本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種針對靶標(biāo)木薯eIF4E3基因的RNAi載體的制備及針對該RNAi載體的較為快捷和簡便的沉默效果的檢測方法的專利申請。

背景技術(shù)：

RNA沉默又稱RNA干擾（RNAi），是指在真核生物中雙鏈RNA專一的RNaseIII家族的核酸內(nèi)切酶——Dicer或Dicer-like(簡稱DCL)剪切雙鏈RNA或部分雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)產(chǎn)生20 nt長度左右的siRNA（small interference RNA），然后形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，簡稱RISCs)，該復(fù)合體利用RNA序列匹配，專一地識(shí)別靶標(biāo)基因，在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平或翻譯水平抑制靶標(biāo)基因表達(dá)的現(xiàn)象。RNAi普遍存在于大多數(shù)真核生物中，它可以阻斷生物體內(nèi)特定基因的表達(dá)，從而使細(xì)胞表現(xiàn)出特定基因缺失的表型，是一種在進(jìn)化上高度保守的調(diào)節(jié)機(jī)制。RNAi在植物中，除了能調(diào)控其生長發(fā)育外，在植物抵抗病毒的入侵方面同樣起著非常重要的作用。

RNAi技術(shù)因其高度專一性和作用迅速等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于基因功能研究。該技術(shù)可以基于非保守區(qū)設(shè)計(jì)RNAi，用于僅沉默其中的部分成員或單個(gè)成員，也可基于基因保守區(qū)的RNAi設(shè)計(jì)，可以沉默整個(gè)基因家族。因此，RNAi也可以作為多倍體植物調(diào)控基因表達(dá)和探究整個(gè)基因組基因功能研究的有效工具。

已有研究認(rèn)為，在作物遺傳育種中，發(fā)夾結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)的RNAi比反義RNA技術(shù)具有更好的沉默效果和穩(wěn)定性。但由于植物轉(zhuǎn)化工作不僅耗時(shí)長、而且對有些植物而言，轉(zhuǎn)化難度較高，因此很有必要在用于轉(zhuǎn)化植物之前鑒定所構(gòu)建的RNAi載體是否能夠有效的沉默靶標(biāo)基因。

現(xiàn)有檢測RNAi載體沉默效果的方法是：將所構(gòu)建的RNAi載體先轉(zhuǎn)化體系成熟的模式植物如擬南芥等或?qū)朐|(zhì)體后再進(jìn)行RT-PCR檢測，以評(píng)價(jià)沉默效果。但即使是轉(zhuǎn)化體系成熟的模式植物，轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植物至少也需要3個(gè)月的時(shí)間，耗時(shí)顯然較長；而利用原生質(zhì)體檢測沉默效果時(shí)，耗時(shí)雖然相對較短，但由于原生質(zhì)體的制備相對困難，因而該檢測方法也難以有效推廣。基于上述缺陷，探索建立新的、較為快捷的、操作簡便的RNAi載體沉默效果的檢測方法就具有十分重要的應(yīng)用意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的提供一種針對靶標(biāo)木薯eIF4E3基因的RNAi載體及提供一種針對該RNAi載體的快捷和操作簡便的沉默效果的檢測方法，同時(shí)也可為其他RNAi載體沉默效果的評(píng)價(jià)提供借鑒和參考。

本申請所采取的技術(shù)方案詳述如下。

一種靶標(biāo)木薯eIF4E3基因的RNAi載體，其制備過程為：首先構(gòu)建含有反義插入片段的中間載體pRNAiCa4E3R，其次將正義插入片段定向插入中間載體pRNAiCa4E3R，獲得含有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的中間載體pRNAiCa4E3，通過雙酶切、回收含發(fā)夾結(jié)構(gòu)的目的片段并將其定向插入表達(dá)載體pCAMBIA1300，獲得RNAi表達(dá)載體p1300-Ca4E3；具體制備過程包括如下步驟：

（一）首先，構(gòu)建中間載體pRNAiCa4E3R，具體為：

（1）干擾片段選擇

登錄網(wǎng)站sirna.wi.mit.edu，根據(jù)軟件說明書對木薯eIF4E3（015501m）基因進(jìn)行分析，選取eIF4E3基因的第305~494 bp為反義插入片段；

所述木薯eIF4E3基因序列如SEQ ID NO.1所示，

所述木薯eIF4E3基因的第305~494 bp的堿基序列如SEQ ID NO.2所示；

（2）設(shè)計(jì)擴(kuò)增反義插入片段Ca4E3R的引物

為便于定向克隆，在目的片段的5’端分別添加p18TRNAi酶切位點(diǎn)Eco RI和Cla I兩側(cè)的序列，具體引物序列為：

G-Ca4E3-305FE： 5’-AAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCCCTAGTCCCACTGATCTACATCTC-3’，

（其中5’端AAACAGCTATGACCATGATTACGAATTC部分序列為EcoRI酶切位點(diǎn)序列）G-Ca4E3-494RC：

5’-AAAAGAAGAAATAAATAATTTAAATATCGATAGTACTGCACCGCATATGTTATCAC-3’；

（其中5’端AAAAGAAGAAATAAATAATTTAAATATCGAT部分序列為Cla I酶切位點(diǎn)序列）

（3）PCR擴(kuò)增

以pGBKT7-eIF4E3為模板，利用步驟（2）中所設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得反義插入片段Ca4E3R；

（4）構(gòu)建中間載體pRNAiCa4E3R

利用Gibson Assembly技術(shù)，根據(jù)試劑盒說明書，將步驟（3）中所獲得反義插入片段Ca4E3R與經(jīng)EcoRI和ClaI雙酶切后回收的p18TRNAi大片段進(jìn)行連接，實(shí)現(xiàn)將Ca4E3R片段插入到p18TRNAi載體的目的，最終構(gòu)建獲得中間載體pRNAiCa4E3R（其中p表示質(zhì)粒，RNAi表示該質(zhì)粒來源于RNAi克隆載體p18TRNAi；Ca4E3R表示靶標(biāo)木薯eIF4E3基因的反向插入片段）；

