本發(fā)明屬于食品生物技術(shù)及功能保健領(lǐng)域，具體涉及一種紅曲發(fā)酵海帶水解液制備降血壓肽的方法。
背景技術(shù)：
高血壓是當(dāng)今困擾全世界的一種疾病，它能夠誘發(fā)冠心病、腦卒中和心腎功能衰竭。高血壓的治療需要相當(dāng)長的一段時(shí)間，而目前主要的治療藥物多有一定的毒副作用，不適宜長期服用。隨著人們保健意識和安全意識的增強(qiáng)，在眾多的降血壓藥物中，具有顯著降血壓活性且安全無毒的降血壓肽被逐漸利用于預(yù)防和治療高血壓。
降血壓肽，又稱血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽，是從天然食物蛋白中分離提取的一類小分子肽。與臨床的抗高血壓藥物相比，降血壓肽的降壓效果雖然不如其強(qiáng)烈，但食源性的降血壓肽安全性高，且它只對高血壓患者起降壓作用，對正常血壓的人無明顯降壓效果，適合患者長期服用。因此，它已經(jīng)成為目前降血壓領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。
海帶中含有多糖、氨基酸、維生素以及無機(jī)鹽等營養(yǎng)成分。現(xiàn)代科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，海帶不僅具有降血壓、降血脂、抗氧化、抗突變和增強(qiáng)免疫力等功能，而且有研究發(fā)現(xiàn)海帶的水解產(chǎn)物中含有一定量的降血壓肽活性成分，因此傳統(tǒng)上將其視為海洋中藥。海帶被單一的提取褐藻膠后便是脫膠海帶，脫膠海帶通常被當(dāng)作廢料不再繼續(xù)加工利用。然而，脫膠海帶體內(nèi)仍保留著海帶原有的大部分優(yōu)質(zhì)資源，它的廢棄造成了海帶資源的巨大浪費(fèi)。
紅曲自古具有藥用價(jià)值，發(fā)酵過程中產(chǎn)生γ-氨基丁酸、洛伐他汀、紅曲色素、腺苷、小分子活性組分等降血壓、降血脂活性成分。但目前，國內(nèi)還未見利用紅曲發(fā)酵海帶水解液制備降血壓肽的研究報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種以海帶加工廢棄品脫膠海帶粉為原料，采用酶解與紅曲發(fā)酵相結(jié)合，工藝合理有效，降壓效果良好的紅曲發(fā)酵海帶水解液制備降血壓肽的方法。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，采用如下技術(shù)方案：
一種紅曲發(fā)酵海帶水解液制備降血壓肽的方法，包括以下步驟：
1）原料預(yù)處理：脫膠海帶粉和濃度為1.0～2.0 mol/L的鹽酸以重量比1:10～1:20混合，充分溶解，在超聲波輔助作用下，溫度為45～60℃水解2～6 h，在4000 r/min離心5～10 min，上清液即為海帶預(yù)處理液；
2）海帶水解液制備：調(diào)節(jié)海帶預(yù)處理液的pH為7.0～8.5，在海帶預(yù)處理液中加入混合酶進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，混合酶加入量為海帶預(yù)處理液重量的0.2～3%，轉(zhuǎn)化溫度為35～60℃，轉(zhuǎn)化時(shí)間為2-8 h，生物轉(zhuǎn)化完成后得到海帶水解液；
3）紅曲發(fā)酵培養(yǎng)基制備：在海帶水解液中添加海帶水解液重量的1～2%可溶性淀粉、1～2%蛋白胨、0.05～0.2% MgSO4·7H2O、0.1～0.3% NaNO3、0.2～0.3% KH2PO4、1～3%米糠提取液、2～5%谷氨酸鈉制成紅曲發(fā)酵培養(yǎng)基，pH自然，滅菌后冷卻備用；
4）接種紅曲發(fā)酵：在紅曲發(fā)酵培養(yǎng)基中接種培養(yǎng)基重量7%的紅曲霉菌種種子液，在26～29℃，150~180 rpm的條件下培養(yǎng)7～10天，獲得具有顯著降血壓活性的海帶降血壓肽制品。
步驟2）中所述混合酶為堿性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶中的一種或者幾種的混合。
