本發(fā)明屬于多肽藥物合成的技術領域，特別涉及一種帕西瑞肽的合成方法。
背景技術：
中文名：帕西瑞肽
英文名：Pasireotide
結構式：
分子式：C58H66N10O9
帕西瑞肽(Pasireotide)是一種可注射的環(huán)六肽生長抑素類似物,適用于未進行垂體手術或手術未治愈的庫欣氏病成年患者的治療。同奧曲肽相比，帕西瑞肽有更長的半衰期、能與更多受體結合，抑制胰腺分泌，抑制腸道蛋白水解酶的活性，通過這些機制來降低胰腺術后并發(fā)癥。美國紐約Memorial Sloan-Kettering癌癥中心的學者進行了一項研究，提示帕西瑞肽能明顯減少胰腺切除術后胰瘺的發(fā)生。
現(xiàn)有的帕西瑞肽合成方法產品收率低，副產物多，生產成本高，不利于帕西瑞肽的大規(guī)模生產。CN201310370228.5的合成方法中，以空間位阻較大的(4R)-(2-氨基乙基氨基甲酰氧基)-脯氨酰為起始原料與樹脂載體縮合，雖然降低了消旋的比率，但同時也大大降低了氨基酸的縮合效率，從源頭降低了產品的收率，并且環(huán)化方法復雜，周期長，不易中控，容易產生較多的副產物。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種帕西瑞肽的合成方法，該合成方法反應條件溫和、反應效率高、成本低、具有生產帕西瑞肽粗肽產品的廣泛應用前景，以用于大規(guī)模生產帕西瑞肽。
本發(fā)明的目的可以通過以下技術方案實現(xiàn)：
一種帕西瑞肽的合成方法，包括如下步驟：
(1)以2-Cl-Resin為起始樹脂載體，選擇縮合反應的起始氨基酸，通過固相合成法依次連接帕西瑞肽序列中相對應的氨基酸，得到Fmoc-帕西瑞肽前體肽Ⅰ-2-Cl-Resin，如下：
Fmoc-(4-Boc-NH-C2H4-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(4-B zl)-Phe-2-Cl-Resin；
(2)將Fmoc-帕西瑞肽前體肽Ⅰ-2-Cl-Resin全保護切割，得到帕西瑞肽前體肽Ⅱ，如下：
(4-Boc-NH-C2H4-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(4-Bzl)-P he；
(3)帕西瑞肽前體肽Ⅱ進行液相環(huán)化，得到帕西瑞肽前體肽Ⅲ，產品如下：
(4)帕西瑞肽前體肽Ⅲ進行切割沉降反應，得到帕西瑞肽粗肽產品；
(5)帕西瑞肽粗肽產品用反相高效液相色譜法純化、凍干，得到帕西瑞肽純品多肽如下：
步驟(1)所述縮合反應的起始氨基酸為Fmoc-Phe-OH，反應中以DIC/HOBt為縮合劑和活化試劑，以20％Pip/DMF溶液為脫保護試劑，進行多肽的連續(xù)縮合反應。
步驟(1)所述固相合成法依次縮合的Fmoc-保護氨基酸為：Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Tyr(4-Bzl)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Phg-OH、Fmoc-(4-Boc-NH-C2H4-NH-CO-O)-Pro-OH，縮合反應中氨基酸投料量為1.5倍所投樹脂摩爾數(shù)，縮合反應溫度為28℃。
步驟(2)所述全保護切割試劑為DCM：TFE＝4：1體積比的混合溶液，反應液體積為反應器容積的1/3-1/2。
步驟(3)所述液相環(huán)化的環(huán)化液為：樣品：HOBT：PyBop：DIEA＝1:1:1.2:3(摩爾比)，環(huán)化條件為28℃恒溫反應48h后旋蒸凍干。
步驟(4)所述切割沉降反應，所用切割試劑的100ml配方為：95ml TFA+2.5ml H2O+2.5ml TIS，切割液體積為反應器容積的1/2，樹脂切割兩次，將切割液分別吹入到冰乙醚中，離心沉淀去上清，重復操作3次得到帕西瑞肽粗肽產品。
步驟(5)所述純化選用C18，5um制備柱進行反相高效液相色譜純化，以B.Cone/％(2→70)，0→70min的梯度程序進行多肽的分離提純。
本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明采用Fmoc固相合成法，以2-Cl-Resin為固相載體，以DIC/HOBt為縮合劑，依次縮合帕西瑞肽氨基酸序列中相對應的氨基酸，采用特有的多肽環(huán)化技術進行環(huán)化，切割沉降、凍干后得到帕西瑞肽純品多肽；大大簡化了工藝流程，提高了產品的收率，具有可觀的經濟適用價值和廣泛的應用前景。
具體實施方式
通過下述實施例將有助于理解本發(fā)明，但不能限制本發(fā)明的內容。對于本發(fā)明所屬技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干簡單替換或推演，都視為屬于本發(fā)明的保護范圍。
