本發(fā)明涉及麥芽寡糖基海藻糖水解酶及其表達基因與應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

海藻糖是由兩分子葡萄糖通過α-1,1糖苷鍵結(jié)合而成的一種安全的非還原性二糖，廣泛存在于植物、動物及微生物中。海藻糖具有廣泛的生物學(xué)意義，在醫(yī)藥中是一種很好的穩(wěn)定劑，可用來保護激素、維生素、抗生素、生物制劑、酶、抗血清、疫苗等易失活的物質(zhì)；在化妝品中可以維持細胞活力，具有保濕、抗輻射的作用；在農(nóng)業(yè)中可維持作物在高溫、高旱、高鹽條件下的正常生長；在食品中被用作改善質(zhì)量和風(fēng)味的天然添加劑，同時還具有保鮮的作用；因此在科學(xué)界被譽為“生命之糖”。

目前生產(chǎn)海藻糖的方法主要包括單酶法以及雙酶法。單酶法主要利用海藻糖合酶以麥芽糖為底物生成海藻糖，但該酶的穩(wěn)定性差，極易失活，目前并沒有利用該工藝大規(guī)模生產(chǎn)海藻糖的報道。雙酶法是利用麥芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)、麥芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)，以直鏈淀粉為底物直接催化生成海藻糖。MTSase主要催化分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)，將淀粉的還原性末端的α-1,4-糖苷鍵轉(zhuǎn)化為α-1,1-糖苷鍵，得到中間產(chǎn)物麥芽寡糖基海藻糖；MTHase專一的內(nèi)切該中間產(chǎn)物中麥芽寡糖基與海藻糖連接的α-1,4-糖苷鍵，產(chǎn)生一分子海藻糖和減少2個葡萄糖單位的新麥芽寡糖，并作為新的底物進行下一輪反應(yīng)。目前雙酶法是最經(jīng)濟實用的工藝路線，且被應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。

麥芽寡糖基海藻糖合成酶和麥芽寡糖基海藻糖水解酶最早在節(jié)桿菌(Arthrobactor sp.StrainQ36)中被發(fā)現(xiàn)報道，后來又在根瘤菌(Rhizobium sp.Strain M11)，微黃短桿菌(Brevibactierium helvolum)，嗜酸熱硫化葉菌(Sulfolobus acidocaldarius ATCC33909)中相繼發(fā)現(xiàn)了這兩種酶。不同來源的MTSase和MTHase具有不同的酶學(xué)特性，Arthrobactor sp.StrainQ36的最適反應(yīng)溫度40℃、pH6.5，轉(zhuǎn)化率高達80％，Sulfolobus acidocaldarius ATCC33909具有較高的最適反應(yīng)溫度75℃以及較低的pH 5.0，但酶活力均很低。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供麥芽寡糖基海藻糖水解酶及其表達基因與應(yīng)用。

本發(fā)明技術(shù)方案如下：

麥芽寡糖基海藻糖水解酶表達基因MTHase，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

上述麥芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

一種重組表達載體，表達載體中插入了上述表達基因MTHase。

優(yōu)選的，所述表達載體為表達載體pET-22b(+)。

一種重組細胞，含有上述重組表達載體。

優(yōu)選的，所述的重組細胞通過將上述表達載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)后獲得。

上述麥芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase、上述表達基因MTHase、上述重組細胞在制備生產(chǎn)海藻糖中的應(yīng)用。

有益效果

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了由氧化節(jié)桿菌(Arthrobacter oxydans)提取獲得的麥芽寡糖基海藻糖水解酶表達基因MTHase，該基因表達的麥芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase最適溫度為57℃，最適pH5.5，以20％麥芽五糖為底物生產(chǎn)麥芽五糖基海藻糖，酶活可達到35.7U/ml，顯著優(yōu)于現(xiàn)有已知的麥芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase，該酶與同樣來源于氧化節(jié)桿菌(Arthrobacter oxydans)共同作用生產(chǎn)海藻糖時，產(chǎn)率高，具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1是MTSase、MTHase基因獲得過程的流程圖；