步驟4）中所述紅曲霉菌種為紫色紅曲霉、叢毛紅曲霉和紅色紅曲霉中一種或一種以上。
所述的工藝中選取以海帶加工廢棄品脫膠海帶粉為原料，先采用物理、化學(xué)相結(jié)合的方法降解海帶中多糖、蛋白等大分子結(jié)構(gòu)，再用混合酶生物轉(zhuǎn)化，最后發(fā)酵消耗水解產(chǎn)生的單糖組分和游離氨基酸，提高了海帶降血壓肽純度及活性，同時(shí)產(chǎn)生γ-氨基丁酸等降血壓生物活性成分。
在紅曲發(fā)酵培養(yǎng)基中，米糠的谷氨酸脫羧酶生物轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉，積累大量的降血壓活性成分γ-氨基丁酸，濃度到達(dá)1200~3000 mg/100g。
一種如上所述的制備方法所得的海帶降血壓肽制品，生物活性肽含量為10.5~16.3 g/100g。經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，在高劑量的處理情況下，海帶降血壓肽制品降低原發(fā)性大鼠血壓37.5 mmHg，具有顯著的降血壓活性。
本發(fā)明的有益效果在于：
1）本發(fā)明科學(xué)合理地選取以海帶加工廢棄品脫膠海帶粉為原料，采用物理、化學(xué)、酶生物轉(zhuǎn)化以及紅曲發(fā)酵相結(jié)合的方法制備的降血壓肽，不僅達(dá)到了海帶資源綜合利用的目的，還提高了海帶降血壓肽的純度及活性，同時(shí)產(chǎn)生γ-氨基丁酸等降血壓生物活性成分；
2）本發(fā)明所用的紅曲能夠在發(fā)酵過程中產(chǎn)生降血壓、降血脂的活性成分γ-氨基丁酸，濃度達(dá)到1200~3000 mg/100g；
3）本發(fā)明制得的海帶降血壓肽制品中生物活性肽含量為10.5~16.3 g/100g。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在高劑量的處理情況下，海帶降血壓肽制品降低原發(fā)性大鼠血壓37.5 mmHg，具有顯著的降血壓活性。
具體實(shí)施例
一種紅曲發(fā)酵海帶水解液制備降血壓肽的方法，包括以下步驟：
1）原料預(yù)處理：脫膠海帶粉和濃度為1.0～2.0 mol/L的鹽酸以重量比1:10～1:20混合，充分溶解，在超聲波輔助作用下，溫度為45～60℃水解2～6 h，在4000 r/min離心5～10 min，上清液即為海帶預(yù)處理液；
2）海帶水解液制備：調(diào)節(jié)海帶預(yù)處理液的pH為7.0～8.5，在海帶預(yù)處理液中加入混合酶進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，混合酶加入量為海帶預(yù)處理液重量的0.2～3%，轉(zhuǎn)化溫度為35～60℃，轉(zhuǎn)化時(shí)間為2-8 h，生物轉(zhuǎn)化完成后得到海帶水解液；
3）紅曲發(fā)酵培養(yǎng)基制備：在海帶水解液中添加海帶水解液重量的1～2%可溶性淀粉、1～2%蛋白胨、0.05～0.2% MgSO4·7H2O、0.1～0.3% NaNO3、0.2～0.3% KH2PO4、1～3%米糠提取液、2～5%谷氨酸鈉制成紅曲發(fā)酵培養(yǎng)基，pH自然，滅菌后冷卻備用；
4）接種紅曲發(fā)酵：在紅曲發(fā)酵培養(yǎng)基中接種培養(yǎng)基重量7%的紅曲霉菌種種子液，在26～29℃，150~180 rpm的條件下培養(yǎng)7～10天，獲得具有顯著降血壓活性的海帶降血壓肽制品。
步驟2）中所述混合酶為堿性蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶中的一種或者幾種的混合。
步驟4）中所述紅曲霉菌種為紫色紅曲霉、叢毛紅曲霉和紅色紅曲霉中一種或一種以上。
紅曲發(fā)酵培養(yǎng)基中米糠的谷氨酸脫羧酶生物轉(zhuǎn)化谷氨酸鈉，積累大量的降血壓活性成分γ-氨基丁酸，濃度到達(dá)1200~3000 mg/100g。
所得的海帶降血壓肽制品中生物活性肽含量為10.5~16.3 g/100g。
本發(fā)明用下列實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于下列實(shí)施例。
