本發(fā)明涉及一種促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)誘導(dǎo)分化的基質(zhì)材料。

背景技術(shù)：

最近的證據(jù)表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以跨分化為神經(jīng)外胚層細(xì)胞。這已經(jīng)引起了科學(xué)界用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療神經(jīng)系統(tǒng)退行性變和自身免疫性疾病巨大的興趣。骨髓細(xì)胞容易獲得，不僅克服利用胎兒組織相關(guān)的倫理和免疫問(wèn)題而且克服從腦中獲得腦神經(jīng)干細(xì)胞的有關(guān)風(fēng)險(xiǎn)。盡管已知骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有很多潛能，深入了解這些多能干細(xì)胞如何發(fā)育成神經(jīng)細(xì)胞仍是一個(gè)核心問(wèn)題。各國(guó)科學(xué)家在不斷探索如何在體外將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞高效誘導(dǎo)分化。除了多種化學(xué)品和細(xì)胞因子被用于嘗試啟動(dòng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)分化，細(xì)胞外微環(huán)境的特性越來(lái)越被認(rèn)為是影響幼稚骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，活力和分化的相關(guān)細(xì)胞刺激。研究表明，細(xì)胞外基質(zhì)的表面化學(xué)、剛度和納米形貌都對(duì)控制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的命運(yùn)起著重要的作用。能夠容納骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其分化成特定譜系的優(yōu)化支架在各種組織工程和細(xì)胞治療應(yīng)用中是非常可取的。在這里，我們報(bào)告如何通過(guò)煙草花葉病毒產(chǎn)生的納米形貌結(jié)合多價(jià)異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸五肽抗原決定簇顯示與神經(jīng)誘導(dǎo)劑維甲酸協(xié)同啟動(dòng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)樣細(xì)胞表型分化，從而在大鼠脊髓全橫斷后誘導(dǎo)強(qiáng)健的源自骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞神經(jīng)形成。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)誘導(dǎo)分化的基質(zhì)材料。

本發(fā)明解決上述問(wèn)題的技術(shù)方案如下所述：

利用煙草花葉病毒(TMV)的自然結(jié)構(gòu)特征通過(guò)重氮偶聯(lián)和Cu(I)催化疊氮-炔的1,3-偶極環(huán)加成(CuAAC)兩步反應(yīng)在其殼體Y139基團(tuán)鉚接IKVAV配體將其開發(fā)成一種MSC神經(jīng)形成優(yōu)化支架，稱為TMV-IKVAV納米管,如示意圖1所示。

上述技術(shù)方案中，所述的IKVAV配體是異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸五肽抗原決定簇；所述的煙草花葉病毒通過(guò)市售途徑獲得或可采用植物病毒學(xué)方法從感染煙草花葉病毒的煙草葉中提取得到，具體提取方法可參照Gooding GV Jr和Hebert TT所公開的方法實(shí)施(Gooding GV Jr,Hebert TT,A simple technique for purification of tobacco mosaic virus in large quantities,Phytopathology,1967,57(11):1285)。

上述TMV-IKVAV納米管的制備方法由以下步驟組成：

(1)按植物病毒學(xué)方法從感染煙草花葉病毒的煙草葉中提取煙草花葉病毒，然后將其加入到緩沖液中，使煙草花葉病毒在穩(wěn)定液中的重量濃度為15-30mg/mL，得到含煙草花葉病毒的儲(chǔ)存液；

(2)取3-乙炔苯胺1原位生成的重氮鹽；

(3)TMV與3-乙炔苯胺1原位生成的重氮鹽在4℃pH 9的緩沖溶液中處理形成炔烴接枝TMV粒子2。

(4)溴-端基GIKVAV用NaN₃在DMSO衍生化為疊氮-端基GIKVAV 3。

(5)2和3用來(lái)通過(guò)銅(I)催化疊氮-炔環(huán)加成反應(yīng)(CuAAC))合成IKVAV接枝TMV粒子(TMV-IKVAV)。作為一個(gè)通用的CuAAC反應(yīng)方案，2mg/ml 2和3mM 3加入含CuSO₄(1mM)和抗壞血酸鈉(2mM)的Tris緩沖(10mM，pH 7.8)溶液中。在4℃孵育18h后，TMV-IKVAV粒子通過(guò)蔗糖梯度離心純化。

本發(fā)明所述的TMV-IKVAV納米管可按常規(guī)的方法制成涂層覆在細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)表面，以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)誘導(dǎo)分化。

具體地，本發(fā)明一個(gè)方面提供了一種促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的支架粒子，所述支架粒子為煙草花葉病毒與異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸五肽的綴合物。