圖2是MTSase基因PCR擴增后的電泳檢測結(jié)果照片；

圖3是MTHase基因PCR擴增后的電泳檢測結(jié)果照片；

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步說明，但本發(fā)明所保護范圍不限于此。

菌種來源

所述氧化節(jié)桿菌(Arthrobacter oxydans)購自中國普通微生物保藏中心(CGMCC)，保藏編號NO.1.1925。

實施例1：氧化節(jié)桿菌(Arthrobacter oxydans)基因組總DNA的提取。

將-80℃下保存的氧化節(jié)桿菌(Arthrobacter oxydans)菌株接種至LB液體培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)中活化培養(yǎng)24小時，其后按照1％接種量接種至新鮮LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時，取10mL菌液按照上海生工細菌基因組提取試劑盒所提供的方法提取該菌基因組總DNA。

實施例2：MTSase、MTHase基因的獲取

MTSase、MTHase基因的獲取如圖1所示，根據(jù)同源比對分別設(shè)計簡并引物F1和R1、F2和R2。

F1：GGTTCCGSGTGSGASGTGAAGAACTGCCA

R1：TTGGCCATSACCATKCCSGAGGTCTGCTGGAA

F2：ATCTACGARCTSCACSTGGGCACCTT

R2：GGTTCCGSGTGSGASGTGAAGAACTGCCA

以實施例1制得的基因組總DNA為模板，分別以F1(上游引物)、R1(下游引物)和F2(上游引物)、R2(下游引物)為引物，利用TaKaRa公司的Ex TaqTM試劑盒根據(jù)產(chǎn)品說明書進行PCR擴增；

所述PCR擴增體系如下：

基因組DNA 2μL，上游引物2μL，下游引物2μL，Taq酶25μL，ddH₂O 19μL。

PCR條件為：95℃變性5min；95℃變性30sec，64℃退火30sec，72℃延伸1min，共30個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。

凝膠電泳分別得到兩條1000bp左右條帶，割膠回收。將PCR產(chǎn)物分別與pTOPO-T載體連接轉(zhuǎn)化進DH5α中，挑選陽性克隆子，送至上海生工測序，記做測序結(jié)果1。

根據(jù)測序結(jié)果1與同源序列設(shè)計簡并引物F3和R3、F4和R4、F5和R5。

F3：ACSCGGCGGTAGGGCATGGWTTC

R3：CCGGGCAGTGGAGCGACGACT

F4：CCCGCCGTAGCCTTCATGGAC

R4：ACCTCGGGAATGGTCATGGC

F5：CTTGTCCAGGTCGTCGTCCGAG

R5：CTTGTCCAGGTCGTCGTCCGAG

以實施例1制得的基因組總DNA為模板，分別以F3(上游引物)和R3(下游引物)、F4(上游引物)和R4(下游引物)、F5(上游引物)和R5(下游引物)為引物，利用TaKaRa公司的Ex TaqTM試劑盒根據(jù)產(chǎn)品說明書進行進行PCR擴增；

所述PCR擴增體系如下：

基因組DNA 2μL，上游引物2μL，下游引物2μL，Taq酶25μL，ddH₂O 19μL。

PCR條件為：95℃變性5min；95℃變性30sec，64℃退火30sec，72℃延伸1.5min，共30個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存；

凝膠電泳分別得到1000bp、1000bp、1500bp左右條帶，割膠回收。將PCR產(chǎn)物分別與pTOPO-T載體連接轉(zhuǎn)化進DH5α中，挑選陽性克隆子，送至上海生工測序，記做測序結(jié)果2。

根據(jù)測序結(jié)果2可得到MTSase和MTHase基因首尾堿基序列，以及目標載體pET-22b序列，借助引物設(shè)計軟件CE Design V1.03設(shè)計無縫克隆多片段嵌合體引物F6和R6，F(xiàn)7和R7。黑體部分為酶切位點Nde I和Xho I。

F6：taagaaggagatataAGGGTCCCGGCATCCAC

R6：gtggtggtggtggtgTGCCTTTTCTCCATCCGCC

F7：taagaaggagatataATGACCCTCGTCAATGGCGG

R7：gtggtggtggtggtgGGATTTGACGATTGCCGCA

以實施例1制得的基因組總DNA為模板，分別以F6(上游引物)和R6(下游引物)，F(xiàn)7(上游引物)和R7(下游引物)為引物，利用TaKaRa公司的Ex TaqTM試劑盒根據(jù)產(chǎn)品說明書進行PCR擴增；

所述PCR擴增體系如下：

基因組DNA 2μL，上游引物2μL，下游引物2μL，Taq酶25μL，ddH₂O 19μL。

PCR條件為：95℃變性5min；95℃變性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸2.5min，共30個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存；