（二）其次，構(gòu)建中間載體pRNAiCa4E3，具體為：

（1）干擾片段選擇

登錄網(wǎng)站sirna.wi.mit.edu，根據(jù)軟件說明書對木薯eIF4E3（015501m）基因進(jìn)行分析，選取eIF4E3基因第266~494 bp為正義插入片段；

所述木薯eIF4E3基因第266~494 bp的堿基序列如SEQ ID NO.3所示；

（2）設(shè)計(jì)擴(kuò)增正義插入片段Ca4E3的引物

為便于定向克隆，在目的片段的5’端分別添加上述（一）中構(gòu)建的中間載體pRNAiCa4E3R的酶切位點(diǎn)BamHI和XhoI兩側(cè)的序列，具體引物序列為：

G-Ca4E3-266FB：

5’-TGCATGCCTGCAGGTCGACGATTGGATCCGGGTCTGCTATTGCCACTTGGCTC-3’，

（其中5’端TGCATGCCTGCAGGTCGACGATTGGATCC部分序列為BamHI酶切位點(diǎn)序列）

G-Ca4E3-494RX：

5’-TATGATATCATGCAGGTACGAGCGCTCGAGAGTACTGCACCGCATATGTTATCAC-3’；

（其中5’端TATGATATCATGCAGGTACGAGCGCTCGAG部分序列為XhoI酶切位點(diǎn)序列）

（3）PCR擴(kuò)增

以pGBKT7-eIF4E3為模板，根據(jù)試劑盒說明書，利用步驟2中所設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得正義插入片段Ca4E3F；

（4）構(gòu)建中間載體pRNAiCa4E3

利用Gibson Assembly技術(shù)，根據(jù)試劑盒說明書，將步驟3中所獲得正義插入片段Ca4E3F與經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切后回收的pRNAiCa4E3R大片段進(jìn)行連接，實(shí)現(xiàn)將Ca4E3F片段插入到pRNAiCa4E3R載體的目的，最終構(gòu)建獲得含有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的中間載體pRNAiCa4E3（p表示質(zhì)粒；RNAi表示該質(zhì)粒來源于RNAi克隆載體p18TRNAi；Ca4E3表示含有靶標(biāo)木薯eIF4E3基因的發(fā)夾結(jié)構(gòu)）；

（三）構(gòu)建RNAi載體p1300-Ca4E3，具體為：

將表達(dá)載體pCAMBIA1300與步驟（二）中所構(gòu)建的中間載體pRNAiCa4E3分別進(jìn)行BamHI和EcoRI的雙酶切，分別回收酶切產(chǎn)物并對酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，構(gòu)建獲得RNAi表達(dá)載體p1300-Ca4E3。

對所構(gòu)建的RNAi表達(dá)載體p1300-Ca4E3沉默效果的檢測方法，該方法基于本生煙瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建而成，其主要技術(shù)思路為：首先分別構(gòu)建靶標(biāo)木薯eIF4E3基因的RNAi表達(dá)載體p1300-Ca4E3以及木薯eIF4E3基因的過量表達(dá)載體pAI-Ca4E3，然后利用農(nóng)桿菌注射法將載體在本生煙葉片中表達(dá)，通過半定量RT-PCR比較分析過量表達(dá)載體pAI-Ca4E3單獨(dú)注射或與RNAi表達(dá)載體p1300-Ca4E3共同注射的樣品中eIF4E3基因的表達(dá)情況，判斷和評(píng)價(jià)RNAi表達(dá)載體p1300-Ca4E3對靶標(biāo)木薯eIF4E3基因的沉默效果，具體的操作步驟如下所述：

（一）首先，構(gòu)建中間載體pRNAiCa4E3R，具體為：

（1）干擾片段選擇

登錄網(wǎng)站sirna.wi.mit.edu，根據(jù)軟件說明書對木薯eIF4E3（015501m）基因進(jìn)行分析，選取eIF4E3基因的第305~494 bp為反義插入片段；

（2）設(shè)計(jì)擴(kuò)增反義插入片段Ca4E3R的引物

為便于定向克隆，在目的片段的5’端分別添加p18TRNAi酶切位點(diǎn)Eco RI和Cla I兩側(cè)的序列，具體引物序列為：

G-Ca4E3-305FE： 5’-AAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCCCTAGTCCCACTGATCTACATCTC-3’，

（其中5’端AAACAGCTATGACCATGATTACGAATTC部分序列為EcoRI酶切位點(diǎn)序列）G-Ca4E3-494RC：

5’-AAAAGAAGAAATAAATAATTTAAATATCGATAGTACTGCACCGCATATGTTATCAC-3’；

（其中5’端AAAAGAAGAAATAAATAATTTAAATATCGAT部分序列為Cla I酶切位點(diǎn)序列）

（3）PCR擴(kuò)增

以pGBKT7-eIF4E3為模板，利用步驟（2）中所設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得反義插入片段Ca4E3R；

（4）構(gòu)建中間載體pRNAiCa4E3R

利用Gibson Assembly技術(shù)，根據(jù)試劑盒說明書，將步驟（3）中所獲得反義插入片段Ca4E3R與經(jīng)EcoRI和ClaI雙酶切后回收的p18TRNAi大片段進(jìn)行連接，實(shí)現(xiàn)將Ca4E3R片段插入到p18TRNAi載體的目的，最終構(gòu)建獲得中間載體pRNAiCa4E3R（其中p表示質(zhì)粒，RNAi表示該質(zhì)粒來源于RNAi克隆載體p18TRNAi；Ca4E3R表示靶標(biāo)木薯eIF4E3基因的反向插入片段）；

（二）其次，構(gòu)建中間載體pRNAiCa4E3，具體為：

（1）干擾片段選擇

登錄網(wǎng)站sirna.wi.mit.edu，根據(jù)軟件說明書對木薯eIF4E3（015501m）基因進(jìn)行分析，選取eIF4E3基因第266~494 bp為正義插入片段；

