技術領域

本發(fā)明涉及用卵葉蜘蛛抱蛋（Aspidistra typica Baill.）（保藏編號是：No. 20140316-1）生產簡單植物源氧雜蒽酮類化合物及新型苯駢香豆素類化合物的方法；本發(fā)明還涉及此兩類化合物在制備抗菌制劑中的用途，屬于藥學領域。

背景技術：

卵葉蜘蛛抱蛋（學名：Aspidistra typica Baill.）為天門冬科蜘蛛抱蛋屬植物,根狀莖較粗，近圓柱形。葉2-3枚簇生，卵圓狀披針形至卵形；葉柄明顯，堅硬。總花梗常呈簇抽出，纖細；苞片3-5枚，卵形；花被壇狀，外面有紫色細點，內面深紫色；裂片卵形，較短；雄蕊6枚，幾無花絲；子房短，花柱粗短，無關節(jié)；柱頭大，圓形，呈盾狀膨大。漿果球形?；ㄆ?-9月。產云南和關西等西南部，也分布于越南。生于深山密林中、山谷、溪邊濕潤處。卵葉蜘蛛抱蛋的藥理活性及其活性成分的研究鮮有報道，現(xiàn)有研究僅從其中分離得到其中甾體皂皂苷類成分。而其民間廣泛藥用其根莖，稱其活血化瘀，解毒止痛效果良好，主治腎虧，腰痛，風濕性疼痛，機體跌打損傷等，但其活性成分并無系統(tǒng)研究。

本發(fā)明人首次從中分離出結構新穎的苯駢香豆素類化合物和簡單植物源氧雜蒽酮類化合物。研究發(fā)現(xiàn)所示含苯駢香豆素類化合物和植物源氧雜蒽酮類化合物具有良好的抗菌活性，目前尚未見對新型苯駢香豆素化合物的結構及其抗菌活性的報道，也未見植物源氧雜蒽酮類化合物抗革蘭氏陰性菌活性的報道，因此市場上也尚未有與此有關的藥物。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種結構獨特的具有良好抗菌活性作用的新化合物，其結構式如下：

式I

其結構特征是： R₁ 為氨基、氫、羥基、C_1-10烷氧基、C_1-10酰氧基或C_1-10酰胺基；R₂為甲基；R₃ 為氨基、氫、羥基、C_1-10烷氧基、C_1-10酰氧基或C_1-10酰胺基。

本發(fā)明優(yōu)選的式I化合物為R₁ 為羥基，R₂ 為甲基，R₃為羥基。

本發(fā)明旨在還提供一種簡單植物源氧雜蒽酮類化合物，所述化合物具有良好抗菌活性作用，其結構式如下：

式II

其結構特征是： R₁ 為氨基、氫、羥基、C_1-10烷氧基、C_1-10酰氧基或C_1-10酰胺基；R₂為甲基； R₃ 為氨基、氫、羥基、C_1-10烷氧基、C_1-10酰氧基或C_1-10酰胺基。

本發(fā)明優(yōu)選的式II化合物為R₁ 為羥基，R₂ 為甲基，R₃為羥基。

本發(fā)明所述的C_1-10烷氧基優(yōu)選C_1-6烷氧基，更優(yōu)選甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基，異丙氧基，戊氧基，己氧基等；

本發(fā)明所述的C_1-10酰氧基優(yōu)選C_1-6酰氧基，更優(yōu)選甲酰氧基、乙酰氧基、丙酰氧基、丁酰氧基，異丙酰氧基，戊酰氧基，己酰氧基等；

本發(fā)明所述的C_1-10酰胺基優(yōu)選C_1-6酰胺基，更優(yōu)選甲酰胺基、乙酰胺基、丙酰胺基、丁酰胺基，異丙酰胺基，戊酰胺基，己酰胺基等；

本發(fā)明式I中的部分化合物可通過以下方法制備得到：

，

其中R為氨基、C_1-10烷氧基、C_1-10酰氧基或C_1-10酰胺基

本發(fā)明式II中的部分化合物可通過以下方法制備得到：

，

其中R為氨基、C_1-10烷氧基、C_1-10酰氧基或C_1-10酰胺基

本發(fā)明式I和II 中的部分化合物可通過提取蜘蛛抱蛋屬植物根莖來獲得含活性成分化合物的提取物，然后從提取物中采用硅膠柱層析、制備薄層層析等方法分離純化得到。

