本發(fā)明涉及分子生物領(lǐng)域，具體涉及ZNF800基因在制備骨質(zhì)疏松癥早期篩查產(chǎn)品中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis)是一種以骨量降低、骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征，導(dǎo)致骨脆性增加和易于骨折的代謝性骨病。骨質(zhì)疏松癥發(fā)病緩慢，以骨骼疼痛和脆性骨折為特征。隨著社會(huì)發(fā)展和人口老齡化，骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為最為常見的疾病之一。目前骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為多發(fā)病和常見病，隨著年齡增長而發(fā)病率增加。我國是世界人口和老年人口最多的國家，同時(shí)也是骨質(zhì)疏松癥和潛在骨質(zhì)疏松癥患者最多的國家。我國60歲以上骨質(zhì)疏松癥患者大約為2900萬例，低骨量患者為1700萬例。我國60歲以上骨質(zhì)疏松骨折總患病率大20.1％，嚴(yán)重威脅人群健康并帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

目前骨質(zhì)疏松癥的治療仍以健康教育和骨折處理為主，然而目前用于臨床的多種藥物多以抑制破骨細(xì)胞功能為主，但臨床效果不滿意，未來更看好以促進(jìn)成骨的藥物。但由于缺乏病因和致病機(jī)理的研究，還不能有效控制骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生和發(fā)展。因此，深入研究骨質(zhì)疏松癥的病因和致病機(jī)理并探索新的治療方法在我國有著非同尋常的意義。

骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生是遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，是一個(gè)復(fù)雜的多因子疾病。近年來，對(duì)于骨質(zhì)疏松癥遺傳機(jī)制和相關(guān)基因的研究已經(jīng)成為骨質(zhì)疏松癥病因?qū)W研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。此前國內(nèi)外學(xué)者對(duì)骨質(zhì)疏松癥的相關(guān)基因開展了大量的研究，試圖通過研究確定其直接病因；找到敏感的遺傳標(biāo)記，預(yù)測發(fā)生骨質(zhì)疏松的危險(xiǎn)性；開發(fā)藥物防止骨量丟失和逆轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松。但是，其相關(guān)基因和致病基因仍然尚未明確，而致病機(jī)制還有待于更加深入和廣泛的探索。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了實(shí)現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥的早期發(fā)現(xiàn)，早期干預(yù)，本發(fā)明的目的在于提供一種新的骨質(zhì)疏松癥相關(guān)基因，以及該基因的表達(dá)蛋白及其片段、類似物和衍生物。

本發(fā)明的另一目的是提供該骨質(zhì)疏松癥相關(guān)基因及其表達(dá)產(chǎn)物在骨質(zhì)疏松癥早期篩查中的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供了用于骨質(zhì)疏松癥早期篩查的分子標(biāo)記物，所述分子標(biāo)記物為ZNF800基因或該基因的表達(dá)蛋白及其片段、類似物和衍生物。

更進(jìn)一步地研究發(fā)現(xiàn)，所述ZNF800基因或該基因的表達(dá)產(chǎn)物在骨質(zhì)疏松癥患者生物學(xué)樣本中表達(dá)上調(diào)。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了所述分子標(biāo)記物在制備骨質(zhì)疏松癥早期篩查產(chǎn)品中的應(yīng)用。

優(yōu)選的，所述早期篩查產(chǎn)品包括基因水平的篩查產(chǎn)品和蛋白水平的篩查產(chǎn)品。

優(yōu)選的，所述基因水平的早期篩查產(chǎn)品是通過real-time PCR、Northern blot、Southern blot、基因芯片、原位雜交或RNA酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)方法來檢測ZNF800基因的表達(dá)水平；所述蛋白水平的早期篩查產(chǎn)品是通過免疫檢測、Western blotting或蛋白芯片來檢測ZNF800基因表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種用于骨質(zhì)疏松癥早期篩查的試劑，所述試劑包括檢測ZNF800基因表達(dá)水平的寡聚核苷酸或檢測ZNF800蛋白表達(dá)水平的抗體。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了一種用于骨質(zhì)疏松癥早期篩查的試劑盒，所述試劑盒包括檢測ZNF800基因或ZNF800蛋白表達(dá)水平的試劑。