（2）設(shè)計(jì)擴(kuò)增正義插入片段Ca4E3的引物

為便于定向克隆，在目的片段的5’端分別添加上述（一）中構(gòu)建的中間載體pRNAiCa4E3R的酶切位點(diǎn)BamHI和XhoI兩側(cè)的序列，具體引物序列為：

G-Ca4E3-266FB：

5’-TGCATGCCTGCAGGTCGACGATTGGATCCGGGTCTGCTATTGCCACTTGGCTC-3’，

（其中5’端TGCATGCCTGCAGGTCGACGATTGGATCC部分序列為BamHI酶切位點(diǎn)序列）

G-Ca4E3-494RX：

5’-TATGATATCATGCAGGTACGAGCGCTCGAGAGTACTGCACCGCATATGTTATCAC-3’；

（其中5’端TATGATATCATGCAGGTACGAGCGCTCGAG部分序列為XhoI酶切位點(diǎn)序列）

（3）PCR擴(kuò)增

以pGBKT7-eIF4E3為模板，根據(jù)試劑盒說明書，利用步驟2中所設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得正義插入片段Ca4E3F；

（4）構(gòu)建中間載體pRNAiCa4E3

利用Gibson Assembly技術(shù)，根據(jù)試劑盒說明書，將步驟3中所獲得正義插入片段Ca4E3F與經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切后回收的pRNAiCa4E3R大片段進(jìn)行連接，實(shí)現(xiàn)將Ca4E3F片段插入到pRNAiCa4E3R載體的目的，最終構(gòu)建獲得含有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的中間載體pRNAiCa4E3（p表示質(zhì)粒；RNAi表示該質(zhì)粒來源于RNAi克隆載體p18TRNAi；Ca4E3表示含有靶標(biāo)木薯eIF4E3基因的發(fā)夾結(jié)構(gòu)）；

（三）構(gòu)建RNAi載體p1300-Ca4E3，具體為：

將表達(dá)載體pCAMBIA1300與步驟（二）中所構(gòu)建的中間載體pRNAiCa4E3分別進(jìn)行BamHI和EcoRI的雙酶切，分別回收酶切產(chǎn)物并對酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，構(gòu)建獲得RNAi表達(dá)載體p1300-Ca4E3；

（四）構(gòu)建過量表達(dá)載體pAI-Ca4E3，具體為：

（1）設(shè)計(jì)擴(kuò)增eIF4E3基因的引物，在目的片段的5’端分別添加載體pAI-sGFP的XhoI和XbaI酶切序列片段，具體引物設(shè)計(jì)為：

G-Ca4E3-1FX：

5’-ATTTCATTTGGAGAGGACCTCGAGATGGAGATCACTGAGAAGAAGG-3’，

（其中5’端ATTTCATTTGGAGAGGACCTCGAG部分序列為XhoI酶切位點(diǎn)）

G-Ca4E3-687RX：

5’-CTGGTGATTTTTGCGGACTCTAGATTATCCTCTCAACCATGTGTTTCT-3’；

（其中5’端CTGGTGATTTTTGCGGACTCTAGA部分序列為XbaI酶切位點(diǎn)）

（2）PCR擴(kuò)增，以pGBKT7-eIF4E3為模板，利用步驟1中所設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得eIF4E3基因序列；

（3）構(gòu)建載體pAI-Ca4E3，利用Gibson Assembly技術(shù)，根據(jù)試劑盒說明書，將步驟（2）中所獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（即eIF4E3基因序列）與經(jīng)XbaI和 XhoI雙酶切并回收的pAI-sGFP的產(chǎn)物進(jìn)行連接，從而構(gòu)建獲得過量表達(dá)載體pAI-Ca4E3 ；

（五）轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，并進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，具體為：

利用液氮凍融法，將步驟（三）、步驟（四）中所構(gòu)建的RNAi載體p1300-Ca4E3、過量表達(dá)載體pAI-Ca4E3分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，并篩選、鑒定獲得正確的轉(zhuǎn)化菌株；

利用農(nóng)桿菌注射法，將鑒定正確的分別含有p1300-Ca4E3和pAI-Ca4E3的農(nóng)桿菌菌液共同注射本生煙煙葉，以進(jìn)行共表達(dá)；

同時(shí)以單獨(dú)注射含有pAI-Ca4E3農(nóng)桿菌菌液的本生煙煙葉作為空白對照，以同時(shí)注射射含有pAI-Ca4E3農(nóng)桿菌和含GFP的表達(dá)載體pCAMBIA1300的農(nóng)桿菌的本生煙煙葉作為陽性對照；

（六）半定量RT-PCR檢測RNAi表達(dá)載體p1300-Ca4E3的沉默效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，具體為：

（1） 收集步驟（五）中農(nóng)桿菌注射4天后本生煙葉葉片，提取葉片總RNA；

（2）將步驟1中所提取RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈，并將所得cDNA進(jìn)行3倍梯度稀釋作為半定量PCR擴(kuò)增時(shí)模板應(yīng)用；

（3）以NbActin基因?yàn)閮?nèi)參基因，利用如下引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列如下：

NbACT-247F：5’-CAGCCACACTGTCCCAATTTATGAG-3’，

NbACT-780R：5’-CTACCTTAATCTTCATGCTGCTTGGA-3’；

（4）取步驟3中Actin擴(kuò)增大致一致的樣品，利用如下引物序列進(jìn)行eIF4E3基因PCR擴(kuò)增，引物序列如下：

Ca4E3-1F：5’-ATGGAGATCACTGAGAAGAAGG-3’，

Ca4E3-290R：5’-CGAGCCAAGTGGCAATAGCA-3’；

如果RNAi載體能有效的沉默靶標(biāo)eIF4E3基因，那么過量表達(dá)載體pAI-Ca4E3與RNAi表達(dá)載體p1300-Ca4E3共同注射后樣品中的eIF4E3基因表達(dá)量要比單獨(dú)注射過量表達(dá)載體pAI-Ca4E3的樣品低得多；即，根據(jù)半定量RT-PCR結(jié)果，通過比較分析樣品中eIF4E3基因的mRNA水平，就能快速檢測所構(gòu)建的RNAi載體是否能有效沉默靶標(biāo)基因。

