本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，涉及一種丁酸梭菌及丁酸梭菌活菌制劑生產(chǎn)方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

目前隨著人們養(yǎng)殖規(guī)模的進(jìn)一步擴(kuò)大，為了提高養(yǎng)殖效益，各種抗生素做為促生長劑的大量使用已經(jīng)成為一種普遍現(xiàn)象，其弊端日益凸顯，如藥物殘留、耐藥病原菌的報道、動物腸道菌群的失衡、環(huán)境污染等，嚴(yán)重威脅到了人類的健康及食品安全。微生態(tài)制劑做為一種安全、高效、無污染及無耐藥性的抗生素替代產(chǎn)品逐步做為防病、促生長制劑應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)。

微生態(tài)制劑是益生菌發(fā)酵及后加工而得到的微生物菌體及其代謝產(chǎn)物的生物制劑及活菌制劑。因此具有維持腸道微生態(tài)平衡、提高詞料轉(zhuǎn)化效率，改善畜禽生長性能、提高免疫功能、抗氧化和防癌及改善環(huán)境，降低有害物質(zhì)的生成等作用，日益受到養(yǎng)殖業(yè)所追捧。

丁酸梭菌(Clostridium butyricum)，首次是由日本千葉醫(yī)科大學(xué)宮入近治博士首次發(fā)現(xiàn)并報道的，因此丁酸梭菌也被叫做宮入菌，同時日本也成為了研究丁酸梭菌歷史最長的國家。丁酸梭菌(Clostridium butyricum)為革蘭氏陽性菌，菌體呈直或者彎形，(0.5~1.7x2.4~7.6μm)，單個或者成對、短鏈，有鞭毛可運動，菌體可形成芽孢，中部膨大成梭形，芽孢偏心成次端生、無孢子外壁或附屬絲；菌落多呈圓形，較小，凸起，乳白色，丁酸梭菌屬于厭氧菌，液體發(fā)酵時能夠產(chǎn)生丁酸、丙酸、乙酸，同時還能夠產(chǎn)生氫氣等，有研究發(fā)現(xiàn)丁酸梭菌產(chǎn)生的丁酸、乙酸對豬、雞等動物腸道內(nèi)的益生菌如雙歧桿菌，乳酸菌等的生長繁殖具有很好的促進(jìn)作用，而對腸道有害菌如大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、傷寒沙門氏菌等都具有很好的抑制作用，代謝產(chǎn)生的丁酸直接被腸道絨毛所利用，促進(jìn)了腸道上皮組織細(xì)胞的再生和修復(fù)，代謝產(chǎn)生的氫氣對機體肝、腎器官的氧化損傷具有修復(fù)作用，同時可以增強機體解毒功能。因此丁酸梭菌被人們稱為“腸道健康第一菌”。

專利CN201110116927，CN201110126498等涉及到了丁酸梭菌的生產(chǎn)加工方法，但這些方法普遍存在培養(yǎng)基成分復(fù)雜，發(fā)酵成本高，不適合工業(yè)化生產(chǎn)問題。CN201110454790，CN201310082656、CN201310083900、 CN201410469885等涉及到了丁酸梭菌的應(yīng)用，但未涉及到不同劑量丁酸梭菌對豬、蛋雞、肉雞生產(chǎn)性能的影響。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明從健康豬腸道分離篩選了一株丁酸梭菌(Clostridium butyricum)LXKJ-1，其活性高，抗逆性強，同時找到了適宜其生長、繁殖的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，發(fā)酵所得培養(yǎng)物活菌數(shù)高、芽孢率高，該發(fā)明所使用的培養(yǎng)基成分簡單，成本低廉，很適合工廠的規(guī)模化生產(chǎn)。丁酸梭菌(Clostridium butyricum)LXKJ-1耐酸、耐堿、耐高溫，產(chǎn)丁酸能力強，對大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄桿菌、單增李斯特菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等動物病原菌都具有抑制作用，可預(yù)防豬、雞由大腸桿菌、沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等引起的腹瀉，改善腸道菌群平衡，促進(jìn)豬、雞生長，提高蛋雞產(chǎn)蛋率和蛋重，改善蛋殼質(zhì)量，降低料蛋比。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一種丁酸梭菌，名稱為 LXKJ-1，分類名稱為：丁酸梭菌LXKJ-1 Clostridium butyricum LXKJ-1，保藏編號為：CCTCC NO:M201613，保藏日期：2016年3月24日，保藏地址為：中國，武漢，武漢大學(xué)，保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