優(yōu)選的，所述試劑盒包括檢測ZNF800基因的引物或檢測ZNF800蛋白的抗體。

優(yōu)選的，所述檢測ZNF800基因的引物包括SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的引物對(duì)。

優(yōu)選的，所述試劑盒的組分包括：

(1)組織樣本或血液中總RNA提取試劑：Trizol、氯仿、異丙醇和75％乙醇等。

(2)反轉(zhuǎn)錄試劑：逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、熱穩(wěn)定DNA聚合酶活性的酶、RNA酶抑制劑和T重復(fù)寡核苷酸Oligo dT。

(3)定量PCR試劑：PCR緩沖液、SYBR Green熒光染料、dNTPs組成的SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系，引物和RNase Free H₂O。

(4)正常標(biāo)準(zhǔn)品：所述的正常標(biāo)準(zhǔn)品采用正常人群中相應(yīng)基因表達(dá)水平位于中位值的人群，以其相應(yīng)基因通過特異性反轉(zhuǎn)錄引物擴(kuò)增反轉(zhuǎn)錄成的cDNA作為標(biāo)準(zhǔn)品。

本發(fā)明的有益效果如下：

本發(fā)明公開了一種與骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的基因ZNF800，并進(jìn)一步證實(shí)該ZNF800基因或該基因的表達(dá)蛋白及其片段、類似物和衍生物在骨質(zhì)疏松癥患者生物學(xué)樣本中表達(dá)上調(diào)。利用該基因在人群中進(jìn)行骨質(zhì)疏松癥的普查，解決了現(xiàn)有技術(shù)中篩查與診斷措施敏感性和特異性差的問題，能夠快速有效的做到骨質(zhì)疏松癥的早期篩查與診斷，而且為預(yù)測診斷骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展，甚至是為今后在生物學(xué)水平治療骨質(zhì)疏松癥提供了治療靶點(diǎn)和重要依據(jù)。

附圖說明

圖1本發(fā)明中實(shí)施例2中骨質(zhì)疏松癥患者ZNF800基因表達(dá)上調(diào)；

圖2本發(fā)明中實(shí)施例3中骨質(zhì)疏松癥患者ZNF800蛋白表達(dá)上調(diào)。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用的試劑可以商業(yè)購買得到。

實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常為本領(lǐng)域常規(guī)方法，如按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(第三版)(科學(xué)出版社，2002)中的所述條件，或按照試劑制造廠家所建議的條件。

本發(fā)明的發(fā)明人對(duì)26例骨質(zhì)疏松癥患者樣本及22例對(duì)照樣本進(jìn)行高通量測序，結(jié)合生物信息學(xué)方法進(jìn)行基因篩選，挑選出候選基因ZNF800，現(xiàn)有研究中并沒有ZNF800和骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的報(bào)道，進(jìn)一步，發(fā)明人進(jìn)行了分子生物學(xué)方法驗(yàn)證，證實(shí)了ZNF800在骨質(zhì)疏松癥患者生物學(xué)樣品中表達(dá)上調(diào)，其相關(guān)制劑可用于篩查骨質(zhì)疏松癥。

本發(fā)明的ZNF800基因是在本發(fā)明之前的已知基因，其基本信息如下：

Genbank登錄號(hào)：NCBI GeneID：168850，來源于人類基因組。

ZNF800(zinc finger protein 800，鋅指蛋白800，protein coding)，位于第7號(hào)染色體上。鋅指蛋白是一類對(duì)基因調(diào)控起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，具有手指狀結(jié)構(gòu)域，參與細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育，并與許多疾病的發(fā)生相關(guān)。ZNF800屬于C2H2型鋅指蛋白家族，包含7個(gè)C2H2型鋅指，參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。