實施例一Fmoc-帕西瑞肽前體肽Ⅰ-2-Cl-Resin的合成
1.2-Cl-Resin的溶脹
稱量取代度為0.64mmol/g的2-Cl-Resin 1g，從開口端加入至多肽合成反應器中，取DCM試劑加入至反應器中，使樹脂完全浸沒在DCM溶劑中，與溶劑充分接觸，溶脹0.5h。
2.Fmoc-帕西瑞肽前體肽Ⅰ-2-Cl-Resin的合成
Fmoc-帕西瑞肽前體肽Ⅰ-2-Cl-Resin為：
Fmoc-(4-Boc-NH-C2H4-NH-CO-O)-Pro-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(4-B zl)-Phe-2-Cl-Resin
本實施例使用的保護氨基酸從樹脂起算第1-6個氨基酸相對應的保護氨基酸及分子量如下表所示：
本發(fā)明中一些常用的縮寫具有以下含義：
Fmoc：芴甲氧羰基
Boc：叔丁氧羰基
4-Bzl：芐基
DMF：N,N-二甲基甲酰胺
DCM：二氯甲烷
Pip：六氫吡啶
TFA：三氟醋酸
TFE：三氟乙醇
TIS：三異丙基硅烷
DIC：N,N-二異丙基碳化二亞胺
DIEA：N,N-二異丙基乙胺
HOBT：1-羥基苯并三唑
PyBop：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷
(1)Fmoc-Phe-2-Cl-Resin的合成
稱取116mg Fmoc-Phe-OH和122mg HOBT放于10ml離心管中，加3ml DCM將其溶解，再用滴管向溶液中加DIEA活化20s，混合均勻。最后將混合液加到抽干的反應器中反應50min。
(2)Fmoc-Phe-2-Cl-Resin的封頭反應
配制甲醇：DIEA＝1:1(體積比)的混合液2ml，將其加入到抽干的反應器中，置于20-30r/min的搖床上搖20min。
(3)樹脂的洗滌方法
用真空泵將反應器中的脫保護溶液抽干，然后加入1/3-1/2反應器體積的DMF溶液，置于30r/min的脫色搖床上搖1min，抽干反應器中溶液再加入DMF洗滌，重復操作3次。
(4)脫除Fmoc保護基
加入1/3-1/2反應器體積的20％哌啶/DMF脫保護溶液到抽干的反應器中，置于30r/min的脫色搖床上搖晃反應20min。
(5)保護氨基酸的活化方法
以Fmoc-Tyr(4-Bzl)-Phe-2-Cl-Resin的縮合為例，稱取585mg Fmoc-Tyr(4-Bzl)-OH和122mg HOBT放于10ml離心管中，加入3mlDMF將其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均勻得到活化的保護氨基酸溶液。
(6)Fmoc-帕西瑞肽前體肽Ⅰ-2-Cl-Resin的合成
將上述活化的保護氨基酸溶液加到抽干的反應器中，再將反應器置于28℃的恒溫震蕩器中反應30-40min，然后洗滌，脫除Fmoc保護基再洗滌。采用上述同樣方法，依次縮合第3-6個Fmoc-保護氨基酸，即得到Fmoc-帕西瑞肽前體肽Ⅰ-2-Cl-Resin。
實施例二帕西瑞肽前體肽的環(huán)化
(1)帕西瑞肽前體肽Ⅱ的合成
配置全保護切割試劑DCM：TFE＝4：1(體積比)混合溶液5ml，加入到反應器中搖晃反應40min，轉速20r/min，將切割液旋蒸凍干，得到帕西瑞肽前體肽Ⅱ。
(2)配置環(huán)化反應液
用DCM分別溶解樣品和縮合劑(HOBT、PyBop)，將縮合劑和DIEA緩慢加入到溶解的樣品中，混勻。樣品：HOBT：PyBop：DIEA＝1:1:1.2:3(摩爾比)。
(3)帕西瑞肽前體肽Ⅲ的環(huán)化
將環(huán)化反應液置于恒溫搖床中反應48h，溫度28℃，轉速90r/min；然后將反應液旋蒸、凍干，得到帕西瑞肽前體肽Ⅲ。
實施例三帕西瑞肽的合成制備
(1)帕西瑞肽前體肽Ⅲ的切割沉降
配置5ml切割試劑4.75ml TFA+0.125ml H2O+0.125ml TIS，加入到凍干的帕西瑞肽前體肽Ⅲ中，是樣品完全溶解，然后置于脫色搖床上搖晃反應30min，速度20r/min。切割結束后，加入約5ml冰乙醚至10ml離心管中，將反應器中溶液經砂芯過濾到冰乙醚中，蓋上離心管蓋子，上下震蕩離心管，混合均勻。將離心管放入離心機中，3000r/min，3min，離心棄上清，重復操作3次得到帕西瑞肽粗肽產品。
(2)帕西瑞肽粗肽的純化
將樣品溶解并過濾，采用流動相：A 0.1％乙酸/水，B 0.1％乙酸/乙腈，在214nm下按照如下程序進樣制備純化：
(3)帕西瑞肽純品多肽的收率
稱量凍干后的帕西瑞肽純品，質量為1035.3mg，經分析計算，產品純度為99％，其純品收率為83.8％，比現(xiàn)有技術僅30-40％的收率有大幅度提高。
以上內容僅僅是對本發(fā)明所作的舉例和說明，所屬本技術領域的技術人員對所描述的具體實施例做各種各樣的修改或補充或采用類似的方式替代，只要不偏離發(fā)明或者超越本權利要求書所定義的范圍，均應屬于本發(fā)明的保護范圍。