一種丁酸梭菌LXKJ-1制備的丁酸梭菌活菌制劑。

一種丁酸梭菌活菌制劑制備方法，包括以下步驟：

①將丁酸梭菌(Clostridium butyricum)LXKJ-1其保藏在甘油管中，冷凍保藏，通過劃線法接入斜面培養(yǎng)基，在厭氧條件下，35～37 ℃培養(yǎng)20～24h，用無菌生理鹽水洗下芽孢懸液，作為原始菌液；

②將原始菌液為菌種進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，其具體步驟如下：

將1體積的菌懸液接入到20體積的一級種子培養(yǎng)基中，于1 L藍(lán)蓋試劑瓶中，厭氧條件下、35～37 ℃培養(yǎng)8～12 h，做為一級種子液；

將1體積的一級種子液接入到10體積的二級種子培養(yǎng)基中，于20 L發(fā)酵罐中，氮氣環(huán)境下、35～37 ℃培養(yǎng)8～12 h，作為二級種子液；

將二級種子液移入20倍體積的三級發(fā)酵培養(yǎng)基中，于200 L發(fā)酵罐中，氮氣環(huán)境下、35～37 ℃培養(yǎng)20～24 h，即得到丁酸梭菌(Clostridium butyricum)LXKJ-1的培養(yǎng)物；

③采用高速離心法對培養(yǎng)物進(jìn)行菌體收集，離心收集的菌泥；

④按1:1～5的比例添加5～20%的脫脂奶粉懸液、蔗糖、乳糖、海藻糖、麥芽糊精、山梨醇、甘油中的一種或一種以上的組合作為凍干保護(hù)劑，采用冷凍干燥法制備凍干菌體；

⑤使用葡萄糖、淀粉、石粉、沸石粉、豆粕粉、玉米芯粉、麩皮粉中的一種或一種以上的組合作為輔料對菌粉進(jìn)行稀釋，根據(jù)需要，配制成不同活菌數(shù)的丁酸梭菌活菌制劑。

進(jìn)一步地，上述斜面培養(yǎng)基為：葡萄糖1.2%， L-半胱氨酸 0.03%，硫代乙醇酸鈉0.03%，K₂HPO₄ 0.2%，酵母浸粉 0.3%，大豆蛋白胨 0.5%，蛋白胨 1%，胰蛋白胨 1%，NaCl 0.3%，海藻酸鈉0.5%，瓊脂 2%，pH 6.5～7.0。

進(jìn)一步地，上述一級種子培養(yǎng)基為：葡萄糖5～30 g/L，L-半胱氨酸 0.1～5 g/L，硫代乙醇酸鈉 0.1～5 g/L，K₂HPO₄ 0.1～5 g/L，酵母浸粉 1～10 g/L，大豆蛋白胨 5～20 g/L，NaCl 1～10 g/L，海藻酸鈉 1～10 g/L，pH 6.5～7.0；

所述二級種子培養(yǎng)基為：蛋白胨10～40 g/L，豆餅粉1～5 g/L，葡萄糖10～30 g/L，KNO₃ 0.5～2.0 g/L，K₂HPO₄ 0.5～2.0 g/L，MgSO₄ 0.1～0.5 g/L，MnSO₄ 0.1～0.5 g/L，L-半胱氨酸 0.1～1.0 g/L，海藻酸鈉 1.0～10 g/L，尿素 1.0～5.0 g/L，CaCO₃ 1.0～10 g/L，pH 6.5～7.0；

所述三級發(fā)酵培養(yǎng)基為：玉米粉10～40 g/L，豆餅粉1～5 g/L，胰蛋白胨10～40 g/L，葡萄糖10～40 g/L，NH₄NO₃ 0.5～2.0 g/L，K₂HPO₄ .5～2.0 g/L，MgSO₄ 0.1～0.5 g/L，MnSO₄ 0.1～0.5 g/L，L-半胱氨酸 0.1～1.0 g/L，海藻酸鈉 1.0～10 g/L，尿素 1.0～5.0 g/L，CaCO₃ 1.0～10 g/L，pH6.5～7.0；