木薯等植物的原生體制備和轉(zhuǎn)基因操作等，由于其操作技術(shù)要求相對較高、難度較大，且工作量大，耗時(shí)長，因而針對這類植物體的基因沉默效果檢測時(shí)，如果沿用現(xiàn)有基因沉默檢測方法時(shí)，其操作可行性顯然較低。本發(fā)明所提供的針對木薯eIF4E3基因的沉默效果的檢測方法，其通過常規(guī)干擾載體p1300-Ca4E3及過表達(dá)載體pAI-Ca4E3的構(gòu)建，并將載體共表達(dá)于本生煙瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，進(jìn)一步通過半定量RT-PCR的檢測，即可判定干擾載體對特定基因的沉默效果，從而可以大幅縮短檢測時(shí)間。

總體而言，本申請通過提供靶標(biāo)木薯eIF4E3基因的RNAi載體并通過對該載體沉默效果的檢測，提供了一種較為快捷、操作較為簡便的RNAi載體沉默效果的檢測方法，同時(shí)也可為其他RNAi載體沉默效果的評(píng)價(jià)提供借鑒和參考。所提供檢測方法中，由于不需常規(guī)轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化育種制備過程，且可規(guī)避原生質(zhì)體制備困難的缺陷，因而可大幅縮短檢測時(shí)限；同時(shí)由于相關(guān)轉(zhuǎn)基因操作技術(shù)較為成熟，操作較為簡便且經(jīng)濟(jì)性較好，因而使得本發(fā)明所提供檢測方法具有較好實(shí)用性，同時(shí)也為本領(lǐng)域中其他類似基因沉默效果檢測提供較好的參考和借鑒。

附圖說明

圖1為構(gòu)建干擾載體p1300-Ca4E3過程中部分PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖及鑒定圖，其中1．干擾片段Ca4E3R的PCR擴(kuò)增；2. 中間載體pRNAiCa4E3R的PCR鑒定；3. 干擾片段Ca4E3F 的PCR擴(kuò)增；4. 中間載體pRNAiCa4E3 的PCR鑒定；5. 干擾載體p1300-Ca4E3的PCR鑒定；6. 含載體p1300-Ca4E3的農(nóng)桿菌EHA105的PCR鑒定；M. DL 2000 DNA Marker；

圖2為干擾載體p1300Ca4E3構(gòu)建相關(guān)EcoRI和BamHI雙酶切鑒定結(jié)果，其中1. 載體p18TRNAi；2. 中間載體pRNAiCa4E3R；3. 中間載體pRNAiCa4E3；4. 干擾載體p1300Ca4E3；5.載體pCAMBIA1300；M. DL 15000 DNA Marker；

圖3 為過量表達(dá)載體pAI-Ca4E3 構(gòu)建相關(guān)PCR擴(kuò)增與鑒定結(jié)果，其中1. 目的片段eIF4E3 PCR擴(kuò)增；2. 過量表達(dá)載體pAI-Ca4E3 PCR鑒定；3. 含載體pAI-Ca4E3的農(nóng)桿菌EHA105 PCR鑒定；M. DL 2000 DNA Marker；

圖4為過量表達(dá)載體pAI-Ca4E3 XhoI和XbaI雙酶切鑒定結(jié)果，其中1. 干擾載體pAI-Ca4E3；2. 載體pAI-TCV；M. DL 15000 DNA Marker；

圖5為半定量RT-PCR分析本生煙瞬時(shí)表達(dá)木薯eIF4E3基因，其中1. 過量表達(dá)載體pAI-Ca4E3與干擾載體p1300Ca4E3共同注射；2. 過量表達(dá)載體pAI-Ca4E3單獨(dú)注射；3. 過量表達(dá)載體pAI-Ca4E3與表達(dá)載體pCAMBIA1300共同注射。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本申請做進(jìn)一步的解釋說明，在介紹具體實(shí)施例前，就下述實(shí)施例中部分所涉及部分生物材料、實(shí)驗(yàn)試劑等情況簡要介紹如下：

克隆載體p18TRNAi的原始形式為大連寶生物公司克隆載體pMD18-T；

表達(dá)載體pCAMBIA1300購自BioVector NTCC保藏中心；

pAI-sGFP為pCAMBIA1300經(jīng)改造去除潮霉素篩選標(biāo)記后的載體；

相關(guān)基因測序及引物序列合成均由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行；

本生煙在26~28℃的培養(yǎng)室內(nèi)光照培養(yǎng)，每日光照時(shí)長12 h，光照強(qiáng)度為1500 lx；

EcoRI、BamHI等限制性內(nèi)切酶，連接酶等關(guān)鍵試劑均購自寶生物（大連）有限公司。

實(shí)施例1

由于靶標(biāo)木薯eIF4E3基因的RNAi表達(dá)載體p1300-Ca4E3的構(gòu)建是本申請較為核心技術(shù)部分內(nèi)容，因而本實(shí)施例就該載體的構(gòu)建過程簡要介紹如下。

靶標(biāo)木薯eIF4E3基因的RNAi載體p1300-Ca4E3，其制備過程為：首先構(gòu)建含有反義插入片段的中間載體pRNAiCa4E3R，其次將正義插入片段定向插入中間載體pRNAiCa4E3R，獲得含有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的中間載體pRNAiCa4E3，通過雙酶切、回收含發(fā)夾結(jié)構(gòu)的目的片段并將其定向插入表達(dá)載體pCAMBIA1300，獲得RNAi表達(dá)載體p1300-Ca4E3；具體制備過程詳述如下。

（一）首先，構(gòu)建中間載體pRNAiCa4E3R，具體為：

（1）干擾片段選擇

登錄網(wǎng)站sirna.wi.mit.edu，根據(jù)軟件說明書對木薯eIF4E3（015501m）基因進(jìn)行分析，選取eIF4E3基因的第305~494 bp為反義插入片段。