本發(fā)明式I和II化合物優(yōu)選以下方法制備得到：（1）選取卵葉蜘蛛抱蛋的根莖為原料，使用乙醇（優(yōu)選70%）進行超聲提取，過濾，濾去藥渣，濾液合并減壓濃縮至浸膏，無醇味；然后把濃縮物分散于水中，用石油醚（沸程30~60℃）、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取，萃取后分別減壓濃縮，得各溶劑的浸膏；（2）選取卵葉蜘蛛抱蛋氯仿浸膏為樣品，經硅膠柱層析，并使用氯仿和甲醇的混合溶劑為洗脫溶劑，以薄層色譜為檢測手段，洗脫液濃縮、合并得Fr.A1～Fr.A5五個部分；（3）選取Fr.A2部分為樣品，并使用硅膠拌樣，進行硅膠柱層析，用氯仿：甲醇（300:1～10:1）系統(tǒng)進行梯度洗脫，所得分離樣品分為Fr.A2-1、Fr.A2-2以及Fr.A2-3三部分；（4）選取Fr.A2-2為樣品，經硅膠柱層析，石油醚：乙酸乙酯（200:1～3:1）為洗脫劑進行純化，得到化合物II（卵葉香豆素甲）；（5）選取Fr.A2-1為樣品，經硅膠柱層析再次純化，得到化合物I卵葉氧雜蒽酮甲。本發(fā)明的下述實例中列舉了利用卵葉蜘蛛抱蛋（Aspidistra typica Baill.）（保藏編號是：No. 20140316-1）根莖，制備發(fā)明式化合物I和II的實例。

附圖說明

圖1 卵葉蜘蛛抱蛋根極性部位提取流程。

圖2 化合物I的2D-NMR 數(shù)據 (¹H:600MHz; ¹³C:150MHz)。

圖3 化合物II的2D-NMR 數(shù)據 (¹H:600MHz; ¹³C:150MHz)。

圖4 卵葉香豆素甲、卵葉氧雜蒽酮甲及其衍生物的對革蘭氏陽性菌的最低抑菌濃度（MIC值）。

圖5 卵葉香豆素甲、卵葉氧雜蒽酮甲及其衍生物對革蘭氏陰性菌的最低抑菌濃度（MIC值）。

圖6 卵葉香豆素甲、卵葉氧雜蒽酮甲及其衍生物的最小殺菌濃度（MBC值）。

具體實施方案：

實施例1： 在如下的實施例中所指的化合物I的結構式：

化合物I

1 浸膏的制備

卵葉蜘蛛抱蛋根莖干燥切片5.55Kg，70%乙醇超聲提取3次（質量體積比為1：30），每次超聲1小時。濾去藥渣，濾液合并減壓濃縮至浸膏，無醇味；然后把濃縮物分散于水中，用石油醚（沸程30~60℃）、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇依次分別萃取3次，分別50℃減壓濃縮，得各部分浸膏。合并氯仿部位濃縮干燥得21.14 g，乙酸乙酯部位13.43 g (見圖1）。

2 化合物的分離精制

卵葉蜘蛛抱蛋氯仿部分21.14 g，經硅膠柱層析(硅膠H，200～300目，420g，氯仿：甲醇500:1～10:1洗脫)，薄層色譜（TLC）檢測，洗脫液濃縮并合并得Fr.A1～Fr.A5五個部分。

Fr.A2部分為淺黃色粉末狀，約5.4g，以硅膠（100-200目）拌樣，風干進行H硅膠柱層析，用氯仿：甲醇（300:1～10:1）系統(tǒng)進行梯度洗脫，每75ml接一瓶。得到三個部分，F(xiàn)r.A2-2經H硅膠柱層析，石油醚：乙酸乙酯（200:1～3:1）體系洗脫，得到化合物2（卵葉香豆素甲），約12mg。

白色無定形粉末，分子式C₁₄H₁₀O₄，熔點182～183°C，旋光度-1.658 (c1.00, MeOH)，IR (KBr) cm^-1：3468, 1638；HR-ESI-MSm/z ：實測值241.0500[M-H]⁺；計算為C₁₄H₉O₄，241.0477；¹H NMR and ¹³C NMR (400 Hz，CDCl₃)：見圖2。