以上所有的培養(yǎng)基在使用前都需要蒸汽滅菌（121 ℃，30 min），冷卻待用。

一種上述丁酸梭菌或上述的丁酸梭菌制劑在制備畜禽飼料微生物添加劑中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，上述酸梭菌活菌制劑用于斷奶仔豬提高生產(chǎn)性能和降低腹瀉率，并顯著降低盲腸中大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量。

進(jìn)一步地，上述丁酸梭菌活菌制劑用于蛋雞提高生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)，增加肉雞盲腸中乳酸菌和雙歧桿菌的數(shù)量及降低大腸桿菌數(shù)量。

進(jìn)一步地，上述丁酸梭菌活菌制劑用于肉雞提高肉雞成活率，降低腹瀉率，促進(jìn)生長，增加肉雞盲腸中乳酸菌和雙歧桿菌的數(shù)量及降低大腸桿菌數(shù)量。

本發(fā)明從健康豬腸道分離篩選了一株丁酸梭菌(Clostridium butyricum)LXKJ-1，其活性高，抗逆性強，同時找到了適宜其生長、繁殖的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，發(fā)酵所得培養(yǎng)物活菌數(shù)高、芽孢率高，該發(fā)明所使用的培養(yǎng)基成分簡單，成本低廉，很適合工廠的規(guī)模化生產(chǎn)。丁酸梭菌(Clostridium butyricum)LXKJ-1耐酸、耐堿、耐高溫，產(chǎn)丁酸能力強，對大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄桿菌、單增李斯特菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等動物病原菌都具有抑制作用，可預(yù)防豬、雞由大腸桿菌、沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等引起的腹瀉，改善腸道菌群平衡，促進(jìn)豬、雞生長，提高蛋雞產(chǎn)蛋率和蛋重，改善蛋殼質(zhì)量，降低料蛋比。

本發(fā)明提供的丁酸梭菌具有耐酸、耐堿、耐高溫的特征。pH值1.0-4.0仍能存活，pH值5.0-12.0時均能生長，最適pH值為6.0-7.0；體外80℃干熱處理10min、90℃干熱處理10min、100℃干熱處理5min芽孢存活率100%。

本發(fā)明提供的丁酸梭菌產(chǎn)丁酸能力強，對大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄桿菌、單增李斯特菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等動物病原菌都具有抑制作用。

附圖說明

圖1丁酸梭菌(Clostridium butyricum) LXKJ-1的培養(yǎng)菌落照片（該菌株菌落呈圓形，乳白色，菌落突起）；

圖2丁酸梭菌(Clostridium butyricum) LXKJ-1的芽孢照片(芽孢呈橢圓形、芽孢壁厚)；

圖3丁酸梭菌(Clostridium butyricum) LXKJ-1的分類學(xué)地位與系統(tǒng)發(fā)育樹；

圖4丁酸梭菌離心上清液對產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌作用對比圖；

附圖1中的丁酸梭菌編號為： LXKJ-1，分類名稱為：丁酸梭菌LXKJ-1 Clostridium butyricum LXKJ-1，保藏編號為：CCTCC NO:M201613，保藏日期：2016年3月24日，保藏地址為：中國，武漢，武漢大學(xué)，保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

具體實施方式

下面通過具體實施方式的詳細(xì)描述來進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但并不是對本發(fā)明的限制，僅僅作示例說明。

實施例一丁酸梭菌(Clostridium butyricum) LXKJ-1的分離與鑒定

丁酸梭菌(Clostridium butyricum) LXKJ-1分離于健康豬的腸道中，首先將采集的樣品用生理鹽水稀釋后在80 ℃水浴加熱10 min，以殺死非芽孢菌；然后接種于斜面培養(yǎng)基上，在36 ℃厭氧罐培養(yǎng)24-30 h，通過菌落形態(tài)和菌體形態(tài)對菌株進(jìn)行初步鑒定，從中挑選出培養(yǎng)特征、菌落形態(tài)和菌體形態(tài)符合丁酸梭菌特征的菌株連續(xù)劃線純化培養(yǎng)三代，分別標(biāo)記編號進(jìn)入下一步鑒定和篩選。

進(jìn)一步確定丁酸梭菌(Clostridium butyricum) LXKJ-1的分類學(xué)地位，本發(fā)明采用傳統(tǒng)分類方法和分子分類方法對該菌株進(jìn)行了分類鑒定。