本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了上述支架粒子的制備方法，其包括如下步驟：

1)將煙草花葉病毒將加入到緩沖液中，使煙草花葉病毒的重量濃度為15-30mg/ml，得到含煙草花葉病毒的儲(chǔ)存液；

2)取3-乙炔苯胺1原位生成的重氮鹽；

3)煙草花葉病毒的儲(chǔ)存液與3-乙炔苯胺1原位生成的重氮鹽在處理形成炔烴接枝煙草花葉病毒粒子；

4)將溴-端基-甘氨酸-異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸六肽用NaN₃衍生化為疊氮-端基-甘氨酸-異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸六肽；5)將步驟3)所得炔烴接枝煙草花葉病毒粒子和步驟4)所得疊氮-端基-甘氨酸-異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸六肽加入含CuSO₄和抗壞血酸鈉的Tris緩沖溶液中，在2-10℃下孵育后純化，獲得異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸五肽接枝煙草花葉病毒支架粒子。

本發(fā)明的再一個(gè)方面提供了一種促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的培養(yǎng)基，其包含煙草花葉病毒或上述的一種促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的支架粒子。

進(jìn)一步地，是將包含煙草花葉病毒或權(quán)利要求1所述的一種促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化的支架粒子涂覆在氨基丙基三乙氧基甲硅烷涂層基板。

進(jìn)一步地，其還含維甲酸，優(yōu)選維甲酸的含量為10-50μM，更優(yōu)選為15-30μM。

進(jìn)一步地，其還含有胎牛血清、青霉素和/或鏈霉素。

本發(fā)明另一個(gè)方面提供了上述支架粒子在促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)誘導(dǎo)分化的應(yīng)用。

本發(fā)明另一個(gè)方面提供了上述的支架粒子在制備促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)基的應(yīng)用。

本發(fā)明另一個(gè)方面提供了上述培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的神經(jīng)細(xì)胞，以及該神經(jīng)細(xì)胞在制備治療神經(jīng)損傷疾病的藥物中的應(yīng)用。

由于煙草花葉病毒為一種具有一定的剛性的自然分子支架，可近似為一個(gè)納米桿，長(zhǎng)300nm，直徑18nm，其獨(dú)特的形狀類似于主要的細(xì)胞外基質(zhì)成分的結(jié)構(gòu)。此外，TMV其衣殼蛋白外表面提供2130個(gè)非?；钴S的酪氨酸-139(Y139)基團(tuán)，可以很容易地用各種各樣的小分子修飾。因此它提供了一種理想的多價(jià)顯示支架能夠沿此納米棒多重顯示活性序列。每個(gè)TMV-IKVAV顆粒上有共約2130個(gè)IKVAV抗原決定簇。充分研究的TMV結(jié)構(gòu)允許精確控制配體的間距和空間取向，其結(jié)果是，大多數(shù)的抗原決定簇可用于與受體結(jié)合；且IKVAV抗原決定簇在TMV-IKVAV表面上高濃度呈現(xiàn)，進(jìn)一步促進(jìn)有效和強(qiáng)大的細(xì)胞-配體相互作用和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

附圖說(shuō)明

圖1為用IKVAV修飾TMV示意圖。

圖2為天然煙草花葉病毒(17528m/z)，炔衍生物2(17656m/z)和TMV-IKVAV(18380m/z)亞基蛋白的基質(zhì)輔助激光解吸離子飛行質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)。

圖3a-f為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在TMV，TMV-IKVAV，laminin和APTES基板的行為結(jié)果。

圖4a-f為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)分化結(jié)果。

圖5a-b為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)五組后肢隨著時(shí)間的推移BBB開放場(chǎng)行走評(píng)分以及術(shù)后三個(gè)月所有五組大鼠的典型表現(xiàn)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1誘導(dǎo)分化的基質(zhì)材料的制備

(1)煙草花葉病毒通過(guò)市售途徑獲得或按植物病毒學(xué)方法從感染煙草花葉病毒的煙草葉中提取，然后將其加入到10mM pH7.4磷酸鹽緩沖液中，使煙草花葉病毒在穩(wěn)定液中的重量濃度為15-30mg/mL，得到含煙草花葉病毒存儲(chǔ)液；

(2)取3-乙炔苯胺原位生成的重氮鹽；

(3)將步驟(1)所得的含煙草花葉病毒緩沖液與3-乙炔苯胺原位生成的重氮鹽在4℃100mM pH 9的硼酸鹽緩沖溶液中處理2小時(shí)形成炔烴接枝煙草花葉病毒粒子；