實施例2： 在如下的實施例中所指的化合物II的結構式：

化合物II

1 浸膏的制備

同實施例1。

2 化合物的分離精制

卵葉蜘蛛抱蛋氯仿部分21.14 g，經硅膠柱層析(硅膠H，200～300目，420g，氯仿：甲醇500:1～10:1洗脫)，薄層色譜（TLC）檢測，洗脫液濃縮并合并得Fr.A1～Fr.A5五個部分。

Fr.A2部分為淺黃色粉末狀，約5.4g，以硅膠（100-200目）拌樣，風干進行H硅膠柱層析，用氯仿：甲醇（300:1～10:1）系統(tǒng)進行梯度洗脫，每75ml接一瓶。得到三個部分，F(xiàn)r.A2-1再次經H硅膠柱層析，TLC檢識其純度后，得到化合物I卵葉氧雜蒽酮甲，約35mg。

黃色無定形粉末，分子式C₁₆H₁₁FO₆，熔點149～150°C，旋光度-0.1773 (c1.00, MeOH)，IR (KBr) cm^-1：3422, 1602, 1477；ESI-MS m/z (%)：318[M+H⁺] (100)；HR-ESI-MSm/z ：實測值318.3004 [M+H]⁺；計算為C₁₆H₁₁FO₆，318.2933。¹H NMR and ¹³C NMR (600 Hz，CDCl₃)：見圖3。

實施例3: 卵葉香豆素甲乙酰化衍生物的合成

1

將卵葉香豆素甲I(10 mg, 0.03 mmol) 和DMAP（3 g, 0.02 mmol）置于25 ml圓底燒瓶中，用5 ml THF溶解后，滴加兩滴醋酐（約10 mg，0.06 mmol)，于40℃反應5 h，減壓蒸干溶劑得殘留物1a。殘余物1a經硅膠 （0.1 g) 柱層析分離，氯仿-甲醇 (220:1)洗脫，得到化合物1（白色無定形粉末，4.3 mg，產率43%）?；衔?：ESIMS m/z 285 [M +H]⁺。

實施例4: 卵葉香豆素甲甲醚化衍生物的合成

2

將卵葉香豆素甲I(20 mg, 0.06 mmol) 置于25 ml圓底燒瓶中，用5 ml DMF溶解后，冰鹽浴下滴加15 mg 碘甲烷（約0.15 mmol），置于25℃反應15 min，加硫代硫酸鈉固體少許攪拌5 min淬滅碘甲烷，減壓蒸干溶劑得殘留物2a。殘余物1a經硅膠 （0.2 g) 柱層析分離，氯仿-甲醇 (200:1)洗脫，得到化合物2（白色無定形粉末，12 mg，產率60%）?；衔?：ESIMS m/z 271 [M +H]⁺。

實施例5: 卵葉氧雜蒽酮甲乙?；苌锏暮铣?/p>

3 4

將卵葉氧雜蒽酮甲II(10 mg, 0.03 mmol) 和DMAP（3 g, 0.02 mmol）置于25 ml圓底燒瓶中，用5 ml THF溶解后，滴加兩滴醋酐（約10 mg，0.06 mmol)，于40℃反應5 h，減壓蒸干溶劑得殘留物3a。殘余物3a經硅膠 （0.1 g) 柱層析分離，氯仿-甲醇 (220:1)洗脫，得到化合物3（白色無定形粉末，8.3 mg，產率83%）， 化合物4（白色無定形粉末，2.4 mg，產率24 %）。化合物3：ESIMS m/z 285 [M +H]⁺；化合物4：ESIMS m/z 327 [M +H]⁺。

實施例6: 卵葉氧雜蒽酮甲醚化衍生物的合成

6

將卵葉氧雜蒽酮甲II(10 mg, 0.03 mmol) 置于25 ml圓底燒瓶中，用5 ml DMF溶解后，冰鹽浴下滴加8 mg 碘甲烷（1滴，約0.07 mmol），置于冰浴下反應15 min，加硫代硫酸鈉固體少許攪拌5 min淬滅碘甲烷，減壓蒸干溶劑得殘留物4a。殘余物4a經硅膠 （0.2 g) 柱層析分離，氯仿-甲醇 (200:1)洗脫，得到化合物6（白色無定形粉末，7.8 mg，產率78%）?；衔?：ESIMS m/z 271 [M +H]⁺。