本發(fā)明還采用RT-PCR方法和Western-Blot方法檢測上述基因在骨質(zhì)疏松癥患者和正常人群中的表達(dá)，并驗(yàn)證了該基因?yàn)楣琴|(zhì)疏松癥表達(dá)上調(diào)基因。

本發(fā)明的ZNF800基因的核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)已公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA作為模板，擴(kuò)增而得到有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次擴(kuò)增，然后再將多次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。

一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。

目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來編碼本發(fā)明的蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中的各種DNA分子(如載體)和細(xì)胞中。本發(fā)明蛋白的片段除了可用重組法產(chǎn)生之外，還可用固相技術(shù)通過直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Soliod-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85：2149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動(dòng)進(jìn)行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成儀(Foster City，CA)來自動(dòng)合成肽。可以分別化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長的分子。

本文使用的“骨質(zhì)疏松癥”未做說明時(shí)，一般特指原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥。

本文使用的“對(duì)照”指未顯示任何骨質(zhì)疏松癥癥狀(包括原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥和繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥)并且未診斷為骨質(zhì)疏松癥的個(gè)體或個(gè)體組。優(yōu)選地，所述對(duì)照個(gè)體未使用影響骨質(zhì)疏松癥的藥物。更優(yōu)選地，對(duì)照個(gè)體具有與測試樣本相比相似的性別、年齡和體重指標(biāo)(BMI)。根據(jù)本發(fā)明，“對(duì)照”還指分離自正常個(gè)體的樣品，包括分離自正常個(gè)體的總RNA或mRNA。取自對(duì)照個(gè)體的樣品可包括分離自樣本組織的RNA，其中RNA分離自樣本組織，所述樣本組織分離自組織移除時(shí)未診斷為骨質(zhì)疏松癥并且未顯示任何骨質(zhì)疏松癥癥狀的個(gè)體。

本文使用的術(shù)語“生物學(xué)樣品”包括但不限于血、血清、唾液、尿、滑液、軟骨、滑膜組織等樣品。用于本發(fā)明的生物學(xué)樣品得自任何受試者的任何組織樣品(如骨組織、椎間盤、關(guān)節(jié)突、脊髓、椎旁肌或血樣)或細(xì)胞樣品(如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞或血細(xì)胞樣品)均可以根據(jù)本發(fā)明方法使用?？梢詮闹蝎@得這些樣品并根據(jù)本發(fā)明方法使用這些樣品的受試者實(shí)例包括但不限于無癥狀受試者、表現(xiàn)或更多骨質(zhì)疏松癥癥狀的受試者、臨床診斷為患有骨質(zhì)疏松癥的受試者、易患骨質(zhì)疏松癥的受試者(如有骨質(zhì)疏松癥家族史的受試者、有骨質(zhì)疏松癥遺傳易感性的受試者以及生活方式使其易感骨質(zhì)疏松癥或提高患骨質(zhì)疏松癥可能性的受試者)、懷疑患有骨質(zhì)疏松癥的受試者、正接受骨質(zhì)疏松癥治療的受試者、患有骨質(zhì)疏松癥和非接受骨質(zhì)疏松癥治療的受試者、開業(yè)醫(yī)生(如醫(yī)師)確定為健康或無骨質(zhì)疏松癥的受試者(即正常)、已治愈骨質(zhì)疏松癥的受試者、正在控制其骨質(zhì)疏松癥的受試者和未診斷為骨質(zhì)疏松癥的受試者。