1 形態(tài)觀察用培養(yǎng)基

葡萄糖1.2%， L-半胱氨酸 0.03%，硫代乙醇酸鈉0.03%，K₂HPO₄0.2%，酵母浸粉 0.3%，大豆蛋白胨 0.5%，蛋白胨 1%，胰蛋白胨 1%，NaCl 0.3%，海藻酸鈉0.5%，瓊脂 2%， pH 6.5～7.0

2 引物

采用細(xì)菌通用引物，引物由奧科生物技術(shù)(武漢) 有限公司合成。其序列分別為： 27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3’) 和1492R(5’-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)

3 試驗方法

3.1 形態(tài)學(xué)觀察

將確定純培養(yǎng)的細(xì)菌接種培養(yǎng)，觀察其形態(tài)特征

平板四區(qū)劃線法，得到單菌落，觀察其菌落的大小、顏色、形狀、色澤、透明度、致密度和邊緣等特征，并記錄。

細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)（個體形態(tài)）的觀察

對待檢的菌株進(jìn)行革蘭氏染色，革蘭氏陽性菌體內(nèi)含有特殊的核蛋白質(zhì)鎂鹽與多糖的復(fù)合物，能夠與碘和結(jié)晶紫的復(fù)合物結(jié)合很牢，不易脫色，陰性菌復(fù)合物結(jié)合程度底，吸附染料差，易脫色。在光學(xué)顯微鏡下觀察其革蘭氏染色情況，判斷其為革蘭氏陽性菌或者革蘭氏陰性菌。并初步觀察細(xì)胞的形態(tài)特征。

3.2 丁酸梭菌(Clostridium butyricum) LXKJ-1的生理生化特征

3.2.1 API 20NE鑒定特征

3.2.1.1試驗條的準(zhǔn)備

取出培養(yǎng)盒，菌株編號及日期記錄在側(cè)面，在培養(yǎng)盤中加入無菌水覆蓋蜂窩小凹中，防止培養(yǎng)過程中試劑條干燥。從包裝中取出試驗條，放置在培養(yǎng)盤中。

3.2.1.2接種物的準(zhǔn)備

用四區(qū)劃線法獲得接種實驗菌株的平板，用無菌棉簽將新鮮菌體刮至生理鹽水中，至麥?zhǔn)蠞舛?.5。

3.2.1.3試劑條的接種

3.2.1.4用同一根吸管分別接種鹽水菌懸液從NO₃ 到PNPG試驗管。把試紙條稍微向前傾并將吸管的頂部靠在小管內(nèi)緣加液體，以避免形成氣泡。

3.2.1.5打開一安瓿瓶APIAUX培養(yǎng)基加入200微升剩下的生理鹽水菌懸液至安瓿瓶，仔細(xì)混勻，避免有氣泡產(chǎn)生。加滿GUL至PAC管，3個劃線實驗GLU、ADH、URE，用礦物油覆蓋，于29 ℃培養(yǎng)。

3.2.2 NO₃測定：

加一滴NIT1和NIT2到NO₃管，5min后，紅色表示陽性，因氮氣可能產(chǎn)生陰性，加2-3mgZn到NO₃管，5min后保持不變色為陽性，變紅為陰性。

表1 菌株 LXKJ-1生理生化特性–酶活、碳源同化

+：陽性反應(yīng)； -：陰性反應(yīng)； W：弱陽性反應(yīng)。

表2 菌株 LXKJ-1生理生化特性—利用碳源產(chǎn)酸

+：陽性反應(yīng)； -：陰性反應(yīng)

3.3丁酸梭菌(Clostridium butyricum) LXKJ-1的分子生物學(xué)鑒定

3.3.1丁酸梭菌(Clostridium butyricum) LXKJ-1基因組DNA的提取采用SDS-CTAB法。

3.3.2丁酸梭菌(Clostridium butyricum) LXKJ-116S rDNA基因的擴(kuò)增所使用的引物為27F(5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)，1492R(5'TACGGCTACCTTGTTACGACTT)，測序方法采用克隆測序法。PCR 反應(yīng)體系為50 μL: ddH₂O 40.7 μL，10×Buffer 5 μL，dNTP Mixture（10 μM）1 μL，引物27F（10 μmol/L）1 μL，引物1492R（10 μmol/L）1 μL，TaqDNA聚合酶0.3 μL，模板DNA 1 μL。PCR 擴(kuò)增條件為：94 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，56 ℃ 30s，72 ℃ 90 s，循環(huán)次數(shù)30 次；72 ℃ 8 min。測序工作委托上海生物工程服務(wù)有限公司完成。

