH序列。擴(kuò)增引物使用的ITS2序列正向引物：ATGCGATACTTGGTGTGAAT；反向引物：GACGCTTCTCCAGACTACAAT。擴(kuò)增引物使用的psbA-trnH序列正向引物：GTTATGCATGAACGTAATGCTC；反向引物：CGCGCATGGTGGATTCACAATCC，由生工生物工程有限公司(北京)合成。引物用無菌去離子溶解并稀釋至2.5μmol/μL。

25μL反應(yīng)體系：2×PCR MasterMix 12.5μL，正反向引物各1.0μL(2.5μmol/L)，模板DNA 20～100ng，加滅菌雙蒸水至25μL，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)程序：在PCR儀上按照以下程序進(jìn)行ITS2序列和psbA-trnH序列擴(kuò)增反應(yīng)：

PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后，用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN N.V.，德國)進(jìn)行切膠回收，獲得純化產(chǎn)物。

5)文庫構(gòu)建、SMRT測序及數(shù)據(jù)處理

本實施例基于Pacbio RSII測序平臺，依照該平臺標(biāo)準(zhǔn)操作流程，對上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行文庫構(gòu)建，并進(jìn)行SMRT測序。

應(yīng)用SMRT Analysis Server 2.3.0軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，并基于RS_ReadsOfInsert.1操作流程獲得環(huán)狀一致性序列(circular-consensus sequencing reads，CCS reads)，本實施例獲得ITS2序列和psbA-trnH序列。

6)物種鑒定

將上述序列放入中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)(http：//www.tcmbarcode.cn/china/)，進(jìn)行BLAST比對，獲得物種鑒定結(jié)果。本實施例所得ITS2序列和psbA-trnH序列經(jīng)BLAST比對后，結(jié)果如下：

ITS2序列能夠檢出羌活、防風(fēng)、細(xì)辛、川芎、地黃、甘草。

psbA-trnH序列能夠檢出羌活、川芎、黃芩、甘草以及陽性對照藥材人參。

ITS2序列與psbA-trnH序列結(jié)合，未能檢出蒼術(shù)、白芷，這與實驗步驟1)中DNA條形碼鑒定結(jié)果一致。

該結(jié)果顯示本發(fā)明所公開的基于SMRT測序技術(shù)的中成藥生物物種組成監(jiān)測方法能夠用于實驗室自制中成藥九味羌活丸的物種組成監(jiān)測，具有良好的可行性。

實施例2

1.材料：

基本同實施例1，所不同的是沒有加入實施例1中的陽性對照藥材人參。

2.實驗步驟：

同實施例1。

本實施例所得ITS2序列和psbA-trnH序列經(jīng)BLAST比對后，結(jié)果如下：

ITS2序列能夠檢出羌活、防風(fēng)、細(xì)辛、川芎、地黃、甘草。

psbA-trnH序列能夠檢出羌活、川芎、黃芩、甘草。

ITS2序列與psbA-trnH序列結(jié)合，未能檢出蒼術(shù)、白芷。與實施例1一致。

該結(jié)果顯示本發(fā)明所公開的基于SMRT測序技術(shù)的中成藥生物物種組成監(jiān)測方法能夠用于實驗室自制中成藥九味羌活丸的物種組成監(jiān)測，具有良好的可行性。

實施例3

1.材料：

試驗材料為由某制藥廠生產(chǎn)的具備藥品批準(zhǔn)文號的中成藥九味羌活丸(批號：20141101)，購買自某藥店。

2.實驗步驟：

基本同實施例1，所不同的是本實施例由DNA提取步驟開始，逐步完成實驗操作和數(shù)據(jù)處理，直至物種鑒定。

本實施例所得ITS2序列和psbA-trnH序列經(jīng)BLAST比對后，結(jié)果如下：

ITS2序列能夠檢出羌活、蒼術(shù)、細(xì)辛、川芎、甘草。

psbA-trnH序列能夠檢出羌活、防風(fēng)、蒼術(shù)、川芎、黃芩、甘草。

ITS2序列與psbA-trnH序列結(jié)合，未能檢出地黃、白芷。其原因可能為，本實施例所用中成藥試驗樣品中上述兩個物種DNA降解嚴(yán)重，或該中成藥在制劑過程中未按照《中國藥典》規(guī)定加入上述兩種中藥材的粉末。

該結(jié)果顯示本發(fā)明所公開的基于SMRT測序技術(shù)的中成藥生物物種組成監(jiān)測方法能夠用于市售中成藥九味羌活丸的物種組成監(jiān)測，具有良好的可行性。

實施例4

1.材料：

試驗材料為由某制藥廠生產(chǎn)的具備藥品批準(zhǔn)文號的中成藥九味羌活丸(批號：20140501)，購買自某藥店。

2.實驗步驟：

基本同實施例1，所不同的是本實施例由DNA提取步驟開始，逐步完成實驗操作和數(shù)據(jù)處理，直至物種鑒定。

本實施例所得ITS2序列和psbA-trnH序列經(jīng)BLAST比對后，結(jié)果如下：

ITS2序列能夠檢出羌活、防風(fēng)、蒼術(shù)、細(xì)辛、川芎、甘草。

psbA-trnH序列能夠檢出川芎、甘草。

ITS2序列與psbA-trnH序列結(jié)合，未能檢出黃芩、地黃、白芷。其原因可能為，本實施例所用中成藥試驗樣品中上述三個物種DNA降解嚴(yán)重，或該中成藥在制劑過程中未按照《中國藥典》規(guī)定加入上述兩種中藥材的粉末。

該結(jié)果顯示本發(fā)明所公開的基于SMRT測序技術(shù)的中成藥生物物種組成監(jiān)測方法能夠用于市售中成藥九味羌活丸的物種組成監(jiān)測，具有良好的可行性。

實施例5

1.材料：

試驗材料為由某制藥廠生產(chǎn)的具備藥品批準(zhǔn)文號的中成藥九味羌活丸(批號：20140501)，購買自某藥店。

2.實驗步驟：

基本同實施例1，所不同的是本實施例由DNA提取步驟開始，逐步完成實驗操作和數(shù)據(jù)處理，直至物種鑒定。

本實施例所得ITS2序列和psbA-trnH序列經(jīng)BLAST比對后，結(jié)果如下：

ITS2序列能夠檢出羌活、防風(fēng)、蒼術(shù)、細(xì)辛、川芎、甘草。

psbA-trnH序列能夠檢出羌活、蒼術(shù)、川芎、黃芩、甘草。

ITS2序列與psbA-trnH序列結(jié)合，未能檢出地黃、白芷。其原因可能為，本實施例所用中成藥試驗樣品中上述兩個物種DNA降解嚴(yán)重，或該中成藥在制劑過程中未按照《中國藥典》規(guī)定加入上述兩種中藥材的粉末。

該結(jié)果顯示本發(fā)明所公開的基于SMRT測序技術(shù)的中成藥生物物種組成監(jiān)測方法能夠用于市售中成藥九味羌活丸的物種組成監(jiān)測，具有良好的可行性。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。