凝膠電泳分別得到2300bp和1800bp左右條帶，如圖2、圖3所示，與理論值相符，割膠回收。

實施例3：重組質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

將純化后的目的基因MTSase、MTHase產(chǎn)物分別和線性化后的載體pET-22b(+)/(Nde I、Xho I)連接，連接體系如表1所示，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中，37℃200r/min培養(yǎng)1h，隨后將轉(zhuǎn)化細胞涂布在含有100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上，37℃恒溫過夜培養(yǎng)，挑取單菌落并通過菌落PCR篩選得到陽性克隆子，送至上海生工測序，結(jié)果表明插入片段分別含有一個長2328bp(如SEQ ID NO:1所示)和1770bp(如SEQ ID NO:3所示)的開放閱讀框(ORF)，分別編碼由775和589個氨基酸編碼的蛋白質(zhì)。

表1：連接體系

實施例4：重組菌株的誘導(dǎo)表達

將重組菌株E.coli BL21(pET-22b-MTSase)和E.coli BL21(pET-22b-MTHase)按照質(zhì)量百分比1％的接種量接種到50mL含濃度為100μg.mL^-1氨芐青霉素(Amp)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.8，加入IPTG誘導(dǎo)劑后，再轉(zhuǎn)入22℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱進行誘導(dǎo)表達。誘導(dǎo)12h后收集菌體5000r/min離心5min，加入10mL pH 6.47的磷酸鹽緩沖液重懸菌體，進行超聲破碎(功率300W、間歇時間6s、破碎時間4s、全程13min)，8000rpm離心10min收集上清液作為粗酶液。

所述LB液體培養(yǎng)基，每升組分如下：

蛋白胨10g/L、酵母浸粉5g/L、NaCl 10g/L，pH 7.0～7.4；

實施例5：Ni-NTA親和層析純化

取出保存在4℃冰箱的鎳柱，用酒精重懸填料并在填料完全下沉后將柱內(nèi)酒精全部放出。用5-10倍體積的Ni-Native-0緩沖液平衡填料，流速控制為1mL/min；加入實施例4所得粗酶液，保持流速1mL/min 30min，收集流出液；用Ni-Native-100緩沖液溶解目的蛋白，控制流速為1mL/min，并收集流出液；用Ni-Native-250緩沖液溶解目的蛋白，流速為1mL/min，收集流出液；加入5-10倍體積的Ni-Native-0緩沖液平衡柱子，并用體積百分比為30％的乙醇溶液保存填料，收集到的酶液樣品進行SDS-PAGE分析，得到MTSase和MTHase的分子量分別為85000Da和65000Da。

實施例6：MTSase和MTHase酶活的測定

MTSase酶活測定：將麥芽五糖溶解于50m mol/L pH 5.5的磷酸-檸檬酸緩沖液中，配成質(zhì)量濃度為20％的溶液，取100mL該溶液加入1mL MTSase酶液，50℃反應(yīng)10min，100℃煮沸10min終止反應(yīng)。待溶液冷卻后，調(diào)節(jié)pH4.2，加入0.1mL糖化酶，50℃糖化24h，HPLC測定海藻糖的量。

MTSase酶活單位(U)定義：每1min轉(zhuǎn)化麥芽五糖生成1m mol麥芽五糖基海藻糖所需要的酶量。

MTHase酶活測定：將麥芽五糖溶解于50m mol/L pH 5.5的磷酸-檸檬酸緩沖液中，配成質(zhì)量濃度為20％的溶液，取100mL該溶液加入200U MTSase酶液，50℃反應(yīng)5h，100℃煮沸10min終止反應(yīng)。待溶液冷卻后，調(diào)節(jié)pH5.5，加入1mL MTHase酶液，50℃反應(yīng)10min，100℃煮沸10min終止反應(yīng)，HPLC測定海藻糖的量。

MTSase酶活單位(U)定義：每1min水解麥芽五糖生成1m mol海藻糖所需要的酶量。

經(jīng)測定，MTSase和MTHase的酶活分別為35.7U/mL和80.2U/mL。

實施例7：雙酶法在海藻糖中的應(yīng)用

將可溶性淀粉溶于50m mol/L的磷酸-檸檬酸緩沖液中，配成質(zhì)量濃度為20％的淀粉溶液，80℃糊化10min，加入α-淀粉酶100U(g淀粉)-¹，50℃反應(yīng)10min，120℃滅活α-淀粉酶，將MTSase和MTHase粗酶液加入到淀粉溶液中，在pH5.5的條件下60℃反應(yīng)24h，海藻糖的轉(zhuǎn)化率為82.5％。