在根據(jù)本發(fā)明方法使用前，任選地(但優(yōu)選)將收集的生物學(xué)樣品保存在低溫如4℃下。在一些實(shí)施方案中，在第一時(shí)間根據(jù)本發(fā)明方法使用樣品的一部分，而將一個(gè)或多個(gè)剩余的樣品部分保存一段時(shí)間以備后用。該段時(shí)間可以是1小時(shí)或更長、1天或更長、1周或更長、1月或更長、1年或更長或不確定。就長期保存而言，可以使用本領(lǐng)域熟知的保存方法，例如在冷凍溫度(如低于-80℃)保存。在一些實(shí)施方案中，作為保存樣品的補(bǔ)充或替代，將分離的核酸或蛋白質(zhì)保存一段時(shí)間(如1小時(shí)或更長、1天或更長、1周或更長、1月或更長、1年或更長或不確定)以備后用。

實(shí)施例1高通量測序篩選差異表達(dá)基因

1、取樣

選取2012年10月到2015年12月期間在北京協(xié)和醫(yī)院骨科就診的骨質(zhì)疏松癥患者，病例組共收集26例，所有患者均有典型的臨床表現(xiàn)，經(jīng)骨密度(雙能X線)檢查確診。對(duì)照來源于同時(shí)期骨科住院的其他疾病患者，共收集22例。采集所有研究對(duì)象的血液樣本，編號(hào)后置-80℃低溫冰箱保存。本研究的所有臨床樣本，均對(duì)患者進(jìn)行知情告知并經(jīng)本醫(yī)院倫理委員會(huì)通過。

2、對(duì)血液樣本進(jìn)行總RNA提取

采用Trizol LS(Invitrogen：10296-010)對(duì)采集的血液樣本進(jìn)行RNA提取，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行，每組實(shí)驗(yàn)的具體操作如下：

取收集到的新鮮血液，加入3倍體積紅細(xì)胞裂解液，混勻后室溫放置10分鐘，10,000rpm離心1分鐘。徹底吸棄上清，收集白細(xì)胞沉淀。

(1)入1mLTrizol，室溫保存5分鐘；

(2)加氯仿0.2mL，用力振蕩離心管，充分混勻，室溫放置3-5分鐘；

(3)12000rpm高速離心15分鐘后吸取上層水相(吸70％)到另一新離心管管中，注意不要吸到兩層水相之間的界面。移入新管，加入等體積的-20℃預(yù)冷異丙醇，充分顛倒混勻，置于冰上10分鐘；

(4)12000rpm高速離15分鐘后小心棄掉上清液，按1mL/mL Trizol的比例加入75％DEPC乙醇洗漆沉淀(4℃保存)，洗漆沉淀物，振蕩混合，4℃下8000rpm離心2分鐘。棄去乙醇液體，室溫下放置2分鐘以充分晾干沉淀，加入DEPC處理過的水溶解沉淀；

(5)用Nanodrop2000紫外分光光度計(jì)測量RNA純度及濃度，凍存于-80℃。RNA質(zhì)量判定標(biāo)準(zhǔn)：RNA樣本的OD260/OD280值為1.7-2.2之間；總RNA電泳圖譜有清晰的28S、18S條帶；70℃水浴保溫1小時(shí)后的電泳圖譜與水浴保溫前的圖譜無明顯差異。

3、RNA樣品的質(zhì)量分析

RNA提取后瓊脂糖凝膠電泳，從電泳結(jié)果可以初步判定提取的RNA樣品質(zhì)量合格與否，是否可以用于進(jìn)一步的轉(zhuǎn)錄組分析。進(jìn)而通過NanoDrop1000分光光度計(jì)檢測RNA樣品的提取情況，RNA-seq測序的樣品要求：OD260/OD280為1.8-2.2。