（2）設(shè)計(jì)擴(kuò)增反義插入片段Ca4E3R的引物

為便于定向克隆，在目的片段的5’端分別添加p18TRNAi酶切位點(diǎn)Eco RI和Cla I兩側(cè)的序列，具體引物序列為：

G-Ca4E3-305FE： 5’-AAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCCCTAGTCCCACTGATCTACATCTC-3’，

（其中5’端AAACAGCTATGACCATGATTACGAATTC部分序列為EcoRI酶切位點(diǎn)序列）G-Ca4E3-494RC：

5’-AAAAGAAGAAATAAATAATTTAAATATCGATAGTACTGCACCGCATATGTTATCAC-3’；

（其中5’端AAAAGAAGAAATAAATAATTTAAATATCGAT部分序列為Cla I酶切位點(diǎn)序列）。

（3）PCR擴(kuò)增

以pGBKT7-eIF4E3為模板，利用步驟（2）中所設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增（采用美國賽默飛世爾Arktik 多功能PCR儀），獲得反義插入片段Ca4E3R；

PCR擴(kuò)增時(shí)50μL擴(kuò)增體系設(shè)計(jì)如下：

10 X Pfu Buffer，5μL；

dNTP Mix (2.5 each)，5μL；

引物G-Ca4E3-305FE，10μM、1μL；

引物Ca4E3-494RC，10μM、1μL；

Pfu，2.5U/μL、1.0μL；

pGBKT7-eIF4E3，1μL；

ddH₂O加至50μL；

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃、3min；98℃、30s，58℃、30s，72℃、30s，30個(gè)循環(huán)；72℃、5min。

對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，結(jié)果如圖1中泳道1所示。擴(kuò)增目標(biāo)片段長度為191bp，從圖1中電泳結(jié)果來看，所擴(kuò)增片段長度符合預(yù)期。

（4）構(gòu)建中間載體pRNAiCa4E3R

利用Gibson Assembly技術(shù)，根據(jù)試劑盒說明書，將步驟（3）中所獲得反義插入片段Ca4E3R與經(jīng)EcoRI和ClaI雙酶切后回收的p18TRNAi大片段進(jìn)行連接，實(shí)現(xiàn)將Ca4E3R片段插入到p18TRNAi載體的目的，經(jīng)Amp+（氨芐西林陽性，100mg/L）篩選，最終構(gòu)建獲得中間載體pRNAiCa4E3R（其中p表示質(zhì)粒，RNAi表示該質(zhì)粒來源于RNAi克隆載體p18TRNAi；Ca4E3R表示靶標(biāo)木薯eIF4E3基因的反向插入片段）。

利用上述步驟（2）中的引物G-Ca4E3-305FE和G-Ca4E3-494RC，對篩選所獲得的中間載體pRNAiCa4E3R的陽性克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定體系設(shè)計(jì)如下：

2X PCR Mix，25μL；

引物G-Ca4E3-305FE，10μM、1μL；

引物Ca4E3-494RC，10μM、1μL；

菌落稀釋液，1μL；

ddH₂O加至50μL；

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃、3min；94℃、30s，55℃、30s，72℃、30s，30個(gè)循環(huán)；72℃、5min。

對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定，結(jié)果如圖1中泳道2所示。從圖中可以看出，擴(kuò)增片段與目的片段Ca4E3R的長度大小一致，初步表明篩選所獲得載體中含有Ca4E3R片段。

進(jìn)一步對篩選所得載體利用EcoRI和BamHI進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切體系及條件如下：

10 x Buffer K，2μL；

EcoRI，1μL；

BamHI，1μL；

待鑒定質(zhì)粒，1μg；

ddH₂O加至50μL；

37℃溫浴2小時(shí)。

對酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳，結(jié)果如圖2泳道2所示。從圖中可以看出，獲得了與預(yù)期一致的、小于500bp的片段。

更進(jìn)一步的測序結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增的Ca4E3R基因片段正確重組進(jìn)入p18TRNAi載體中，表明：中間載體pRNAiCa4E3R構(gòu)建成功，可以用于下一步實(shí)驗(yàn)。

（二）其次，構(gòu)建中間載體pRNAiCa4E3，具體為：

（1）干擾片段選擇

登錄網(wǎng)站sirna.wi.mit.edu，根據(jù)軟件說明書對木薯eIF4E3（015501m）基因進(jìn)行分析，選取eIF4E3基因第266~494 bp為正義插入片段。

（2）設(shè)計(jì)擴(kuò)增正義插入片段Ca4E3的引物

為便于定向克隆，在目的片段的5’端分別添加上述（一）中構(gòu)建的中間載體pRNAiCa4E3R的酶切位點(diǎn)BamHI和XhoI兩側(cè)的序列，具體引物序列為：

G-Ca4E3-266FB：

5’-TGCATGCCTGCAGGTCGACGATTGGATCCGGGTCTGCTATTGCCACTTGGCTC-3’，

（其中5’端TGCATGCCTGCAGGTCGACGATTGGATCC部分序列為BamHI酶切位點(diǎn)序列）

G-Ca4E3-494RX：

5’-TATGATATCATGCAGGTACGAGCGCTCGAGAGTACTGCACCGCATATGTTATCAC-3’；

（其中5’端TATGATATCATGCAGGTACGAGCGCTCGAG部分序列為XhoI酶切位點(diǎn)序列）。

（3）PCR擴(kuò)增

以pGBKT7-eIF4E3為模板，根據(jù)試劑盒說明書，利用步驟2中所設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得正義插入片段Ca4E3F；

擴(kuò)增體系及PCR反應(yīng)程序參考前述中間載體pRNAiCa4E3R構(gòu)建過程中反義插入片段Ca4E3R的制備過程即可。

對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，結(jié)果如圖1中泳道3所示。擴(kuò)增目標(biāo)片段長度為229bp，從圖1中電泳結(jié)果來看，所擴(kuò)增片段長度符合預(yù)期。

