本發(fā)明具體涉及一種犬博卡病毒的通用型PCR檢測(cè)引物、試劑盒和檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

博卡病毒（Bocavirus）是細(xì)小病毒科細(xì)小病毒亞科的一個(gè)屬，為單股線狀無(wú)囊膜的DNA病毒，基因組大小在5.4kb左右。20世紀(jì)60年代初首次在牛群發(fā)現(xiàn)。近年來(lái)，隨著病毒宏基因組及高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，人博卡病毒、豬博卡病毒、犬博卡病毒、黑猩猩博卡病毒、海獅博卡病毒等被前后被發(fā)現(xiàn)。然而，在遺傳學(xué)上，它們之間的遺傳進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，基因組同源性低于60%。此外，也未發(fā)現(xiàn)博卡病毒存在跨種傳播的事實(shí)。

目前的研究表明，犬博卡病毒（Canine Bocavirus，CBoV）與犬的腹瀉和呼吸道疾病發(fā)生有一定的相關(guān)性。在北美、歐洲、南韓等地區(qū)報(bào)道的病例較多，在我國(guó)，除了香港外，大陸地區(qū)很少有犬博卡病毒的病例報(bào)道?，F(xiàn)有文獻(xiàn)表明，犬博卡病毒體外分離培養(yǎng)難度較大，而且，犬博卡病毒基因型多，有犬博卡病毒1型（CBoV1）、犬博卡病毒2型（CBoV2）和犬博卡病毒3型（CBoV3），基因型間同源性較低。所以研發(fā)犬博卡病毒PCR通用檢測(cè)試劑盒對(duì)該病的快速確診有著重大意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于運(yùn)用分子生物學(xué)、生物信息學(xué)等方法進(jìn)行引物設(shè)計(jì)、序列比對(duì)及反應(yīng)體系優(yōu)化，組建犬博卡病毒通用性檢測(cè)試劑盒以及檢測(cè)方法。該試劑盒為犬博卡病毒診斷提供了一種快速檢測(cè)方法，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)犬博卡病毒診斷方法的空白，為犬博卡病毒的診斷、調(diào)查、防控及凈化提供一定的技術(shù)支持與幫助。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種犬博卡病毒的通用型PCR檢測(cè)引物，其核苷酸序列如下所示：

CBoV-F: AARAGRAARCTYTATTTTGC（SEQ ID NO:1）；

CBoV-R: TGCCAGTCTTGWGGHGARAA（SEQ ID NO:2）。

一種犬博卡病毒的通用型PCR檢測(cè)試劑盒，該試劑盒含有上述所述的引物。

一種犬博卡病毒的通用型PCR檢測(cè)方法，包括下列步驟：

1)從樣品中提取病毒核酸；

2)以核酸為模板，用上述引物對(duì)CBoV-F和CBoV-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；

3)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果，確定病毒類型。

優(yōu)選的，步驟2）中PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為：2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，ddH₂O 8.5μl，DNA模板 3μL，引物CBoV-F 0.5μL，引物CBoV-R 0.5μL，總體積為25μL。

優(yōu)選的，步驟2）中PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明的犬博卡病毒的通用型PCR檢測(cè)引物、試劑盒以及檢測(cè)方法，不僅僅用于寵物犬的疾病診斷和檢測(cè)，還可以應(yīng)用于野生犬、肉用犬、實(shí)驗(yàn)犬等的檢測(cè)。

本發(fā)明所制備的犬博卡病毒通用型PCR檢測(cè)試劑盒，具有特異性強(qiáng)、敏感性高、省時(shí)省力等優(yōu)點(diǎn)。

本發(fā)明PCR檢測(cè)方法為犬博卡病毒的診斷提供一種快速檢測(cè)方法，填補(bǔ)國(guó)內(nèi)犬博卡病毒診斷方法的空白，為犬博卡病毒的診斷、調(diào)查、防控及凈化提供一定的技術(shù)支持與幫助。

附圖說(shuō)明

圖1是犬博卡病毒通用型PCR檢測(cè)試劑盒特異性試驗(yàn)結(jié)果；泳道M：DNA Marker 2000；泳道1：犬瘟熱病毒；泳道2：犬細(xì)小病毒；泳道3：犬傳染性肝炎病毒；泳道4：犬副流感病毒；泳道5：貓瘟熱病毒；泳道6：犬博卡病毒。