4、高通量測序

測序平臺(tái)為Illumina公司的HiSeq 2500高通量測序平臺(tái)，進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組深度測序，測序后我們運(yùn)用Fast-QC(http：//www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)軟件對(duì)測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行整體評(píng)估，包括堿基的質(zhì)量值分布，質(zhì)量值的位置分布，GC含量，PCR duplication含量，kmer的frequency等。在差異基因表達(dá)分析時(shí)，根據(jù)得到的FPKM值，采用國際公認(rèn)算法EBSeq進(jìn)行差異篩選。其中，篩選時(shí)，LOG2FC＞1或＜-1，F(xiàn)DR＜0.05。為了更好的理解差異表達(dá)基因的功能，我們對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行了Gene Ontology和信號(hào)通路分析，并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋和蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡(luò)分析，鑒于以上數(shù)據(jù)分析的結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)我們篩選了差異表達(dá)基因ZNF800，該基因在骨質(zhì)疏松癥患者血液樣本中表達(dá)上調(diào)。

實(shí)施例2 RT-PCR驗(yàn)證骨質(zhì)疏松癥患者及對(duì)照血液中ZNF800基因表達(dá)情況

1、材料

選取2012年10月到2015年12月期間在北京協(xié)和醫(yī)院骨科就診的骨質(zhì)疏松癥患者10例，所有患者均有典型的臨床表現(xiàn)，經(jīng)骨密度(雙能X線)檢查確診。對(duì)照來源于同時(shí)期骨科住院的其他疾病患者，共收集8例。采集所有研究對(duì)象的血液樣本，編號(hào)后置-80℃低溫冰箱保存。本研究的所有臨床樣本，均對(duì)患者進(jìn)行知情告知并經(jīng)本醫(yī)院倫理委員會(huì)通過。

2、方法

2.1對(duì)血液樣本進(jìn)行總RNA提取，同實(shí)施例1的提取方法。

2.2逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA

采用 III Reverse Transcriptase(invitrogen，貨號(hào)18080-044)進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行，具體操作如下：

使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，用逆轉(zhuǎn)錄緩沖液對(duì)1μg總RNA進(jìn)行逆反錄合成cDNA。采用25μL反應(yīng)體系，每個(gè)樣品取1μg總RNA作為模板RNA。獲得的cDNA保存放-20℃冰箱備用。

2.3Real-Time PCR

2.3.1儀器及分析方法

用ABI 7500型熒光定量PCR儀，用2-^△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)相對(duì)定量分析。

2.3.2引物設(shè)計(jì)

采用在線引物設(shè)計(jì)軟件，基因序列參照NCBI：NM_176814.4(ZNF800)，內(nèi)參選GAPDH，引物設(shè)計(jì)后由invitrogen公司合成。引物序列如表1所示：

表1引物序列

操作過程如下：

(一)反應(yīng)體系：用Power Green PCR Master Mix(invitrogen，貨號(hào)4367659)進(jìn)行擴(kuò)增，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5°5min，(95℃15sec，60℃退火45sec，72℃35sec)×40個(gè)循環(huán)。

表2RealTime反應(yīng)體系

(二)引物篩選

將各樣本cDNA混合后，以此為模板進(jìn)行5倍梯度稀釋，稀釋后樣品各取2μL作模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)在60-95℃進(jìn)行融解曲線分析，根據(jù)擴(kuò)增效率高和溶解曲線單峰原則進(jìn)行引物篩選。

(三)樣品RealTime-PCR檢測

將各樣品cDNA 10倍稀釋后取2μL作模板，分別用目的基因引物和內(nèi)參基因引物進(jìn)行擴(kuò)增。同時(shí)在60-95℃進(jìn)行溶解曲線分析。

二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線拐點(diǎn)清楚，擴(kuò)增曲線整體平行性好，表明各反應(yīng)管的擴(kuò)增效率相近，極限平而無上揚(yáng)現(xiàn)在，曲線指數(shù)期斜率較大，說明擴(kuò)增效率較高；樣本擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線都是單峰，說明擴(kuò)增產(chǎn)物只有一條，為特異性擴(kuò)增；根據(jù)qRT-PCR的相對(duì)定量公式：2^-△△Ct×100％，比較ZNF800基因在骨質(zhì)疏松癥患者血液中和對(duì)照組血液中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：qRT-PCR擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定，其中ZNF800基因在骨質(zhì)疏松癥患者血液中的表達(dá)水平是對(duì)照組血液中的3.5倍，如圖1所示。以上結(jié)果驗(yàn)證了高通量轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)的整合分析ZNF800基因在骨質(zhì)疏松癥患者中表達(dá)上調(diào)的結(jié)果。