實施例7：

體外抗菌活性的測試

A. 最低抑菌濃度（MIC）的測定

1 實驗樣品及實驗方法

采用實施例1-4中所制備各化合物進行活性實驗。

采用微量肉湯稀釋法（Bicro Mroth Dilution，BMD）以鹽酸小檗堿做陽性對照，測定化合物I和II的MIC值。

被測樣品溶液的配制：分別精密稱取適量上述精制化合物I和II適量，用DMSO配制成所需濃度的溶液，供測活性。

2 實驗過程

菌液制備

將甘油標準菌100 ul接種于3 mL LB肉湯中，置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24h，然后將金黃色葡萄球菌劃線接種于卵黃高鹽瓊脂平板上，將大腸桿菌劃線接種于麥康凱瓊脂平板上，將藤黃八疊球菌和綠膿桿菌劃線接種于MH瓊脂平板上。置于37℃恒溫箱培養(yǎng)12~16h，分別挑取其單個菌落接種于3 mL的LB肉湯中進行培養(yǎng)，待用。

藥物微量稀釋藥敏盒制備

在96孔酶標板各孔中先加入MH肉湯100 uL，然后向第一孔中加入濃度為4 mg/mL藥物二甲亞砜溶液100 uL，按照2倍稀釋法進行系列稀釋，第一至第八孔加藥，第十二孔不加藥作為生長對照，使得第一孔至第八孔最終的藥物濃度分為1 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL、0.125 mg/mL、0.0625 mg/mL、0.0313 mg/mL、0.0156 mg/mL，制成微量稀釋藥敏盒。

細菌接種

用直接菌液法制備的濃度相當于0.50麥氏比濁標準的菌懸液，加50 uL到微量稀釋藥敏盒各孔中，使得沒孔最終菌液濃度為5×10⁵ CFU/mL，稀釋菌液于15 min內接種完畢，37℃恒溫箱培養(yǎng)16~18h，4種菌，每次做三個重復，同時設3個陽性藥物對照組，細菌陽性對照組（只有細菌沒有藥液），陰性對照組（不含藥液和菌液）。以培養(yǎng)基澄清，肉眼觀察無細菌生長孔所含的最低化合物濃度記為MIC值。

B. 最小殺菌濃度（MBC）的測定

在MIC結果的基礎上，從肉眼可見無混濁的培養(yǎng)孔中取100uL樣品，均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)板中。按照MIC培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)24h后，以殺滅99.9%細菌數(shù)量的最小濃度或者在培養(yǎng)基上未見明顯的菌落生長的記為MBC。實驗重復3次。

3. 實驗結果

A. 最低抑菌濃度（MIC）

化合物I、II及其衍生物對金黃色葡萄球菌、藤黃八疊球菌、綠膿桿菌和大腸桿菌均有一定抑菌作用，其MIC如表3、表4所示，其中化合物I、II及二者的酰化衍生物1，3，4對上述四種細菌的MIC分別為：250 ug/mL、250 ug/mL、125 ug/mL、125ug/mL；而其醚化衍生物2，5和6對上述四種細菌的抑菌作用約有降低，MIC分別為500 ug/mL、500 ug/mL、250 ug/mL、250 ug/mL（見圖4、圖5）?？傮w上可見通式為式I的苯駢香豆素類化合物和通式為式II的氧雜蒽酮類化合物對G+菌和G-菌均有一定的抑制作用，其對G-菌如綠膿桿菌、大腸桿菌的抑菌作用強于對G+如金黃色葡萄球菌、藤黃八疊球菌的作用，且其對G-菌的作用優(yōu)于鹽酸小檗堿或與鹽酸小檗堿相當。

B. 最小殺菌濃度（MBC）

如表5所示，化合物I、II及二者的酰化衍生物1，3，4對金黃色葡萄球菌、藤黃八疊球菌、綠膿桿菌和大腸桿菌MBC分別為500 ug/mL、250 ug/mL、500 ug/mL和125 ug/mL；而其醚化衍生物2，5和6對上述四種細菌的抑菌作用約有降低，MIC分別為1000 ug/mL、500 ug/mL、500 ug/mL、250ug/mL（見圖6）。其對革蘭氏陰性菌的殺菌效果優(yōu)于鹽酸小檗堿。

結論

通式為式I的苯駢香豆素類化合物和通式為式II的氧雜蒽酮類化合物具有較明顯的抑菌作用，可作為抑菌劑用于抑菌的研究。