（4）構(gòu)建中間載體pRNAiCa4E3

利用Gibson Assembly技術(shù)，根據(jù)試劑盒說明書，將步驟3中所獲得正義插入片段Ca4E3F與經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切后回收的pRNAiCa4E3R大片段進(jìn)行連接，實(shí)現(xiàn)將Ca4E3F片段插入到pRNAiCa4E3R載體的目的，經(jīng)Amp+（氨芐西林陽性，100mg/L）篩選，最終構(gòu)建獲得含有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的中間載體pRNAiCa4E3（p表示質(zhì)粒；RNAi表示該質(zhì)粒來源于RNAi克隆載體p18TRNAi；Ca4E3表示含有靶標(biāo)木薯eIF4E3基因的發(fā)夾結(jié)構(gòu)）。

利用上述步驟（2）中所設(shè)計(jì)G-Ca4E3-266FB和G-Ca4E3-494RX引物，對篩選所獲得的中間載體pRNAiCa4E3的陽性克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定體系及PCR反應(yīng)程序參考上述中間載體pRNAiCa4E3R中菌落PCR鑒定過程即可。

對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定，結(jié)果如圖1中泳道4所示。從圖中可以看出，擴(kuò)增片段與目的片段Ca4E3F的長度大小一致，初步表明篩選所獲得載體中含有Ca4E3F片段。

進(jìn)一步對篩選所得載體利用EcoRI和BamHI進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切體系設(shè)計(jì)如下：

10 x Buffer K，2μL；

EcoRI，1μL；

BamHI，1μL；

待鑒定質(zhì)粒，1μg；

ddH₂O加至50μL；

37℃溫浴2小時(shí)。

對酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳，結(jié)果如圖2泳道3所示。從圖中可以看出，獲得了與預(yù)期一致的、小于500bp的片段。

更進(jìn)一步的測序結(jié)果表明，PCR擴(kuò)增的Ca4E3基因片段正確重組進(jìn)入載體基因組中，表明：中間載體pRNAiCa4E3構(gòu)建成功，可以用于下一步實(shí)驗(yàn)。

（三）構(gòu)建RNAi載體p1300-Ca4E3，具體為：

將表達(dá)載體pCAMBIA1300與步驟（二）中所構(gòu)建的中間載體pRNAiCa4E3分別進(jìn)行BamHI和EcoRI的雙酶切，分別回收酶切產(chǎn)物并對酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，進(jìn)行大腸桿菌轉(zhuǎn)化，并進(jìn)行Kan+（卡那霉素陽性，50mg/L）篩選，獲得陽性克隆，鑒定獲得構(gòu)建正確的RNAi表達(dá)載體p1300-Ca4E3。

酶切時(shí)，50μL酶切體系設(shè)計(jì)如下：

10 X Buffer K，5μL；

BamHI，2.5μL；

EcoRI，2.5μL；

pCAMBIA1300（或pRNAiCa4E3），2μg；

ddH₂O加至50μL；

37℃溫浴2小時(shí)。

酶切結(jié)束后，回收酶切產(chǎn)物中表達(dá)載體pCAMBIA1300的大片段及中間載體pRNAiCa4E3的小片段，利用連接酶進(jìn)行連接，10μL酶切體系設(shè)計(jì)如下：

10 X Ligase Buffer，1μL；

Ligase（連接酶），1μL；

pCAMBIA1300酶切產(chǎn)物，100~200 ng；

pRNAiCa4E3酶切產(chǎn)物，100~200 ng；

ddH₂O 加至10μL；

16℃連接過夜。

轉(zhuǎn)化結(jié)束后，挑取陽性克隆菌株，利用上述步驟（2）中所設(shè)計(jì)G-Ca4E3-266FB和G-Ca4E3-494RX引物，對篩選所獲得的RNAi表達(dá)載體p1300-Ca4E3陽性克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定體系及PCR反應(yīng)程序參考上述中間載體pRNAiCa4E3R中菌落PCR鑒定過程即可。

對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳鑒定，結(jié)果如圖1中泳道5所示。從圖中可以看出，擴(kuò)增片段與目的片段Ca4E3F的長度大小一致，初步表明篩選所獲得載體中含有Ca4E3F片段。

進(jìn)一步對篩選所得RNAi載體p1300-Ca4E3利用EcoRI和BamHI進(jìn)行雙酶切鑒定，

10 x Buffer K，2μL；

EcoRI，1μL；

BamHI，1μL；

待鑒定質(zhì)粒，1μg；

ddH₂O加至50μL；

37℃溫浴2小時(shí)。

對酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳，結(jié)果如圖2泳道4所示。對圖2中泳道4分別與泳道3、5進(jìn)行對比可以看出，雙酶切后，可獲得比sGFP小，但與pRNAiCa4E3一致的大約500 bp的片段產(chǎn)物。

綜合上述菌落PCR鑒定及酶切鑒定結(jié)果，可以認(rèn)為成功構(gòu)建獲得了RNAi載體p1300-Ca4E3。

實(shí)施例2

對實(shí)施例1所構(gòu)建的RNAi表達(dá)載體p1300-Ca4E3沉默效果進(jìn)行檢測，其主要技術(shù)思路為：首先分別構(gòu)建靶標(biāo)木薯eIF4E3基因的RNAi表達(dá)載體p1300-Ca4E3以及木薯eIF4E3基因的過量表達(dá)載體pAI-Ca4E3，然后利用農(nóng)桿菌注射法將載體在本生煙葉片中表達(dá)，通過半定量RT-PCR比較分析過量表達(dá)載體pAI-Ca4E3單獨(dú)注射或與RNAi表達(dá)載體p1300-Ca4E3共同注射的樣品中eIF4E3基因的表達(dá)情況，判斷和評(píng)價(jià)RNAi表達(dá)載體p1300-Ca4E3對靶標(biāo)木薯eIF4E3基因的沉默效果，具體的操作步驟介紹如下。

