本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種快速同步檢測6種商業(yè)化應(yīng)用轉(zhuǎn)基因棉花的多重PCR引物及檢測方法。

背景技術(shù)：

我國商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物主要為轉(zhuǎn)基因抗蟲棉和轉(zhuǎn)基因抗病毒番木瓜，其中抗蟲棉花種植面積最大，2015年達(dá)到370萬公頃，占我國棉花種植總面積的97％。此外，根據(jù)農(nóng)業(yè)部官方網(wǎng)站提供的我國轉(zhuǎn)基因進(jìn)口用作加工原料的相關(guān)信息顯示，我國還允許國外抗蟲轉(zhuǎn)基因棉花MON531、抗除草劑棉花LLcotton25等9個(gè)轉(zhuǎn)基因棉花進(jìn)口用作加工原料。隨著轉(zhuǎn)基因棉花在市場上所占份額的不斷增加給轉(zhuǎn)基因檢測帶來更多需求。同時(shí)，轉(zhuǎn)基因作物的多樣性和復(fù)雜性，也給轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測帶來了挑戰(zhàn)。如何快速、準(zhǔn)確、科學(xué)地對樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)基因鑒定，是當(dāng)前轉(zhuǎn)基因檢測行業(yè)所面臨的一個(gè)關(guān)鍵問題。

在轉(zhuǎn)基因植物及產(chǎn)品檢測技術(shù)中主要有蛋白質(zhì)檢測和核酸檢測兩類，核酸檢測技術(shù)中普通PCR技術(shù)在實(shí)際檢測需求中運(yùn)用較多，其特點(diǎn)為敏感、快速、簡便，主要用于檢測轉(zhuǎn)基因作物及產(chǎn)品中的單個(gè)轉(zhuǎn)化體。然而在產(chǎn)品檢測時(shí)，往往需要對多個(gè)轉(zhuǎn)化體進(jìn)行檢測來確認(rèn)是否為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，用普通PCR技術(shù)對每個(gè)轉(zhuǎn)化體分別進(jìn)行檢測時(shí)，存在時(shí)間和試劑耗費(fèi)大、操作繁瑣等缺點(diǎn)。

多重PCR是在普通PCR基礎(chǔ)上發(fā)展的一種新型擴(kuò)增技術(shù)，已在病理學(xué)、微生物、基因組學(xué)等學(xué)科中得到了廣泛應(yīng)用。多重PCR檢測技術(shù)主要利用多重?cái)U(kuò)增產(chǎn)生長度不同的擴(kuò)增片段，采用普通瓊脂糖凝膠電泳或毛細(xì)管凝膠電泳分辨出長度不同的片段。普通瓊脂糖凝膠電泳存在操作繁雜，試驗(yàn)周期長，易造成試驗(yàn)室污染等缺點(diǎn)，而毛細(xì)管凝膠電泳可在PCR后直接上機(jī)電泳，無需其他點(diǎn)樣等操作，節(jié)約時(shí)間，減少污染。可以說多重PCR相比單一PCR反應(yīng)更快捷、更經(jīng)濟(jì)，只需要1次PCR反應(yīng)就能同時(shí)檢測多個(gè)靶標(biāo)基因，這種方法具有更大的可靠性和適應(yīng)性，并能降低檢測成本。

目前關(guān)于已商業(yè)化應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因棉花的檢測技術(shù)，主要集中在單個(gè)轉(zhuǎn)化事件PCR方法和標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)檢索公開文獻(xiàn)和專利發(fā)現(xiàn)利用多重PCR快速同步檢測的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的主要是提供一種準(zhǔn)確、快速、可靠、省時(shí)省力的多重PCR同步快速檢測6種商業(yè)化應(yīng)用轉(zhuǎn)基因棉花的多重PCR檢測方法。

本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種快速同步檢測6種商業(yè)化應(yīng)用轉(zhuǎn)基因棉花的多重PCR引物，包括以下引物序列：