本發(fā)明兩種酶MTSase和MTHase與其他來源的雙酶比較，具有較高的最適反應(yīng)溫度60℃，以及較低的最適pH5.5，更適用于工業(yè)化生產(chǎn)，以質(zhì)量分數(shù)為20％的淀粉溶液為底物，雙酶作用條件下反應(yīng)24h，轉(zhuǎn)化率可高達82.5％。

對比例：

本發(fā)明中麥芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)與專利文獻CN103205475A(申請?zhí)?01310128939.1)中實施例3-1制備的MTHase在本發(fā)明實施例6中所述的條件下反應(yīng)，本發(fā)明中MTHase的酶活可高達80.2U/mL，高于專利文獻CN103205475A(申請?zhí)?01310128939.1)中所述MTHase的酶活72.5U/mL。

本發(fā)明中麥芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)與專利文獻CN103205475A(申請?zhí)?01310128939.1)中麥芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)共同作用于直鏈淀粉，在本發(fā)明實施例7的條件下反應(yīng)，轉(zhuǎn)化率僅為70.5％；本發(fā)明中MTSase與同樣來源于該菌株的MTHase共同作用，轉(zhuǎn)化率可高達82.5％。

SEQUENCE LISTING

<110> 齊魯工業(yè)大學(xué)

<120> 麥芽寡糖基海藻糖水解酶及其表達基因與應(yīng)用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2328