實(shí)施例1
一種紅曲發(fā)酵海帶水解液制備降血壓肽的方法，包括以下步驟：
1）原料預(yù)處理：脫膠海帶粉和濃度為2.0 mol/L的鹽酸以重量比1:20混合，充分溶解，在超聲波輔助作用下，溫度為50℃水解3 h，在4000 r/min離心8min，上清液即為海帶預(yù)處理液；
2）海帶水解液制備：在海帶預(yù)處理液中添加3wt%的胃蛋白酶和纖維素酶，其中胃蛋白酶和纖維素酶的質(zhì)量比為1:1，調(diào)節(jié)海帶預(yù)處理液的pH為7.0，轉(zhuǎn)化溫度為35℃，轉(zhuǎn)化時(shí)間為7 h，置于恒溫水浴中反應(yīng)；
3）紅曲發(fā)酵培養(yǎng)基制備：在海帶水解液中添加海帶水解液重量的2%可溶性淀粉、2%蛋白胨、0.2% MgSO4·7H2O、0.3% NaNO3、0.3% KH2PO4、3%米糠提取液、5%谷氨酸鈉制成紅曲發(fā)酵培養(yǎng)基，pH自然，滅菌后冷卻備用；
4）接種紅曲發(fā)酵：在紅曲發(fā)酵培養(yǎng)基中接種培養(yǎng)基重量7%的紫色紅曲霉菌種種子液，在27℃，180 rpm的條件下培養(yǎng)10天，獲得具有顯著降血壓活性的海帶降血壓肽制品。
對所得成品進(jìn)行成分檢測，結(jié)果為：
海帶降血壓肽制品中生物活性肽含量為16.3 g/100g；γ-氨基丁酸濃度達(dá)到3000 mg/100g。
檢驗(yàn)依據(jù)：保健食品功能學(xué)評價(jià)程序與檢驗(yàn)方法
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：
1 實(shí)驗(yàn)材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)對象
1.1.1 樣品處理
供試樣品為不同濃度的產(chǎn)品稀釋液，實(shí)驗(yàn)時(shí)用生理鹽水將樣品配制成各劑量。
1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及檢測環(huán)境條件
實(shí)驗(yàn)用原發(fā)性高血壓大鼠（SHR），雄性，健康清潔級，體重160~200 g，共40只，均由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。檢測環(huán)境條件，溫度范圍25℃，相對濕度范圍70%，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水，大鼠在試驗(yàn)前在動(dòng)物房適應(yīng)一周。
1.2 劑量分組及受試樣品給予時(shí)間
實(shí)驗(yàn)設(shè)三個(gè)劑量組、一個(gè)陰性對照組和一個(gè)陽性對照組，受試時(shí)間為28 d。
1.3 實(shí)驗(yàn)步驟
SHR大鼠在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)一周后，根據(jù)所測基礎(chǔ)血壓和體重，將40只隨機(jī)分為5組，每組8只，分別是：空白對照組（生理鹽水），海帶降血壓肽高、中、低劑量三組(依次為80、40、20 mg/kg)，以及陽性對照組（卡托普利5 mg/kg）。各組分別灌胃給予相應(yīng)受試物，每日一次，連續(xù)給予4周。給藥結(jié)束后每周測定一次大鼠的血壓，每次重復(fù)測定三次取平均值，血壓的測定采用大鼠尾動(dòng)脈收縮壓法測定。實(shí)驗(yàn)前一周對受試大鼠進(jìn)行多次血壓測量，以便其適應(yīng)測壓環(huán)境。
1.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
采用spss19.0和sigmaplot11.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)匯總與分析。
2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
2.1 海帶降血壓肽制品對大鼠血壓的影響