圖2是犬博卡病毒通用型PCR檢測(cè)試劑盒敏感性試驗(yàn)結(jié)果；其中泳道M：DNA Marker 2000；泳道1-11分別為陽(yáng)性質(zhì)粒的10⁰倍、10¹倍、10²倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍、10⁶倍、10⁷倍、10⁸倍、10⁹倍、10¹⁰倍倍比稀釋結(jié)果。

具體實(shí)施方式

材料和方法：

犬博卡病毒陽(yáng)性重組質(zhì)粒，犬細(xì)小病毒（CPV）、犬瘟熱病毒（CDV）、犬傳染性肝炎病毒（ICHV）、犬副流感病毒（CPIV），貓瘟熱病毒（FDV）細(xì)胞分離上清液等由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所制備保存。此外，犬博卡病毒陽(yáng)性毒株由香港大學(xué)劉嘉佩教授饋贈(zèng)。

主要試劑：

DNA提取試劑盒、PCR試劑購(gòu)自北京天根公司，DNA Marker 2000購(gòu)自Takara公司。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。

實(shí)施例1 PCR引物設(shè)計(jì)

根據(jù)犬博卡病毒1型、2型和3型基因序列設(shè)計(jì)出擴(kuò)增犬博卡病毒保守基因序列的引物對(duì)CBoV-F和CBoV-R，其堿基序列如下所示。

CBoV-F: AARAGRAARCTYTATTTTGC（SEQ ID NO:1）；

CBoV-R: TGCCAGTCTTGWGGHGARAA（SEQ ID NO:2）。

實(shí)施例2 病毒DNA提取及PCR分析

1）DNA 的提取

按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行病毒DNA提取。

2）犬博卡病毒PCR檢測(cè)試劑盒

以犬博卡病毒（犬博卡病毒2型）DNA為PCR的模板，建立犬博卡病毒PCR檢測(cè)試劑盒。PCR反應(yīng)體系為：2×Taq PCR Master Mix 12.5μL，ddH₂O 8.5μl，DNA模板 3μL，引物CBoV-F 0.5μL，引物CBoV-R 0.5μL，總體積為25μL。

PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。

結(jié)果觀察：取10μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。如果出現(xiàn)長(zhǎng)度為400bp左右的目標(biāo)條帶，則判定為犬博卡病毒。

實(shí)施例3 特異性試驗(yàn)

以實(shí)施例2中優(yōu)化好的通用型PCR試劑盒涉及的反應(yīng)體系及條件，對(duì)犬博卡病毒、犬細(xì)小病毒、犬瘟熱病毒、犬傳染性肝炎病毒、犬副流感病毒，貓瘟熱病毒等進(jìn)行PCR擴(kuò)增，來(lái)檢測(cè)該試劑盒的特異性。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1凝膠電泳結(jié)果顯示，只有犬博卡病毒陽(yáng)性重組質(zhì)粒出現(xiàn)預(yù)期大?。?00bp左右）的擴(kuò)增目的條帶，而犬細(xì)小病毒、犬瘟熱病毒、犬傳染性肝炎病毒、犬副流感病毒，貓瘟熱病毒等未呈現(xiàn)條帶，表明該試劑盒具有較好的特異性。

實(shí)施例4 敏感性試驗(yàn)

選取犬博卡病毒陽(yáng)性重組質(zhì)粒為模板（濃度為480.62ng/μL)，進(jìn)行倍比稀釋（分別為10⁰倍、10¹倍、10²倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍、10⁶倍、10⁷倍、10⁸倍、10⁹倍、10¹⁰倍稀釋），來(lái)測(cè)定該方法的敏感性。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2結(jié)果顯示：泳道6的結(jié)果為最高的稀釋倍數(shù)10⁵，即優(yōu)化后的試劑盒敏感性為4.8062pg/μL。

實(shí)施例5 臨床樣品檢測(cè)

從廣州周邊地區(qū)采集臨床犬糞便樣本425份，進(jìn)行PCR檢測(cè)。

經(jīng)檢測(cè)，425份臨床樣本中有1份犬博卡病毒陽(yáng)性樣本，進(jìn)一步經(jīng)核酸測(cè)序，確定該樣本感染犬博卡病毒2型（CBoV2）。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所

<120> 一種犬博卡病毒的通用型PCR檢測(cè)引物、試劑盒和檢測(cè)方法

<130> CBoV2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 1

aaragraarc tytattttgc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 2

tgccagtctt gwgghgaraa 20