(4)將溴-端基-甘氨酸-異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸(GIKVAV)用NaN₃在DMSO中衍生化為疊氮-端基GIKVAV；

(5)將2mg/ml步驟(3)所得炔烴接枝煙草花葉病毒粒子和3mM步驟(4)所得疊氮-端基GIKVAV加入含CuSO₄(1mM)和抗壞血酸鈉(2mM)的Tris緩沖(10mM，pH 7.8)溶液中，在4℃下孵育18h后通過(guò)蔗糖梯度離心純化，獲得IKVAV接枝TMV粒子(TMV-IKVAV)；其基質(zhì)輔助激光解吸離子飛行質(zhì)譜見圖2。

(6)氨基丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)涂層基板可由市售途徑獲得，將IKVAV接枝TMV粒子涂覆到細(xì)胞培養(yǎng)APTES基板表面形成致密層，獲得APTES-TMV-IKVAV基板。同時(shí)，也將TMV粒子和層粘連蛋白(laminin)分別涂覆到APTES基板表面，分別得到APTES-TMV和APTES-laminin基板。

實(shí)施例2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)，粘附和鋪展研究

(1)實(shí)驗(yàn)方法

初級(jí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是從80g Sprague-Dawley大鼠的骨髓中分離。該程序是按照南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物護(hù)理和倫理委員會(huì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)方針進(jìn)行。MSC在含10％胎牛血清，100U/ml青霉素，100mg/ml鏈霉素的完全DMEM培養(yǎng)基中，在37℃濕潤(rùn)的5％CO ₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在生長(zhǎng)階段(約90％匯合)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞單層用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化2分鐘從培養(yǎng)板上剝離，并重新懸浮于完全培養(yǎng)基中用于隨后的細(xì)胞粘附研究。

APTES-TMV，APTES-TMV-IKVAV，APTES-laminin和APTES基板(10×10mm²)放入6孔板；在完全DMEM溶液中2mL骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞密度為1×10⁵個(gè)/mL細(xì)胞懸浮液加入到6孔板的每個(gè)孔中，并在濕潤(rùn)的5％CO₂培養(yǎng)箱中于37℃保溫。在接種后2小時(shí)和24小時(shí)分別檢查細(xì)胞在預(yù)涂基板粘附和鋪展，在玻片上的非貼壁細(xì)胞通過(guò)用PBS洗滌去除，貼壁細(xì)胞用甲醛固定和蘇木精-伊紅染色，得到染色的細(xì)胞顯微照片。用INFINITY分析軟件(lumenera公司，渥太華，加拿大)進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析。使用單因素方差分析SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P<0.05的值被認(rèn)為是顯著。

(2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。由圖2可見，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞附著在TMV-IKVAV表面比TMV，laminin和APTES基質(zhì)多4倍，附著增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；與在TMV，Laminin和APTES上的培養(yǎng)相比，TMV-IKVAV上培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖加快，24小時(shí)達(dá)到高匯合，TMV-IKVAV細(xì)胞密度增加達(dá)到近四倍，表明在TMV的表面引入高密度IKVAV抗原決定簇有利于更好的細(xì)胞粘附和增殖。

實(shí)施例3骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)

(1)實(shí)驗(yàn)方法

神經(jīng)預(yù)誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含10％胎牛血清，1％青霉素/鏈霉素和15μM維甲酸的DMEM培養(yǎng)基。神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含10％胎牛血清，1％青霉素/鏈霉素和30μM維甲酸的DMEM培養(yǎng)基。兩種方案被用來(lái)評(píng)估神經(jīng)源性分化。在方案一中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以1×10⁵細(xì)胞/毫升在原代培養(yǎng)基中接種在APTES-TMV，APTES-TMV-IKVAV，APTES-laminin和APTES基板上24小時(shí)，接著用預(yù)誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)后，然后將培養(yǎng)基替換為含30μM視黃酸的神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基。在方案二中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中在ATI基板上以1×10⁵cells/mL接種和培養(yǎng)兩周，每3天換一次培養(yǎng)基。非誘導(dǎo)對(duì)照MSCs在同一時(shí)間內(nèi)只喂含10％小牛血清和1％青霉素/鏈霉素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