表1 海帶降血壓肽制品對大鼠血壓的影響
由表1可見，大鼠給予受試物前(0 d)，各實(shí)驗(yàn)組血壓含量與空白對照組比較無顯著性差異(p＞0.05)。在喂養(yǎng)SHR大鼠一定時(shí)期（7、14、21、28 d）后，各劑量組與給受試物之前和空白組比較，血壓的差異有顯著性(p＜0.01)，隨著持續(xù)給藥時(shí)間的延長，SHR大鼠血壓下降的趨勢減緩并逐漸趨于穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)至第28 d時(shí)，與空白組對比，低劑量組下降了21.4 mmHg，中劑量組下降了30.5 mmHg，高劑量組下降了37.5 mmHg。表明該海帶降血壓肽制品具有明顯降低血壓的作用。
2.2 海帶降血壓肽制品對大鼠體重的影響
表2 海帶降血壓肽制品對大鼠體重的影響
由表2可見，大鼠給受試物前（0 d），各組體重沒有顯著差異。給受試物一定時(shí)期(7 、14 、21 、28 d)后，與空白對照組相比，其余各組體重均未出現(xiàn)顯著差異(p＞0.05)。表明該海帶降血壓肽制品對大鼠生長發(fā)育沒有不良影響。
2.3 海帶降血壓肽制品對大鼠心率的影響
表3 海帶降血壓肽制品對大鼠心率的影響
由表3可見，SHR大鼠在給藥前后心率變化均未出現(xiàn)顯著差異(p＞0.05)。表明該海帶降血壓肽制品對大鼠生長發(fā)育沒有不良影響。
3 結(jié)論
綜上所述，實(shí)驗(yàn)前后SHR大鼠的體重、心率變化均未出現(xiàn)顯著差異(p＞0.05)。表明該海帶降血壓肽制品對大鼠生長發(fā)育沒有不良影響。而各劑量組的SHR大鼠血壓雖然較卡托普利組的降壓效果差，但仍呈一定的下降趨勢，其中，低劑量組下降21.4 mmHg，中劑量組下降30.5 mmHg，高劑量組下降37.5 mmHg。高劑量組說明該海帶降血壓肽制品具有顯著的降血壓活性。
實(shí)施例2
一種紅曲發(fā)酵海帶水解液制備降血壓肽的方法，包括以下步驟：
1）原料預(yù)處理：脫膠海帶粉和濃度為1.0mol/L的鹽酸以重量比1:10混合，充分溶解，在超聲波輔助作用下，溫度為45℃水解5 h，在4000 r/min離心10 min，上清液即為海帶預(yù)處理液；
2）海帶水解液制備：在海帶預(yù)處理液中添加1wt%的堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和果膠酶，其中堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和果膠酶的重量比為1:1:2，調(diào)節(jié)海帶預(yù)處理液的pH為8.5，轉(zhuǎn)化溫度為50℃，轉(zhuǎn)化時(shí)間5 h，置于恒溫水浴中反應(yīng)；
3）紅曲發(fā)酵培養(yǎng)基制備：在海帶水解液中添加海帶水解液重量的1%可溶性淀粉、1%蛋白胨、0.05% MgSO4·7H2O、0.1% NaNO3、0.2% KH2PO4、1%米糠提取液、3%谷氨酸鈉制成紅曲發(fā)酵培養(yǎng)基，pH自然，滅菌后冷卻備用；
4）接種紅曲發(fā)酵：在紅曲發(fā)酵培養(yǎng)基中接種培養(yǎng)基重量7%的紅色紅曲霉菌種種子液，在29℃，150 rpm的條件下培養(yǎng)10天，獲得具有顯著降血壓活性的海帶降血壓肽制品。
對所得成品進(jìn)行成分檢測，結(jié)果為：
海帶降血壓肽制品中生物活性肽含量為14.5 g/100g；γ-氨基丁酸濃度達(dá)到2200mg/100g。
檢驗(yàn)依據(jù)同實(shí)施例1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)前后SHR大鼠的體重、心率變化均未出現(xiàn)顯著差異(p＞0.05)。表明該海帶降血壓肽制品對大鼠生長發(fā)育無不良影響。而各劑量組的SHR大鼠血壓變化情況為：低劑量組下降14.6 mmHg，中劑量組下降21.3 mmHg，高劑量組下降29.8 mmHg。說明該海帶降血壓肽制品具有顯著的降血壓活性。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。