本發(fā)明屬于中藥材來源品種鑒定
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及用SNP分子標(biāo)記鑒定寧夏枸杞和枸杞的方法。
背景技術(shù)：
：寧夏枸杞(Lyciumbarbarum)和枸杞(Lyciumchinense)均為茄科枸杞屬植物，2015年版《中國藥典》收載此二者的干燥根皮為中藥材地骨皮的來源。此外，《中國藥典》還規(guī)定寧夏枸杞LyciumbarbarumL.的干燥成熟果實為中藥材枸杞子的唯一來源，而枸杞LyciumchinenseMill.的果實不作藥用。此二者在外觀性狀上差異較小，鑒別特征為種子大小，鑒于寧夏枸杞產(chǎn)業(yè)效益可觀，經(jīng)營者將寧夏枸杞同屬近緣物種枸杞的果實當(dāng)做枸杞子在市場上出售，后者價格低廉，大幅降低枸杞子深加工產(chǎn)品的生產(chǎn)成本，因而經(jīng)營者能夠從中謀取更高利潤。為維護消費者利益，保證藥品質(zhì)量，需要尋找一種穩(wěn)定可靠的方法將寧夏枸杞和枸杞加以鑒定區(qū)分。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明第一個目的在于提供寧夏枸杞和枸杞鑒定用SNP。本發(fā)明第二個目的在于提供寧夏枸杞和枸杞鑒定用SNP在寧夏枸杞和枸杞鑒定中的應(yīng)用。本發(fā)明第三個目的在于提供寧夏枸杞和枸杞SNP快速鑒定方法。本發(fā)明提供的寧夏枸杞和枸杞鑒定用SNP，自核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，其中，SEQIDNo.1所示序列的5’端起第97位、第173位為C或T，第200位為G或A。本發(fā)明提供的SNP可用于鑒定寧夏枸杞和枸杞，如果自SEQIDNo.1所示序列的5’端起第97位、第173位為C，第200位為G，則鑒定為寧夏枸杞，如果自SEQIDNo.1所示序列的5’端起第97位、第173位為T，第200位為A，則鑒定為枸杞。本發(fā)明提供的寧夏枸杞和枸杞SNP快速鑒定方法，其包括如下步驟：1)以待測樣品DNA為模板，擴增含有SEQIDNo.1所示序列的片段；2)對擴增產(chǎn)物進行測序，拼接后去除序列兩端5.8S和28S基因區(qū)，獲得完整ITS2基因間隔區(qū)，通過分析SEQIDNo.1所示的序列，確定自SEQIDNo.1所示序列的5’端起第97位、第173位、第200位的堿基。其中，如果自SEQIDNo.1所示序列的5’端起第97位、第173位為C，第200位為G，則鑒定為寧夏枸杞，如果自SEQIDNo.1所示序列的5’端起第97位、第173位為T，第200位為A，則鑒定為枸杞。擴增引物使用ITS2序列引物，其序列為：正向引物：ATGCGATACTTGGTGTGAAT；反向引物：GACGCTTCTCCAGACTACAAT。上述引物用于擴增寧夏枸杞或枸杞的ITS2序列。本發(fā)明還提供含有上述引物的寧夏枸杞和枸杞鑒定試劑盒。本發(fā)明方法適用性廣，能檢測任何能提取出DNA的寧夏枸杞和枸杞樣品。因此，能夠?qū)崿F(xiàn)寧夏枸杞、枸杞原植物、藥材和生飲片的快速、準(zhǔn)確鑒定。附圖說明圖1所示為ITS2序列的擴增結(jié)果(注：M：Marker(100bpDNALadder)CK：陰性對照1-9：樣品YC0026MT06-14)。圖2所示為寧夏枸杞和枸杞ITS2序列的三個SNP位點序列比對結(jié)果。具體實施方式下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明作進一步說明，而并非對發(fā)明的限定，依照本領(lǐng)域公知的現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的實施方式并不限于此，因此凡依照本公開內(nèi)容所做出的本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。實施例11)從國內(nèi)不同產(chǎn)地收集的37份寧夏枸杞和11份枸杞葉片及果實樣品(表1)，分別取20mg葉片，50mg果實，加入樣本量10％的PVP-40，在MM400高通量組織研磨儀(德國Retsch)上進行研磨，用植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)的提取總DNA。表1寧夏枸杞和枸杞葉片及果實樣品信息2)PCR擴增引物序列正向引物：ATGCGATACTTGGTGTGAAT；反向引物：GACGCTTCTCCAGACTACAAT，由生工生物工程公司有限公司(北京)合成。引物用無菌去離子溶解并稀釋至2.5μmol/μL。25μL反應(yīng)體系：PCRMasterMix12.5μL，引物各1.0μL(2.5μmol/L)，模板DNA20～100ng，加滅菌雙蒸水至25μL，進行PCR擴增。PCR反應(yīng)程序：在PCR儀上按照以下程序進行擴增反應(yīng)：分別取4μL的PCR擴增產(chǎn)物上樣，用1％的瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳后在凝膠成像儀上檢測結(jié)果(圖1)。