<212> DNA

<213> Arthrobacter oxydans

<400> 1

atgagggtcc cggcatccac ctaccgactt cagatccgcc gcagcttcac cctgttcgac 60

gccgccgaca aggtcccgta cctcaaggac ctcggcgttg actgggtcta cctctcgccc 120

atcctcaccg cggagcaggg ctcggatcac ggctacgacg tgaccgaccc ctccgcggtg 180

gacccggagc ggggcggccc cgagggcctg ctggccctgt ccaaggctgc ccgcgagcac 240

ggcatgggtg tcctggtgga catcgtgccc aaccacgtgg gcgtagcgac gcccgtgcag 300

aacccctggt ggtggtccct gctgaaggaa gggcagggct cgccctacgc cgaagccttc 360

gacgtcgact gggacctggc aggcgggaag atccggctgc ccatgcttgg ctcggacgac 420

gacctggaca agcttgaaat caaggacggc gagctccgct actacgacca ccggttcccg 480

ctcgcttcgg gaagctactc ggagggcgac tccccccagg aagtgcacag ccggcagcac 540

tatgagctga tggactggcg ccgggcggac gccgaactga actaccggcg cttcttcgca 600

gtgaccacgt tggccgggat ccgggtggaa acccccaagg tcttcgagga agcacatgcc 660

gaggtgggcc gctggttcaa ggaaggcctg gtggacggcc tgcgggttga ccacccggac 720

ggcctggccg accccgccgg ctacctgcgc tggctgaagg acctcagcgg cggagcctac 780

gtcctggtgg aaaagatcct cgagccgggc gaaaccctgc cgcaggactt cgccaccgag 840

ggaaccaccg ggtacgacgc cctcgcggac gtggaccggg tgttcgtgga ccccgcaggc 900

cagcaggcgc tggacgagct cgacgcgaag cttcgcggct ccagcacccc cgcggactac 960

gcggagatga tcaggggcac caagcggatg atcgcggacg gcatcctgcg gtccgaggtc 1020

ctgcgcctgg cccgcctggt accggagtcc tatgggctgc cggtggagca ggcagcagat 1080

gccattgccg agatcatcgc tgccttcccg gtctaccgga cgtacctgcc caccggcgcc 1140

gagatcctca aggaagcgtg cgaatcagcg gcggcccacc ggcccgacct cgaggttgcc 1200

gtgggcaccc tgctgccgct gctccttgat cccgggaacc ccatcgcggt ccgcttccag 1260

cagacctcgg gaatggtcat ggccaagggc gtcgaggaca cggcgttcta ccgctacacc 1320

cgcctgggca ccctgacaga ggtgggggcc gaaccgacag agttctctgt ttccacggcc 1380

gagttccacc agcggatggc ccggcgccaa caggaacttc ccctgtccat gaccaccatg 1440

tccacgcatg acaccaagcg cagcgaggac gcccgggccc ggatctcggt catcgccgaa 1500

ctgccggagg agtgggcgga caccttggcc acgctccgcg gactcgcccc gattccggac 1560

ggcccctacg agaacctgct gtggcaggct gtggtggggg cttggcccgc aagcagggaa 1620

cgcctgcagg gctacgccga gaaggctgcc cgggaagccg gcaactccac cacctggacc 1680

agccccgacg aggacttcga atcctccgtc aaggccgcgg tggacgcagt gttcgacgac 1740

ggccgcgtca ccaaagcggt ggaggacttc gtggcacgga tcgattccta cgccgcgtcc 1800

aactccgtgt ccgccaagct ggtccagctg accatgcccg gcgtgccgga tgtttaccag 1860

ggcagcgagt tctgggaacg gtccctgacc gaccccgaca accggcggcc ggtggacttt 1920

gaagtccgcc ggcaggagct cgccaagctc gacgccggca ccctccccgc ggccggcacg 1980

gaacccagca agctcctggc cacgtcccgc gcgctccggc tccgccgcga ccggcccgaa 2040

ctgttccagg gctacagccc cgtgacagcc acgggcccgg cggcggatca cgtcctcgcg 2100

ttccaccgcg ggggtgacgg cgccctgggc gccctgaccc tggccacccg gcttcccgcc 2160

ggactcgcgg ccgacggcgg atggcgggac accgccgtcg agcttcccgt tgcggtgtgt 2220

gacgaactca ccggcaacgc ctacggaccc ggctccgttc cggtggccga ggtcctgggc 2280

acctaccccg tggcattgct cgtaccggcg gatggagaaa aggcatga 2328

<210> 2

<211> 775

<212> PRT

<213> Arthrobacter oxydans

<400> 2

Met Arg Val Pro Ala Ser Thr Tyr Arg Leu Gln Ile Arg Arg Ser Phe

1 5 10 15

Thr Leu Phe Asp Ala Ala Asp Lys Val Pro Tyr Leu Lys Asp Leu Gly

20 25 30

Val Asp Trp Val Tyr Leu Ser Pro Ile Leu Thr Ala Glu Gln Gly Ser

35 40 45

Asp His Gly Tyr Asp Val Thr Asp Pro Ser Ala Val Asp Pro Glu Arg