MON1445-F：5'-AATGCTGGATTTTCTGCCTGTG-3'；

MON1445-R：5'-TCCAAAAGTCATGCATCATTTCTCA-3'；

GHB614-F：5'-CAAATACACTTGGAACGACTTCGT-3'；

GHB614-R：5'-GCAGGCATGCAAGCTTTTAAA-3'；

MON15985-F：5'-ATTTGATGCACTATGTCTTCGTCTA-3'；

MON15985-R：5'-CAATGGAATCCGAGGAGGT-3'；

MON88913-F：5'-TAATAACGCTGCGGACATCTAC-3'；

MON88913-R：5'-GAGAAGCGAGACCTACAAGCC-3'；

LLcotton25-F：5'-CAAGGAACTATTCAACTGAG-3'；

LLcotton25-R：5'-CAACCTGTCTGTTTGCTGAC-3'；

MON531-F：5'-AAGAGAAACCCCAATCATAAAA-3'；

MON531-R：5'-GAGAATGCGGTAAAGATACGTC-3'。

一種快速同步檢測6種商業(yè)化應(yīng)用轉(zhuǎn)基因棉花的多重PCR檢測方法，包括以下步驟：

(1)合成以下引物：

MON1445-F：5'-AATGCTGGATTTTCTGCCTGTG-3'；

MON1445-R：5'-TCCAAAAGTCATGCATCATTTCTCA-3'；

GHB614-F：5'-CAAATACACTTGGAACGACTTCGT-3'；

GHB614-R：5'-GCAGGCATGCAAGCTTTTAAA-3'；

MON15985-F：5'-ATTTGATGCACTATGTCTTCGTCTA-3'；

MON15985-R：5'-CAATGGAATCCGAGGAGGT-3'；

MON88913-F：5'-TAATAACGCTGCGGACATCTAC-3'；

MON88913-R：5'-GAGAAGCGAGACCTACAAGCC-3'；

LLcotton25-F：5'-CAAGGAACTATTCAACTGAG-3'；

LLcotton25-R：5'-CAACCTGTCTGTTTGCTGAC-3'；

MON531-F：5'-AAGAGAAACCCCAATCATAAAA-3'；

MON531-R：5'-GAGAATGCGGTAAAGATACGTC-3'；

(2)制備待測DNA稀釋液；

(3)配制PCR反應(yīng)體系；

(4)進(jìn)行PCR檢測；

(5)取PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳。

進(jìn)一步地，步驟(1)中GHB614引物和LLcotton25引物的濃度為0.3μmol/L，MON1445引物和MON15985引物的濃度為0.25μmol/L，MON531引物的濃度均為0.2μmol/L，MON88913引物的濃度均為0.16μmol/L。

再進(jìn)一步地，所述PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；然后進(jìn)入35個(gè)循環(huán)，94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸3min。

更進(jìn)一步地，步驟(2)所述制備的DNA稀釋液的濃度為60ng/μL。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果：

本發(fā)明在同一次PCR反應(yīng)中可以同時(shí)檢出6種商業(yè)化應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因棉花。本發(fā)明多重PCR產(chǎn)物采用毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行結(jié)果分析，不僅分辨率可達(dá)幾個(gè)堿基(普通凝膠電泳幾乎不能將其分開)，而且相對普通凝膠電泳的分離效果更好，并且只需要一次電泳分析即可得知樣品是否含有這6種轉(zhuǎn)基因棉花。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的引物濃度梯度試驗(yàn)擴(kuò)增圖譜。

圖2為本發(fā)明的引物退火溫度梯度試驗(yàn)擴(kuò)增圖譜。

圖3為本發(fā)明的靈敏度試驗(yàn)擴(kuò)增圖譜。

圖4為本發(fā)明的已知樣品驗(yàn)證擴(kuò)增圖譜。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不限于此。