3.3.3測序結(jié)果的比對分析

對菌株的測序結(jié)果在EZ-Biocloud進(jìn)行BLAST 比對，選取代表菌株，采用鄰接法（NJ）法對該菌株進(jìn)行同源性比較，同時構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，然后通過系統(tǒng)進(jìn)化樹分析確定該菌株的種屬關(guān)系。結(jié)合菌株的培養(yǎng)特征、形態(tài)特征及對該菌株的進(jìn)化關(guān)系等對菌株進(jìn)行初步分類鑒定。

4 試驗結(jié)果

4.1 丁酸梭菌(Clostridium butyricum) LXKJ-1的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

4.2 丁酸梭菌(Clostridium butyricum) LXKJ-1的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

4.2.1 丁酸梭菌(Clostridium butyricum) LXKJ-1的16S rDNA序列測定結(jié)果用DNAMAN5.2 軟件拼接，確定該片段由1412個堿基組成，得到丁酸梭菌(Clostridium butyricum) LXKJ-1的16S rDNA序列(見后表)。

4.2.2 同源進(jìn)化樹構(gòu)建

丁酸梭菌(Clostridium butyricum) LXKJ-1的16S rDNA序列分析結(jié)果表明，菌株丁酸梭菌(Clostridium butyricum) LXKJ-1與菌株Clostridium butyricum DSM 10702(T)相似度最大為99.15%，其次是Clostridium diolis DSM 5431(T)（97.37%）和Clostridium saccharoperbutylacetonicum N1-4(HMT)(T)（97.23%），再用MEGA 5.05 軟件NJ法構(gòu)建菌株丁酸梭菌(Clostridium butyricum) LXKJ-1系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹，根據(jù)16S rDNA比對結(jié)果結(jié)合菌株的形態(tài)特征等確定該菌株是潛在的丁酸梭菌新物種（見附圖3 ）。

實施例二丁酸梭菌三級發(fā)酵（200L發(fā)酵罐）

（1）一級種子液的準(zhǔn)備：將制備好的丁酸梭菌(Clostridium butyricum) LXKJ-1原始菌液接種到一級種子培養(yǎng)基上進(jìn)行種子制備，一級種子采用藍(lán)蓋瓶制備，制備體積1L，培養(yǎng)基如下：葡萄糖15 g/L，L-半胱氨酸 1 g/L，硫代乙醇酸鈉 1 g/L，K₂HPO₄ 2 g/L，酵母浸粉 5 g/L，大豆蛋白胨 20 g/L，NaCl 5 g/L，海藻酸鈉 5 g/L，pH 6.5～7.0培養(yǎng)溫度36 ℃，培養(yǎng)時間24h。

（2）二級種子液的準(zhǔn)備：將準(zhǔn)備好的一級丁酸梭菌(Clostridium butyricum) LXKJ-1種子液按照5%的接種量接種于20L發(fā)酵罐，作為二級種子液，二級種子液配方為二級種子培養(yǎng)基，具體培養(yǎng)基配方如下：蛋白胨20 g/L，豆餅粉2.5 g/L，葡萄糖15 g/L，NH₄NO₃ 1 g/L，K₂HPO₄ 1 g/L，MgSO₄ 0.1 g/L，MnSO₄ 0.1 g/L，L-半胱氨酸 0.5 g/L，海藻酸鈉5 g/L，尿素5 g/L，CaCO₃ 1 g/L， pH 6.5～7.0，培養(yǎng)溫度36 ℃，培養(yǎng)時間8h。

（3）三級發(fā)酵：將準(zhǔn)備好的二級丁酸梭菌(Clostridium butyricum) LXKJ-1種子液按照10%的接種量接種于200L發(fā)酵罐，進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基采用發(fā)酵培養(yǎng)基，具體培養(yǎng)基成分如下：玉米粉25 g/L，豆粕粉15 g/L，胰蛋白胨20 g/L，葡萄糖15 g/L，NH₄NO₃ 1 g/L，K₂HPO₄ 1 g/L，MgSO₄ 0.1 g/L，MnSO₄ 0.1 g/L，CaCO₃ 1 g/L，L-半胱氨酸 0.5 g/L，海藻酸鈉5 g/L，尿素5 g/L，pH 6.5～7.0，培養(yǎng)溫度36 ℃，培養(yǎng)時間24h。