50 55 60

Gly Gly Pro Glu Gly Leu Leu Ala Leu Ser Lys Ala Ala Arg Glu His

65 70 75 80

Gly Met Gly Val Leu Val Asp Ile Val Pro Asn His Val Gly Val Ala

85 90 95

Thr Pro Val Gln Asn Pro Trp Trp Trp Ser Leu Leu Lys Glu Gly Gln

100 105 110

Gly Ser Pro Tyr Ala Glu Ala Phe Asp Val Asp Trp Asp Leu Ala Gly

115 120 125

Gly Lys Ile Arg Leu Pro Met Leu Gly Ser Asp Asp Asp Leu Asp Lys

130 135 140

Leu Glu Ile Lys Asp Gly Glu Leu Arg Tyr Tyr Asp His Arg Phe Pro

145 150 155 160

Leu Ala Ser Gly Ser Tyr Ser Glu Gly Asp Ser Pro Gln Glu Val His

165 170 175

Ser Arg Gln His Tyr Glu Leu Met Asp Trp Arg Arg Ala Asp Ala Glu

180 185 190

Leu Asn Tyr Arg Arg Phe Phe Ala Val Thr Thr Leu Ala Gly Ile Arg

195 200 205

Val Glu Thr Pro Lys Val Phe Glu Glu Ala His Ala Glu Val Gly Arg

210 215 220

Trp Phe Lys Glu Gly Leu Val Asp Gly Leu Arg Val Asp His Pro Asp

225 230 235 240

Gly Leu Ala Asp Pro Ala Gly Tyr Leu Arg Trp Leu Lys Asp Leu Ser

245 250 255

Gly Gly Ala Tyr Val Leu Val Glu Lys Ile Leu Glu Pro Gly Glu Thr

260 265 270

Leu Pro Gln Asp Phe Ala Thr Glu Gly Thr Thr Gly Tyr Asp Ala Leu

275 280 285

Ala Asp Val Asp Arg Val Phe Val Asp Pro Ala Gly Gln Gln Ala Leu

290 295 300

Asp Glu Leu Asp Ala Lys Leu Arg Gly Ser Ser Thr Pro Ala Asp Tyr

305 310 315 320

Ala Glu Met Ile Arg Gly Thr Lys Arg Met Ile Ala Asp Gly Ile Leu

325 330 335

Arg Ser Glu Val Leu Arg Leu Ala Arg Leu Val Pro Glu Ser Tyr Gly

340 345 350

Leu Pro Val Glu Gln Ala Ala Asp Ala Ile Ala Glu Ile Ile Ala Ala

355 360 365

Phe Pro Val Tyr Arg Thr Tyr Leu Pro Thr Gly Ala Glu Ile Leu Lys

370 375 380

Glu Ala Cys Glu Ser Ala Ala Ala His Arg Pro Asp Leu Glu Val Ala

385 390 395 400

Val Gly Thr Leu Leu Pro Leu Leu Leu Asp Pro Gly Asn Pro Ile Ala

405 410 415

Val Arg Phe Gln Gln Thr Ser Gly Met Val Met Ala Lys Gly Val Glu

420 425 430

Asp Thr Ala Phe Tyr Arg Tyr Thr Arg Leu Gly Thr Leu Thr Glu Val

435 440 445

Gly Ala Glu Pro Thr Glu Phe Ser Val Ser Thr Ala Glu Phe His Gln

450 455 460

Arg Met Ala Arg Arg Gln Gln Glu Leu Pro Leu Ser Met Thr Thr Met

465 470 475 480

Ser Thr His Asp Thr Lys Arg Ser Glu Asp Ala Arg Ala Arg Ile Ser

485 490 495

Val Ile Ala Glu Leu Pro Glu Glu Trp Ala Asp Thr Leu Ala Thr Leu

500 505 510

Arg Gly Leu Ala Pro Ile Pro Asp Gly Pro Tyr Glu Asn Leu Leu Trp

515 520 525

Gln Ala Val Val Gly Ala Trp Pro Ala Ser Arg Glu Arg Leu Gln Gly

530 535 540

Tyr Ala Glu Lys Ala Ala Arg Glu Ala Gly Asn Ser Thr Thr Trp Thr

545 550 555 560

Ser Pro Asp Glu Asp Phe Glu Ser Ser Val Lys Ala Ala Val Asp Ala

565 570 575

Val Phe Asp Asp Gly Arg Val Thr Lys Ala Val Glu Asp Phe Val Ala

580 585 590

Arg Ile Asp Ser Tyr Ala Ala Ser Asn Ser Val Ser Ala Lys Leu Val

595 600 605

Gln Leu Thr Met Pro Gly Val Pro Asp Val Tyr Gln Gly Ser Glu Phe

610 615 620

Trp Glu Arg Ser Leu Thr Asp Pro Asp Asn Arg Arg Pro Val Asp Phe

625 630 635 640

Glu Val Arg Arg Gln Glu Leu Ala Lys Leu Asp Ala Gly Thr Leu Pro

645 650 655

Ala Ala Gly Thr Glu Pro Ser Lys Leu Leu Ala Thr Ser Arg Ala Leu

660 665 670

Arg Leu Arg Arg Asp Arg Pro Glu Leu Phe Gln Gly Tyr Ser Pro Val

675 680 685

Thr Ala Thr Gly Pro Ala Ala Asp His Val Leu Ala Phe His Arg Gly