實(shí)施例

一種快速同步檢測6種商業(yè)化應(yīng)用轉(zhuǎn)基因棉花的多重PCR檢測方法，包括以下步驟：

(1)合成以下引物：

MON1445-F：5'-AATGCTGGATTTTCTGCCTGTG-3'；

MON1445-R：5'-TCCAAAAGTCATGCATCATTTCTCA-3'；

GHB614-F：5'-CAAATACACTTGGAACGACTTCGT-3'；

GHB614-R：5'-GCAGGCATGCAAGCTTTTAAA-3'；

MON15985-F：5'-ATTTGATGCACTATGTCTTCGTCTA-3'；

MON15985-R：5'-CAATGGAATCCGAGGAGGT-3'；

MON88913-F：5'-TAATAACGCTGCGGACATCTAC-3'；

MON88913-R：5'-GAGAAGCGAGACCTACAAGCC-3'；

LLcotton25-F：5'-CAAGGAACTATTCAACTGAG-3'；

LLcotton25-R：5'-CAACCTGTCTGTTTGCTGAC-3'；

MON531-F：5'-AAGAGAAACCCCAATCATAAAA-3'；

MON531-R：5'-GAGAATGCGGTAAAGATACGTC-3'；

(2)制備待測DNA稀釋液；

(3)配制PCR反應(yīng)體系；

(4)進(jìn)行PCR檢測；

(5)取PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳。

進(jìn)一步地，步驟(1)中GHB614引物和LLcotton25引物的濃度為0.3μmol/L，MON1445引物和MON15985引物的濃度為0.25μmol/L，MON531引物的濃度均為0.2μmol/L，MON88913引物的濃度均為0.16μmol/L；步驟(2)所述制備的DNA稀釋液的濃度為60ng/μL；所述PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；然后進(jìn)入35個(gè)循環(huán)，94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸3min；引物退火溫度為56℃。

其中，PCR反應(yīng)體系組成為：PCR Master Mix(2×)，12.5μL(1×)；各引物濃度如上所述；模板DNA，2.0μL；ddH₂O補(bǔ)足至25μL。

為了驗(yàn)證本發(fā)明的篩查檢測效果以及相應(yīng)的參數(shù)選取的真實(shí)性，對各步驟進(jìn)行具體的驗(yàn)證試驗(yàn)，其具體情況如下：

(1)擴(kuò)增檢測引物的合成：

表1引物序列信息表

(2)待測轉(zhuǎn)基因DNA的小量提取：

采用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的植物基因組DNA提取試劑盒(DP305)提取樣品基因組DNA，稱取轉(zhuǎn)基因粉末樣品200mg，加入70μL洗脫液TE洗脫樣品基因組DNA，其他提取步驟參照試劑盒說明書操作。

采用Thermo Nano Drop 1000紫外分光光度計(jì)測定樣品基因組DNA的濃度和純度，并將樣品DNA濃度稀釋至60ng/μL待測。

(3)六重PCR

①引物濃度梯度和引物退火溫度梯度正交試驗(yàn)：

PCR反應(yīng)體系組成為：PCR Master Mix終濃度為1×，GHB614、LLcotton25、MON1445、MON15985、MON531、MON88913引物終濃度梯度見表2，待測DNA模板2.0μL，補(bǔ)充ddH₂O至體積為25μL。

表2反應(yīng)體系引物終濃度(μmol/L)梯度

在定性PCR儀上運(yùn)行如下反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；然后進(jìn)入35個(gè)循環(huán)，94℃變性30s，退火30s，72℃延伸30s；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸5min。退火溫度梯度為50℃、54℃、56℃、58℃、60℃、64℃。引物濃度梯度和引物退火溫度梯度采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)。結(jié)果見附圖1、2，其中泳道M：size maker；泳道A-H對應(yīng)終濃度梯度1-8；泳道1-6對應(yīng)退火溫度依次為50℃、54℃、56℃、58℃、60℃、64℃。