通過上述三級發(fā)酵所得的發(fā)酵液活菌數(shù)可達(dá)2.8*10⁹cfu/mL以上，芽孢率在95%以上。

實施例三丁酸梭菌凍干菌粉及活菌制劑的制備

（1）離心收集菌體：將上述所得的丁酸梭菌(Clostridium butyricum) LXKJ-1的發(fā)酵液采用管式離心機進(jìn)行離心，離心速度為12000rpm，進(jìn)料速度為200L/h。

（2）菌體的凍干：將上述離心所得菌泥按照重量比1:3，加入滅菌后的20%的脫脂奶粉懸液與10%海藻糖，混勻，進(jìn)行真空冷凍干燥，凍干時間24h。

（3）凍干菌粉：菌體凍干后粉碎，制得凍干菌粉。經(jīng)測定使用上述方法生產(chǎn)所得的菌粉活菌活菌數(shù)最高可達(dá)1.0*10¹¹cfu/g以上。

（4）丁酸梭菌活菌制劑的制備：將上述所得菌粉采用葡萄糖、淀粉、石粉、沸石粉、豆粕粉、玉米芯粉或者麩皮粉中的一種或者一種以上作為稀釋劑制備成活菌數(shù)不小于2.0*10⁸cfu/g的丁酸梭菌活菌制劑。

綜上所述，本發(fā)明提供了一株丁酸梭菌(Clostridium butyricum) LXKJ-1以及該菌株的種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)條件及其以及采用三級發(fā)酵法生產(chǎn)丁酸梭菌活菌制劑的方法，該方法所使用的培養(yǎng)基成分簡單，成本低廉，經(jīng)濟(jì)效益高，很適合工廠的規(guī)?；a(chǎn)，發(fā)酵所得培養(yǎng)物活菌數(shù)、芽孢率高。由于芽孢是一種休眠體，在存放過程中很穩(wěn)定，而且具有很好的耐熱性，因此采用以上方法生產(chǎn)的丁酸梭菌活菌制劑具有穩(wěn)定性強，耐儲存的優(yōu)點。

實施例四丁酸梭菌耐高溫試驗

將丁酸梭菌活菌制劑分別放在烘箱中80 ℃處理10min、20min、30min，90 ℃處理 5min、10min、15min，100 ℃處理5min、10min、15min，105 ℃處理5min、10min、15min，每個處理取3個平行，處理結(jié)束常溫降溫后分別測定活菌數(shù)。取3個平行結(jié)果的平均值做為最終結(jié)果，來考察不同溫度、不同高溫處理時間對丁酸梭菌的影響。采用稀釋倒平板法進(jìn)行活菌數(shù)測定。結(jié)果見表3.

表3丁酸梭菌活菌耐熱性試驗

以上結(jié)果可以看出，丁酸梭菌 LXKJ-1在體外80 ℃處理10min、90 ℃處理10min、100 ℃處理5min芽孢存活率仍為100%。說明該菌株形成的芽孢具有很好的耐熱性，可以有效的保護(hù)菌體不受飼料制粒過程高溫的影響，可以做為飼料添加劑使用。

實施例五 丁酸梭菌產(chǎn)丁酸和乙酸能力

將丁酸梭菌進(jìn)行平板培養(yǎng)，接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)24h，離心取上清液，采用氣相色譜法測定丁酸和乙酸含量。檢測條件：將1 μL氣相樣品注入配有FID氫火焰離子檢測器和HP-Innowax 19091 N-213毛細(xì)管柱（30 m×0.32 mm ×0.5 um）的氣相色譜（Agilent Technologist，7890A GC System），載氣為氦氣，其流速為1.8 mL/min，分流比40:1，升溫程序：90 ℃維持0.5 min，以10 ℃/min的速度提升到110 ℃，再以5 ℃/min的速度升到170 ℃，最后以20 ℃/min的速度到210 ℃。進(jìn)樣器和檢測器溫度275 ℃。

測定結(jié)果：丁酸含量為8.12 g/L，乙酸含量為1.37 g/L。表明丁酸梭菌 LXKJ-1產(chǎn)丁酸能力較強。

實施例六丁酸梭菌體外抑菌試驗

將丁酸梭菌活菌制劑進(jìn)行平板培養(yǎng)，接種到液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)48h以沙門氏菌、大腸桿菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌為靶標(biāo)菌，采用管碟法測定丁酸梭菌 LXKJ-1發(fā)酵液的抑菌活性，結(jié)果見表4。