(2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)誘導(dǎo)分化(方案一)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。由圖3可見，TMV-IKVAV基質(zhì)快速促進(jìn)大量的神經(jīng)突起生長(zhǎng)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了在TMV、層粘連蛋白、APTES基板上所觀察到的。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR結(jié)果表明，在TMV-IKVAV基質(zhì)上向神經(jīng)分化的MSCs中Otx1呈27.4倍上調(diào)，比在煙草花葉病毒、層粘連蛋白和APTES基質(zhì)上的表達(dá)高3倍多，此外，TMV-IKVAV基質(zhì)上的細(xì)胞nestin的表達(dá)也比在TMV，laminin和APTES基質(zhì)上的細(xì)胞上調(diào)2-3倍。也就是說(shuō)，正如所期望的，TMV-IKVAV顯著上調(diào)Otx1和nestin表達(dá)。

實(shí)施例4脊髓橫斷大鼠移植向神經(jīng)誘導(dǎo)分化骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

(1)實(shí)驗(yàn)方法

所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物護(hù)理和倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(ACEC，SMU)。共有30只成年SD大鼠(150-200g)為研究對(duì)象。將大鼠麻醉，在顯微鏡下進(jìn)行完全的T10橫斷損傷產(chǎn)生的一個(gè)2.0mm的完全橫斷腔，病變腔仔細(xì)地檢查，確保腹側(cè)和橫向完全橫斷病變。動(dòng)物隨機(jī)分為五組，每組6只，如下：組1，在脊髓損傷部位注射0.1ml生理鹽水，作為非治療對(duì)照組，稱為損傷對(duì)照(LC)組；組2，在脊髓橫斷部位植入0.1毫升1×10⁸細(xì)胞/毫升在TMV板上培養(yǎng)的似神經(jīng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，命名為TMV組；組3，在脊髓橫斷部位植入0.1毫升1×10⁸細(xì)胞/毫升在TMV-IKVAV板上培養(yǎng)的神經(jīng)源性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，命名為TMV-IKVAV組；組4，在脊髓橫斷部位植入0.1毫升1×10⁸細(xì)胞/毫升在Laminin板上培養(yǎng)的神經(jīng)源性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，命名為L(zhǎng)aminin組；組5,在脊髓橫斷部位植入0.1毫升1×10⁸細(xì)胞/毫升在APTES板上培養(yǎng)的神經(jīng)源性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，命名為APTES組。逐層縫合關(guān)閉切口。手術(shù)后，大鼠分籠飼養(yǎng)，在12h光/暗周期獲得食物和水自由采食。抗生素給藥，每天兩次，持續(xù)兩周和膀胱輕輕按摩手動(dòng)清空直至反射性膀胱排空約10天后恢復(fù)。

行為評(píng)價(jià)是以開放場(chǎng)BBB評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行(Basso等人，1995，1996)。在一個(gè)開放場(chǎng)(75×120厘米)，動(dòng)物的行為，由兩名研究人員觀察。從0(完全癱瘓)到21(正常步態(tài))的分?jǐn)?shù)，在手術(shù)后的第一個(gè)星期每天記錄，此后每周三次，直到手術(shù)后13周。

(2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。由圖4可見，LC組導(dǎo)致永久性癱瘓和損傷部位以下的感覺(jué)喪失。APTES組和Laminin組后肢運(yùn)動(dòng)恢復(fù)慢，在3個(gè)月的過(guò)程中，左、右后肢BBB評(píng)分沒(méi)有比4更高的；且Laminin組大鼠術(shù)后背部皮膚反復(fù)脫毛，進(jìn)食少，蜷縮畏寒；而APTES組大鼠出現(xiàn)明顯駝背。相比之下，TMV-IKVAV組大鼠術(shù)后第二周后肢肚關(guān)節(jié)即可向前彎曲，BBB評(píng)分最高，并在康復(fù)期繼續(xù)穩(wěn)步上升至3個(gè)月時(shí)BBB評(píng)分達(dá)12.2-16.4，且后肢肌無(wú)萎縮，無(wú)鼓槌指，很活躍，能跨上籠壁伸展身體。TMV組能慢步跛行，緩慢扶籠壁站立，康復(fù)情況優(yōu)于Laminin組和APTES組，但不及TMV-IKVAV組。

在本研究中，TMV納米管被設(shè)計(jì)用來(lái)向骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞多價(jià)呈遞促進(jìn)神經(jīng)突起抗原決定簇IKVAV。我們的研究表明TMV-IKVAV可以用于增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的粘附和增殖，并能促進(jìn)其向神經(jīng)誘導(dǎo)分化；在TMV-IKVAV上骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的神經(jīng)性細(xì)胞移植入嚴(yán)重脊髓損傷部位可以整合入宿主神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)并促進(jìn)恢復(fù)神經(jīng)連接。我們的研究結(jié)果勾勒出一種形式的中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生，對(duì)治療外傷性脊髓損傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有重要意義。