實(shí)施例3WB方法檢測骨質(zhì)疏松癥患者血液中ZNF800的蛋白表達(dá)水平

一、材料

收集10例行椎體后凸成形手術(shù)的骨質(zhì)疏松癥患者，術(shù)中獲取骨質(zhì)疏松癥患者病變椎體骨組織，取樣來源于2012年10月到2015年12月期間在北京協(xié)和醫(yī)院骨科就診的骨質(zhì)疏松癥患者，所有患者均有典型的臨床表現(xiàn)，經(jīng)骨密度(雙能X線)檢查確診。對(duì)照來源于同時(shí)期住院的外傷致脊柱爆裂性骨折患者，共收集8例，獲取正常椎體骨組織。采集所有研究對(duì)象的骨組織樣本，編號(hào)后置-80℃低溫冰箱保存。本研究的所有臨床樣本，均對(duì)患者進(jìn)行知情告知并經(jīng)本醫(yī)院倫理委員會(huì)通過。

二、方法

1、蛋白樣品制備及定量

1.1RIPA裂解液(Beyotime)進(jìn)行蛋白質(zhì)樣品制備，操作步驟如下：

將骨組織樣本自冰箱取出，用濾紙擦拭組織上的PBS溶液，稱取重量，并將骨組織置于機(jī)械組織勻漿器中，1∶10組織比裂解液的重量體積比例加入相應(yīng)體積的裂解液進(jìn)行勻漿，10000-14000g離心3-5分鐘，取上清液，按1∶1加入樣品緩沖液強(qiáng)力混勻后置于100度的水浴箱水浴加熱3-5分鐘，10000g離心10分鐘，取上清液，將其轉(zhuǎn)入另一潔凈的試管中。

1.2利用BCA蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行總蛋白定量

采用康為世紀(jì)微量BCA蛋白定量試劑盒(CW2011)，步驟見說明書。

2、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

1.1蛋白質(zhì)樣品變性：

(1)根據(jù)BCA蛋白質(zhì)濃度測定結(jié)果，每個(gè)凝膠加樣孔中加入相同質(zhì)量的總蛋白提取物。按照每1微升蛋白樣品加入0.25微升蛋白上樣緩沖液的比例，混合蛋白樣品和蛋白上樣緩沖液(5x)。

(2)100℃或沸水浴加熱3-5分鐘，以充分變性蛋白。冷卻到室溫后，直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)即可。

1.2膠板制備：

采用Bio-Rad公司的微型垂直板電泳裝置制備0.75mm厚的凝膠，照說明書安裝好玻璃板后，先在小燒杯中配制5mL 10％的分離膠，配方如下：

表3分離膠配方

混勻后立即灌膠，然后加1mL蒸餾水覆蓋，室溫下放置約30min待膠聚合后，用蒸餾水洗2-3次，再用濾紙吸干。然后制備2mL 5％的濃縮膠。

表4濃縮膠配方

混勻后立即灌膠，插入樣品梳，避免產(chǎn)生氣泡，待膠凝固后，取出樣品梳，后用蒸餾水和1x蛋白電泳緩沖液先后沖洗樣品孔。

1.3上樣及電泳

將凝膠板裝在電泳裝置上，內(nèi)槽中加滿1x蛋白電泳緩沖液，外槽中1x蛋白電泳緩沖液應(yīng)超過鉑絲，按順序上樣。在末端泳道中加入蛋白質(zhì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白梯度。電泳時(shí)藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。