表4丁酸梭菌抑菌試驗效果

結(jié)果表明，丁酸梭菌對傷寒沙門氏菌 YF、腸炎沙門氏菌S(ATCC13076)、鼠傷寒沙門氏菌zjc(ATCC14028)、雞白痢沙門氏菌 C79-13、福氏志賀氏菌zjc、福氏志賀氏菌268、痢疾志賀氏菌269、宋內(nèi)志賀氏菌Z、大腸桿菌BL21、豬大腸桿菌（野生菌株）、雞大腸桿菌（野生菌株）、金黃色葡萄球菌JN、單增李斯特菌Lis、單增李斯特菌Lu及產(chǎn)氣莢膜梭菌都具有很好的抑菌活性。

實施例七丁酸梭菌對斷奶仔豬生產(chǎn)性能和腹瀉率的影響

1 試驗方法

1.1 試驗材料：丁酸梭菌（每克制劑含丁酸梭菌活菌≥2.0×10⁸cfu/g）。

試驗動物：35±1日齡杜×大×長三元雜交仔豬。

試驗設(shè)計：試驗采用單因子設(shè)計。選取35±1日齡體重基本一致的健康仔豬364頭，隨機分成5組，每組4個重復(fù)，每重復(fù)18頭（其中有四個重復(fù)19頭）。對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，4個試驗組分別基礎(chǔ)日糧丁酸梭菌添加量為250g/t，500 g/t，1000 g/t，2000 g/t丁酸梭菌活菌制劑。試驗期為30 d。

飼養(yǎng)管理

試驗期間，每天07:00、14:00和21:00喂料，喂料量以料槽中有少量剩余料為宜，全期自由采食與飲水，預(yù)防免疫和飼養(yǎng)管理按常規(guī)方法進(jìn)行。每日15:00進(jìn)行腹瀉統(tǒng)計，同時觀察仔豬的健康狀況，記錄患病、死淘仔豬頭數(shù)及其原因。

指標(biāo)測定

每天記錄各重復(fù)仔豬頭數(shù)、腹瀉以及死淘情況，每周統(tǒng)計一次采食量與腹瀉率，計算日均采食量；試驗結(jié)束當(dāng)天稱重，統(tǒng)計全期采食量，計算全期料肉比，仔豬腹瀉率與死淘率。

盲腸微生物測定：大腸桿菌、沙門氏菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)量的變化。

試驗結(jié)果

丁酸梭菌對斷奶仔豬生產(chǎn)性能和腹瀉率的影響及其盲腸微生物情況見表5、表6.

表5丁酸梭菌對斷奶仔豬生產(chǎn)性能和腹瀉率的影響

表6丁酸梭菌對斷奶仔豬盲腸菌群的影響

結(jié)果表明，日糧中添加0.025-0.2%丁酸梭菌可顯著降低斷奶仔豬的腹瀉率，提高生產(chǎn)性能，并顯著降低盲腸中大腸桿菌和沙門氏菌數(shù)量（表5和6）。

實施例九丁酸梭菌對蛋雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)和盲腸微生物的影響

1 試驗方法

1.1 材料：丁酸梭菌LXKJ-1（每克制劑含丁酸梭菌活菌≥2.0×10⁸cfu/g）

1.2 試驗動物：46周齡京紅1號蛋雞

1.3 試驗設(shè)計：試驗采用單因子設(shè)計。選取960只體重基本一致的46周齡商品代蛋雞，隨機分成5組，每組6個重復(fù)，每個重復(fù)32只。對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，4個試驗組分別在基礎(chǔ)日糧中丁酸梭菌制劑添加量為125 g/t，250 g/t，500 g/t，1000 g/t。預(yù)試期14天，正式期56天。

測定指標(biāo)