（一）構(gòu)建RNAi表達(dá)載體p1300-Ca4E3，相關(guān)過程在實(shí)施例1中有詳細(xì)介紹，不再重復(fù)。

（二）構(gòu)建過量表達(dá)載體pAI-Ca4E3，具體為：

（1）設(shè)計(jì)擴(kuò)增eIF4E3基因的引物，在目的片段的5’端分別添加載體pAI-sGFP的XhoI和XbaI酶切序列片段，具體引物設(shè)計(jì)為：

G-Ca4E3-1FX：

5’-ATTTCATTTGGAGAGGACCTCGAGATGGAGATCACTGAGAAGAAGG-3’，

（其中5’端ATTTCATTTGGAGAGGACCTCGAG部分序列為XhoI酶切位點(diǎn)）

G-Ca4E3-687RX：

5’-CTGGTGATTTTTGCGGACTCTAGATTATCCTCTCAACCATGTGTTTCT-3’；

（其中5’端CTGGTGATTTTTGCGGACTCTAGA部分序列為XbaI酶切位點(diǎn)）。

（2）PCR擴(kuò)增，以pGBKT7-eIF4E3為模板，利用步驟1中所設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得eIF4E3基因序列；

PCR擴(kuò)增體系及PCR反應(yīng)程序參考實(shí)施例1中設(shè)置即可。

對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果如圖3泳道1所示。從圖中可以看出，擴(kuò)增片段與目的片段的735bp長度大小一致，擴(kuò)增片段長度符合預(yù)期。

（3）構(gòu)建載體pAI-Ca4E3，利用Gibson Assembly技術(shù)，根據(jù)試劑盒說明書，將步驟（2）中所獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（即eIF4E3基因序列）與經(jīng)XbaI和 XhoI雙酶切并回收的pAI-sGFP的產(chǎn)物進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化，進(jìn)行Kan+（卡那霉素陽性，50mg/L）篩選，獲得陽性克隆，最終鑒定獲得構(gòu)建正確的過量表達(dá)載體pAI-Ca4E3。

對篩選所獲得的陽性克隆，利用上述步驟（2）中所設(shè)計(jì)的G-Ca4E3-1FX和G-Ca4E3-687RX為引物，進(jìn)行菌落PCR鑒定。鑒定體系及PCR反應(yīng)程序參考實(shí)施例1設(shè)置即可。

鑒定結(jié)果如圖3泳道2所示，表明所擴(kuò)增條帶與目的片段eIF4E3（圖3泳道1）大小一致，即，初步證明目的基因整合進(jìn)入載體中。

進(jìn)一步地，以XbaI和 XhoI對所構(gòu)建pAI-Ca4E3載體進(jìn)行雙酶切鑒定。結(jié)果表明，切下的片段比pAI-sGFP切下小，與預(yù)期大小一致（比較圖4泳道1與泳道2）。

上述鑒定結(jié)果表明，eIF4E3基因過量表達(dá)載體pAI-Ca4E3構(gòu)建成功（其中p表示質(zhì)粒，AI表示該質(zhì)粒來源于植物表達(dá)載體pAI-sGFP；Ca4E3表示靶標(biāo)木薯eIF4E3基因的發(fā)夾結(jié)構(gòu)）。

（三）轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，并進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，具體為：

利用液氮凍融法，將步驟（三）、步驟（四）中所構(gòu)建的RNAi載體p1300-Ca4E3、過量表達(dá)載體pAI-Ca4E3分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105，并添加Kan⁺（卡那霉素陽性，50mg/L）、Rif⁺（利福平，50mg/L）和 Str⁺（鏈霉素，50mg/L）三種抗生素的平板進(jìn)行篩選，獲得陽性克隆，并進(jìn)一步鑒定，獲得正確的轉(zhuǎn)化菌株。

鑒定時(shí)，采用菌落PCR鑒定方式進(jìn)行鑒定，反應(yīng)體系及PCR鑒定條件參考實(shí)施例1即可。

對含有RNAi載體p1300-Ca4E3的轉(zhuǎn)化菌株的菌落PCR鑒定（引物采用G-Ca4E3-266FB和G-Ca4E3-494RX），結(jié)果如圖1泳道6所示。從圖中可以看出，擴(kuò)增條帶與目的片段Ca4E3F（圖1泳道3）大小一致，說明p1300-Ca4E3已成功轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌，形成了工程菌，可用于本生煙瞬時(shí)表達(dá)。

對含有過量表達(dá)載體pAI-Ca4E3的轉(zhuǎn)化菌株的菌落PCR鑒定（引物采用G-Ca4E3-1FX和G-Ca4E3-687RX），結(jié)果如圖3泳道8所示。從圖中可以看出，擴(kuò)增條帶與目的片段 eIF4E3（圖3泳道1）大小一致，說明pAI-Ca4E3已成功轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌，形成了工程菌，可用于本生煙瞬時(shí)表達(dá)。

利用農(nóng)桿菌注射法，將鑒定正確的分別含有p1300-Ca4E3和pAI-Ca4E3的農(nóng)桿菌菌液共同注射7葉齡本生煙煙葉（大約移栽后4周可達(dá)7葉齡，培養(yǎng)溫度為28℃，12小時(shí)光照培養(yǎng)），以進(jìn)行共表達(dá)；

同時(shí)以單獨(dú)注射含有pAI-Ca4E3農(nóng)桿菌菌液的本生煙煙葉作為空白對照，以同時(shí)注射射含有pAI-Ca4E3農(nóng)桿菌和含GFP的表達(dá)載體pCAMBIA1300的農(nóng)桿菌的本生煙煙葉作為陽性對照；

注射后28 ℃、12小時(shí)光照培養(yǎng)。

注射時(shí)，注射液制備步驟具體如下：

（1）把含有載體的農(nóng)桿菌菌株分別接種于同時(shí)含Rif + （50μg/mL）和Kan+ （50μg/mL）的LB平板上，28℃培養(yǎng)48~36h；

（2）收集LB板上的陽性克隆，懸浮于5mL同時(shí)含Kan+ （50μg/mL）和Rif + （50μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中，28℃、180rpm震蕩培養(yǎng)12~16h；