3、蛋白質(zhì)印跡

(1)按照上述方法先進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白。

(2)預(yù)先用轉(zhuǎn)印緩沖液浸泡NC膜、濾紙、海棉墊。SDS-PAGE結(jié)束后取出凝膠，去除濃縮膠，在Tris/甘氨酸緩沖液中漂洗數(shù)秒，然后置于轉(zhuǎn)印緩沖液中浸泡15-30min。打開電轉(zhuǎn)印夾，每側(cè)墊上一塊專用的用轉(zhuǎn)印緩沖液浸泡透的海棉墊，再各放一塊轉(zhuǎn)印液浸透的濾紙，濾紙與海棉墊大小相同或與NC膜，凝膠大小相同均可，將凝膠平放在陰極側(cè)濾紙上，最后將NC膜平放在凝膠上，去除氣泡，夾好電轉(zhuǎn)印夾。在電泳槽加滿電轉(zhuǎn)印液，插入電轉(zhuǎn)印夾，將電泳槽放入冰箱內(nèi)(電轉(zhuǎn)印液之前要放入冰箱內(nèi)預(yù)冷)，連接好電極，接通電流，轉(zhuǎn)印夾的NC膜應(yīng)對(duì)電泳槽的正極。

(3)封閉：用1xTBS漂洗一次。加入含5％的無脂奶粉TBS封閉緩沖液，置于振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行封閉；

(4)一抗雜交：棄封閉液，加入用一抗稀釋液稀釋的一抗(ZNF800polyclonal antibody(PAB21502-100UL))雜交溶液，置于4℃雜交過夜，第二天在振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行雜交；

(5)回收一抗雜交液，用TBST洗膜3次；

(6)棄TBST，加入用封閉緩沖液稀釋的二抗(Goat Anti-Rabbit IgG，HRP Conjugated(CW0103))雜交溶液，置于振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行雜交；

(7)棄二抗溶液，用TBST洗膜3次；

(8)ECL化學(xué)發(fā)光及圖像采集和分析：按照高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(康為世紀(jì)貨號(hào)CW0049B)，具體步驟參照說明書。

(9)以β-Actin作為內(nèi)參進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，以對(duì)照組正常關(guān)節(jié)突軟骨組織樣本中ZNF800作為參照樣本，計(jì)算患者病變骨組織樣本中ZNF800蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如圖2所示，與對(duì)照組正常骨組織樣本中ZNF800相比，患者病變骨組織樣本中ZNF800蛋白的表達(dá)量顯著上調(diào)。

實(shí)施例4骨質(zhì)疏松癥檢測試劑盒

基于實(shí)施例2得到的引物組，組裝本發(fā)明所述的用于骨質(zhì)疏松癥早期篩查的試劑盒，所述試劑盒包括特異擴(kuò)增ZNF800基因的引物對(duì)如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示，和特異擴(kuò)增管家基因(GAPDH)的引物對(duì)如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；還包括SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系，如PCR緩沖液、SYBR Green熒光染料、dNTPs。所述PCR緩沖液的成分為25mM KCl，2.5mM MgCl₂，200mM(NH₄)₂SO₄。通過對(duì)引物濃度和退火溫度的優(yōu)化，最終確定反應(yīng)體系如表5所示：

表5PCR反應(yīng)體系

最佳反應(yīng)條件為：95°預(yù)變性5min，(95℃變性15sec，60℃退火45sec，72℃延伸35sec)×40個(gè)循環(huán)，72℃延伸15min。

利用上述試劑盒中的試劑對(duì)受試者樣本進(jìn)行RNA提取、反轉(zhuǎn)錄成cDNA、按照最佳反體系與條件進(jìn)行PCR反應(yīng)，使用試劑盒中的正常標(biāo)準(zhǔn)品作為QPCR定量檢測中的對(duì)照cDNA，檢測受試者樣本中ZNF800的表達(dá)量相對(duì)正常人中ZNF800表達(dá)量的變化，分析檢測結(jié)果，樣本和對(duì)照間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異顯著，判為檢測樣本陽性。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。