產(chǎn)蛋性能：日均產(chǎn)蛋率、平均蛋重、日產(chǎn)蛋重、采食量、料蛋比等。

雞蛋品質(zhì)：哈氏單位、蛋殼厚度、蛋殼強度。

哈氏單位：Hu=100lg（H-1.7W^0.37+0.76)，其中H為濃蛋白高度/mm，W為蛋殼重/g。

盲腸微生物測定：大腸桿菌、乳酸菌、雙歧桿菌數(shù)量的變化。

試驗結(jié)果

2.1 丁酸梭菌LXKJ-1對蛋雞生產(chǎn)性能的影響

丁酸梭菌對蛋雞生產(chǎn)性能影響結(jié)果見表7。

表7丁酸梭菌對蛋雞生產(chǎn)性能的影響

2.2 丁酸梭菌對蛋雞蛋品質(zhì)的影響

丁酸梭菌對蛋雞雞蛋品質(zhì)影響見表8

表8丁酸梭菌對蛋雞蛋品質(zhì)的影響

2. 3 丁酸梭菌對蛋雞盲腸微生物的影響

丁酸梭菌對蛋雞腸微生物的影響見表9

表9丁酸梭菌對蛋雞腸微生物的影響（單位：lgcfu/g）

結(jié)果表明，日糧中添加0.0125-0.1%丁酸梭菌可有效提高蛋雞生產(chǎn)性能，改善蛋殼品質(zhì)，同時對腸道中菌群有改善趨勢（表7、8、9）。

實施例十丁酸梭菌對肉雞的促生長效果

1 試驗方法

1.1 材料：丁酸梭菌LXKJ-1（每克制劑含丁酸梭菌活菌≥2.0×10⁸cfu/g）

1.2 試驗設(shè)計：

選取1日齡1萬羽AA肉雞進(jìn)行試驗，平均分成對照組和試驗組。對照組喂基礎(chǔ)日糧，試驗組在基礎(chǔ)日糧中丁酸梭菌制劑添加量為 125 g/t，250 g/t，500 g/t，1000 g/t，試驗周期42天。

測定指標(biāo)

生長性能測定：在試驗開始第一天、1周，2周、3周、4周、5周、6周末時，每組隨機選50只肉雞進(jìn)行稱重，取平均值，計算各組肉雞重量。記錄試驗前期和后期的耗料量，計算肉雞平均日增重、平均日采食量和料肉比。

腹瀉率和死亡率：記錄飼喂過程中各組腹瀉只數(shù)和死亡只數(shù)，計算腹瀉率和死亡率。

糞便中菌群數(shù)量的測定：各組分別取 1.0 g 新鮮糞樣，采用 10 倍梯度稀釋法稀釋至 10-8，選擇連續(xù)三個稀釋度，分別涂布于 EMB、MRS、BBL 等鑒別培養(yǎng)基平板上，接種量為 100 μL/9cm 平板，每個稀釋度做 3 個平行，37 ℃恒溫培養(yǎng) 24-48 h。主要檢測糞便中大腸桿菌、乳酸菌、雙歧桿菌的含量。

試驗結(jié)果

2.1丁酸梭菌對肉雞生長性能的影響

表10丁酸梭菌對AA肉雞生長性能的影響

2.1丁酸梭菌對肉雞盲腸微生物的影響

表11 丁酸梭菌對蛋雞腸微生物的影響（單位：lgcfu/g）

結(jié)果表明 ，日糧中添加0.0125%～0.1%丁酸梭菌制劑可顯著提高肉雞成活率，促進(jìn)生長，提高增重，同時降低了腹瀉率（表10），增加肉雞盲腸中乳酸菌和雙歧桿菌的數(shù)量，降低大腸桿菌數(shù)量（表11）。

本發(fā)明從健康豬腸道分離篩選了一株丁酸梭菌(Clostridium butyricum)LXKJ-1，其活性高，抗逆性強，同時找到了適宜其生長、繁殖的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，發(fā)酵所得培養(yǎng)物活菌數(shù)高、芽孢率高，該發(fā)明所使用的培養(yǎng)基成分簡單，成本低廉，很適合工廠的規(guī)?；a(chǎn)。丁酸梭菌(Clostridium butyricum)LXKJ-1耐酸、耐堿、耐高溫，產(chǎn)丁酸能力強，對大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄桿菌、單增李斯特菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等動物病原菌都具有抑制作用，可預(yù)防豬、雞由大腸桿菌、沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等引起的腹瀉，改善腸道菌群平衡，促進(jìn)豬、雞生長，提高蛋雞產(chǎn)蛋率和蛋重，改善蛋殼質(zhì)量，降低料蛋比。

<110>湖北綠雪生物科技有限公司

<120>一株丁酸梭菌和丁酸梭菌活菌制劑及應(yīng)用

<141>2016-10-28 <160>1 <210> 1 <211>序列的長度<212>DNA

<213>丁酸梭菌<400>核苷酸序列

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