（3）將步驟（2）中菌液按照1:50的體積比例接入到同時(shí)含Kan+ （50μg/mL）和Rif + （50μg/mL）的LB溶液中，同時(shí)加入終濃度為10 mmol/L MES（pH 8.2）、150μmol/L AS，28℃、180rpm震蕩培養(yǎng)，使菌液濃度至OD₆₀₀=0.8~1.0左右；

（4）將步驟（3）中菌液25℃、5000rpm離心15min，收集菌體；用終濃度為10mmol/L MgCl₂、10mmol/L MES（pH 8.2）和150μmol/L AS的水溶液重懸菌體沉淀；室溫靜止放置3~5h后作為本生煙葉片注射用注射液體。

（四）半定量RT-PCR檢測RNAi表達(dá)載體p1300-Ca4E3的沉默效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，具體為：

（1） 收集步驟（五）中農(nóng)桿菌注射4天后本生煙葉葉片，提取葉片總RNA；

（2）將步驟1中所提取RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈，并將所得cDNA進(jìn)行3倍梯度稀釋作為半定量PCR擴(kuò)增時(shí)模板應(yīng)用；

（3）以NbActin基因?yàn)閮?nèi)參基因，利用如下引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列如下：

NbACT-247F：5’-CAGCCACACTGTCCCAATTTATGAG-3’，

NbACT-780R：5’-CTACCTTAATCTTCATGCTGCTTGGA-3’；

（4）取步驟3中Actin擴(kuò)增大致一致的樣品，利用如下引物序列進(jìn)行eIF4E3基因PCR擴(kuò)增，引物序列如下：

Ca4E3-1F：5’-ATGGAGATCACTGAGAAGAAGG-3’，

Ca4E3-290R：5’-CGAGCCAAGTGGCAATAGCA-3’；

根據(jù)PCR擴(kuò)增情況，判定eIF4E3基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，并據(jù)此判定RNAi載體對目標(biāo)基因的沉默效果；具體判定原則為：

如果RNAi載體能有效的沉默靶標(biāo)eIF4E3基因，那么過量表達(dá)載體pAI-Ca4E3與RNAi表達(dá)載體p1300-Ca4E3共同注射后樣品中的eIF4E3基因表達(dá)量要比單獨(dú)注射過量表達(dá)載體pAI-Ca4E3的樣品低得多。

PCR結(jié)果如圖5所示。

在采用本生煙NbActin基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)，調(diào)整樣品cDNA濃度基本一致的情況下（比較圖5下圖的所有樣品），過量表達(dá)載體pAI-Ca4E3單獨(dú)注射或與表達(dá)載體pCAMBIA1300共同注射的樣品木薯eIF4E3基因的表達(dá)量都很高，并且表達(dá)量基本一致，說明與所制備的干擾載體僅插入片段不同的表達(dá)載體pCAMBIA1300對過量表達(dá)載體pAI-Ca4E3中eIF4E3基因表達(dá)沒有影響；然而過量表達(dá)載體pAI-Ca4E3與所制備的RNAi載體p1300-Ca4E3 共同注射的樣品僅檢測到微量的木薯eIF4E3基因，說明木薯該基因已被有效的沉默。

由于RNAi載體p1300-Ca4E3與表達(dá)載體pCAMBIA1300的區(qū)別僅在于插入片段分別為靶標(biāo)木薯eIF4E3基因的發(fā)夾結(jié)構(gòu)和sGFP基因，因此發(fā)揮沉默作用的是靶標(biāo)木薯eIF4E3基因的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，說明所制備的RNAi載體p1300-Ca4E3能有效的沉默靶標(biāo)基因，并且利用本生煙瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)能快速檢測RNAi載體的沉默效果。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所

<120> 木薯eIF4E3基因RNAi載體沉默效果的檢測方法

<130> none

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 687

<212> DNA

<213> Manihot esculenta

<400> 1

atggagatca ctgagaagaa ggatacagag aacaacacaa acaacagcaa taataatgct 60

caaacgacat tggattcagc atcacttgag aacatagaca aagaagccga agaacgccaa 120

gcacgcgacc tcaaagctgg gttgcatcct ctcaagcaca agtttgtatt ttggtacact 180

cgccgaacac caggagttcg aacacaaact tcatatgagg ataatataaa gaaaattgtg 240

gagttcagta cagttgaagg cttttgggtc tgctattgcc acttggctcg gccttcatct 300

ttgcctagtc ccactgatct acatctcttc aaggagggaa tccgtcctct atgggaggat 360

tctgcaaact ccaatggagg caagtggata atacgattca aaaaagttgt ctctggtcgc 420

ttttgggagg acatggtgct tgccttagtg ggtgaccaac ttgattatgg tgataacata 480

tgcggtgcag tactaagcat tcgttttaat gaagatatac tgagtgtttg gaatcgtaat 540

tcctctgatc atcaggctgt gatggctcta agggattcga tcaaaaggca cttaaagctt 600

ccccacagct acgttatgga atacaagccc catgatgcgt ctttgcgtga caactcatca 660

tatagaaaca catggttgag aggataa 687

<210> 2

<211> 191

<212> DNA

<213> Manihot esculenta

<400> 2

cctagtccca ctgatctaca tctcttcaag gagggaatcc gtcctctatg ggaggattct 60

gcaaactcca atggaggcaa gtggataata cgattcaaaa aagttgtctc tggtcgcttt 120

tgggaggaca tggtgcttgc cttagtgggt gaccaacttg attatggtga taacatatgc 180

ggtgcagtac t 191

<210> 3

<211> 229

<212> DNA

<213> Manihot esculenta

<400> 3

gggtctgcta ttgccacttg gctcggcctt catctttgcc tagtcccact gatctacatc 60

tcttcaagga gggaatccgt cctctatggg aggattctgc aaactccaat ggaggcaagt 120

ggataatacg attcaaaaaa gttgtctctg gtcgcttttg ggaggacatg gtgcttgcct 180

tagtgggtga ccaacttgat tatggtgata acatatgcgg tgcagtact 229