結(jié)論：由圖1、2結(jié)果可知，GHB614、LLcotton25、MON1445、MON15985、MON531和MON88913引物終濃度(μmol/L)為終濃度4及引物退火溫度為56℃時(shí)，各外源基因特異性條帶擴(kuò)增效率更加一致。

②靈敏度試驗(yàn)：

PCR反應(yīng)體系組成為：PCR Master Mix終濃度為1×，引物濃度配比參照引物濃度梯度試驗(yàn)結(jié)果，待測DNA模板終濃度(ng/μL)梯度2、1、0.5、0.25、0.12、0.06、0.03、0.02、0.01ng/μL，補(bǔ)充ddH₂O至體積為25μL。

在定性PCR儀上運(yùn)行如下反應(yīng)程序：94℃變性5min；然后進(jìn)入35個(gè)循環(huán)，94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸5min。結(jié)果見圖3，其中泳道M：size maker，泳道1-9分別對應(yīng)濃度梯度2、1、0.5、0.25、0.13、0.06、0.03、0.02、0.01ng/μL，泳道10為ddH₂O對照。

結(jié)論：由圖3結(jié)果可知，模板濃度低至0.5ng/μL條件下，GHB614、LLcotton25、MON1445、MON15985、MON531和MON88913的特異性條帶能被清晰判斷。

④已知樣品驗(yàn)證試驗(yàn)：

PCR反應(yīng)體系組成為：PCR Master Mix終濃度為1×，引物濃度配比參照引物濃度梯度試驗(yàn)結(jié)果，待測DNA模板2.0μL，補(bǔ)充ddH₂O至體積為25μL。

在定性PCR儀上運(yùn)行如下反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；然后進(jìn)入35個(gè)循環(huán)，94℃30s，56退火℃30s，72℃30s；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸5min。結(jié)果如圖4所示，其中泳道M：size maker，泳道1：ddH₂O對照，泳道2-15：轉(zhuǎn)基因棉花混合陽性(MON1445+GHB614+MON15985+MON88913+LLcotton25+MON531)、轉(zhuǎn)基因棉花MON1445、GHB614、MON15985、MON88913、LLcotton25和MON531、轉(zhuǎn)基因棉花混合陽性(MON1445+MON15985+MON88913+LLcotton25+MON531)、轉(zhuǎn)基因玉米Bt11、轉(zhuǎn)基因玉米T25、轉(zhuǎn)基因油菜GT73、轉(zhuǎn)基因油菜RF2、轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1、轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2。

結(jié)論：由圖4結(jié)果可知，各已知樣品都能檢測到相關(guān)特異性條帶。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川民族學(xué)院

<120> 一種快速同步檢測6種商業(yè)化應(yīng)用轉(zhuǎn)基因棉花的多重PCR引物及檢測方法

<130>

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> MON1445-F

<400> 1

aatgctggat tttctgcctg tg 22

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> MON1445-R

<400> 2

tccaaaagtc atgcatcatt tctca 25

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> GHB614-F

<400> 3

caaatacact tggaacgact tcgt 24

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> GHB614-R

<400> 4

gcaggcatgc aagcttttaa a 21

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> MON15985-F

<400> 5

atttgatgca ctatgtcttc gtcta 25

<210> 6

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<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> MON15985-R

<400> 6

caatggaatc cgaggaggt 19

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<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

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<223> MON88913-F

<400> 7

taataacgct gcggacatct ac 22

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

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<223> MON88913-R

<400> 8

gagaagcgag acctacaagc c 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

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<223> LLcotton25-F

<400> 9

caaggaacta ttcaactgag 20

<210> 10

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<212> DNA

<213> Artificial

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<223> LLcotton25-R

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caacctgtct gtttgctgac 20

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

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aagagaaacc ccaatcataa aa 22

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<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

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gagaatgcgg taaagatacg tc 22