3)測序PCR產(chǎn)物直接送中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院重大工程實驗室測序。測序引物同PCR引物。為確保DNA條形碼序列的可靠性，需要進行正反向測序或重復(fù)測序，然后將正反向測序結(jié)果進行拼接獲得DNA條形碼序列。4)序列拼接本實施例采用應(yīng)用軟件CodonCodeAlignerV3.7.1(CodonCodeCo.，USA)進行序列拼接及校對。首先，進行測序質(zhì)量評估及預(yù)處理，即去除測序結(jié)果兩端的低質(zhì)量部分，并對剩余部分進行質(zhì)量評估，如果滿足質(zhì)量要求，方可用于序列拼接，具體方法是：以20bp的窗口分別從序列5’端和3’端進行滑動，如果窗口內(nèi)有多于2個堿基的Q值小于20，則刪除一個堿基，窗口繼續(xù)滑動，如果窗口內(nèi)堿基Q值小于20的數(shù)目小于或等于2個，窗口停止滑動。測序結(jié)果的剩余部分需大于150bp，且平均Q值大于等于30(Chenetal.2010)。最后進行序列拼接，根據(jù)HiddenMarkovModel(HMM)模型，去除序列兩端5.8S和28S基因區(qū)，獲得完整的寧夏枸杞和枸杞ITS2基因間隔區(qū)序列。5)序列比對用MEGA6.0軟件對測序并拼接后的各個樣品的ITS2基因間隔區(qū)序列進行比對，結(jié)果如圖2所示。從圖2中可以看出，共獲得三個SNP位點，所有寧夏枸杞樣品的ITS2基因間隔區(qū)序列(SEQIDNo.1)的第97位、第173位為C，第200位為G，而所有澤瀉樣品的ITS2基因間隔基因區(qū)序列的第97位、第173位為T，第200位為A，表明這三個SNP位點可特異性地用于鑒定寧夏枸杞和枸杞。實施例2基本同實施例1，所不同的是試驗材料為將實施例1中的寧夏枸杞和枸杞果實制備成的飲片，以該飲片為樣品，提取DNA，進行鑒定，結(jié)果也能特異性地檢測到上述的三個SNP位點。實施例3基本同實施例1，所不同的是試驗材料為購買自10個藥材市場和藥店的23份枸杞子藥材樣品(表2)，以該藥材為樣品，提取DNA，進行鑒定，結(jié)果也能特異性地檢測到上述的三個SNP位點。表2市售枸杞子藥材信息序號樣品編號購買地點1YC0026MT01四川成都荷花池藥市2YC0026MT02四川成都荷花池藥市3YC0026MT03四川成都荷花池藥市4YC0026MT04四川成都荷花池藥市5YC0026MT05四川成都荷花池藥市6YC0026MT06北京市某藥店7YC0026MT07北京市某藥店8YC0026MT08北京市某藥店9YC0026MT09北京市某藥店10YC0026MT10北京市某藥店11YC0026MT11寧夏中寧縣某藥店12YC0026MT12寧夏永寧縣某藥店13YC0026MT13青海諾木洪某藥店14YC0026MT14青海諾木洪某藥店15YC0026MT15新疆精河縣某藥店16YC0026MT16新疆精河縣某藥店17YC0026MT17內(nèi)蒙古烏拉特前旗某藥店18YC0026MT18內(nèi)蒙古某公司19YC0026MT19河北安國藥市20YC0026MT20河北安國藥市21YC0026MT21河北安國藥市22YC0026MT22河北安國藥市23YC0026MT23河北巨鹿縣實施例4基本同實施例1，所不同的是試驗材料為采集自韓國首爾市的枸杞葉片及果實樣品(表3)，提取DNA，進行鑒定，結(jié)果也能特異性地檢測到上述的三個SNP位點。表3韓國采集枸杞葉片及果實樣品信息序號樣品編號物種名稱取樣部位采樣地點1PS1139MT22枸杞果實韓國首爾市2PS1139MT23枸杞果實韓國首爾市3PS1139MT24枸杞葉片韓國首爾市實施例5基本同實施例1，所不同的是試驗材料為從國內(nèi)不同產(chǎn)地收集的14份寧夏枸杞和1份枸杞根皮樣品(表4)，取栓皮內(nèi)部的組織約50mg，提取DNA，進行鑒定，結(jié)果也能特異性地檢測到上述的三個SNP位點。表4寧夏枸杞和枸杞根皮樣品信息序號樣品編號物種名稱采樣地點1YC0026MT24寧夏枸杞寧夏銀川市2YC0026MT25寧夏枸杞寧夏中寧縣3YC0026MT26寧夏枸杞寧夏中寧縣4YC0026MT27寧夏枸杞寧夏中寧縣5YC0026MT28寧夏枸杞甘肅景泰縣6YC0026MT29寧夏枸杞甘肅景泰縣7YC0026MT30寧夏枸杞甘肅靖遠縣8YC0026MT31寧夏枸杞青海都蘭縣9YC0026MT32寧夏枸杞寧夏中寧縣10YC0026MT33寧夏枸杞甘肅景泰縣11YC0026MT34寧夏枸杞甘肅景泰縣12YC0026MT35寧夏枸杞青海格爾木13YC0026MT36寧夏枸杞青海格爾木14YC0026MT37寧夏枸杞寧夏銀川市15YC0095MT14枸杞河北巨鹿縣實施例6基本同實施例1，所不同的是試驗材料為購買自10個藥材市場和藥店的份地骨皮藥材樣品(表5)，取栓皮內(nèi)部的組織約50mg，提取DNA，進行鑒定，結(jié)果也能特異性地檢測到上述的三個SNP位點。表5市售地骨皮藥材信息以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3