690 695 700

Gly Asp Gly Ala Leu Gly Ala Leu Thr Leu Ala Thr Arg Leu Pro Ala

705 710 715 720

Gly Leu Ala Ala Asp Gly Gly Trp Arg Asp Thr Ala Val Glu Leu Pro

725 730 735

Val Ala Val Cys Asp Glu Leu Thr Gly Asn Ala Tyr Gly Pro Gly Ser

740 745 750

Val Pro Val Ala Glu Val Leu Gly Thr Tyr Pro Val Ala Leu Leu Val

755 760 765

Pro Ala Asp Gly Glu Lys Ala

770 775

<210> 3

<211> 1770

<212> DNA

<213> Arthrobacter oxydans

<400> 3

atgaccctcg tcaatggcgg gcccgagcgc ttcgacgtct gggctcccga cgctaaatcc 60

gtgatactgc tggccggcgg ccagcagtat cccatggagg aaaaggacac ggcgcctggc 120

tctgaaggct ggtggacagc cccggacgct ccgggtggcg gtgaggtgga ctacggctac 180

ctgctggacg gtgacagtca cccagttccc gatccgcggt cgcgccgcct gcccgccggc 240

gtccatgagc tctccaggac gttcgacccc gcagcccacg cctggcagga ctccggctgg 300

aagggcaagg agctgaaggg ttcggtaatc tacgaactcc acatcggcac cttcacccct 360

gagggaaccc ttgacgctgc agccgaaaag ctcggctacc ttgcggacct gggaatcgac 420

tttgtcgagc tgctcccggt caatggcttc aacgggaccc acaactgggg ctacgacggc 480

gtccagtggt acgcggtcca tgaaggctac ggcgggcctg cggcctacca gcgctttgtg 540

gatgctgccc acgccgccgg cctgggcgtc atccaggacg tggtgtacaa ccacctcggc 600

ccgagcggaa actacctgtc caagttcggc ccgtacctga aacaggggga tgccaacacc 660

tggggtgact ccgtgaacct ggacggtccc ggctccgacg tggtgcggga atacatcctg 720

gacaaccttg ccctctggct ccgggattac cacgtggacg gcctccgcct ggacgccgtg 780

cacgcgctga aggacgagcg cgccgtgcac atccttgagg agttcggggc cctgggcgac 840

gccgtctcgg cggagaccgg gctgccgaag accctgattg ccgagtcgga cctgaacaac 900

ccccgcctgc tttacccgcg ggacgtcaac gggtacgggc tggccgggca gtggagcgac 960

gacttccacc acgcggtcca cgtcagcgtc agcggcgaga ccaccgggta ctacgaggac 1020

ttccagtccc tggcggtgct ggcaaaggtc ctgaaggacg gcttcctgca cgacggcagc 1080

tactccagct tccgcggccg gcaccacggc cggcctatca atgcctcgct ggtgcaccct 1140

gcggcgctgg tggtctgcaa ccagaaccac gaccagatcg gcaaccgcgc cacgggggac 1200

aggctctcgc agtcgctgtc ccacgggcag ctggccgtgg ccgccgtgct caccctgacg 1260

tccccgttca cgcccatgct gttcatgggc gaggagtttg cggccagcac cccttggcag 1320

ttcttcacct cccacccgga gccggagctg ggcaaggcta ccgcggaagg ccggatcaag 1380

gagttcgagc gcatggggtg ggatcccgcc gtcgtgcccg acccccagga tccggaaacc 1440

ttccgccggt ccaagctgga ctggaacgag tcctcaggcg gggaccacgc acggctcctg 1500

gagctttacc gctccctcac ggcgctgcgc cgcgggcacc ccgagcttgc cgggctcggc 1560

ttcaccgaga cggacgtgac gttcgacgac gacgccggct ggccgcgttt ccgccgcgga 1620

agcgttgagg tactgctgaa cctctcagac gccaaggtgc ggctggagga cgtttccggg 1680

acggtgctgc ttgcaacgga cgagggaacc ggccttgacg gcgaggccct cgccctggcg 1740

ccctggagtg cggcaatcgt caaatcctga 1770

<210> 4

<211> 589

<212> PRT

<213> Arthrobacter oxydans

<400> 4

Met Thr Leu Val Asn Gly Gly Pro Glu Arg Phe Asp Val Trp Ala Pro

1 5 10 15

Asp Ala Lys Ser Val Ile Leu Leu Ala Gly Gly Gln Gln Tyr Pro Met

20 25 30

Glu Glu Lys Asp Thr Ala Pro Gly Ser Glu Gly Trp Trp Thr Ala Pro

35 40 45

Asp Ala Pro Gly Gly Gly Glu Val Asp Tyr Gly Tyr Leu Leu Asp Gly

50 55 60

Asp Ser His Pro Val Pro Asp Pro Arg Ser Arg Arg Leu Pro Ala Gly

65 70 75 80

Val His Glu Leu Ser Arg Thr Phe Asp Pro Ala Ala His Ala Trp Gln

85 90 95

Asp Ser Gly Trp Lys Gly Lys Glu Leu Lys Gly Ser Val Ile Tyr Glu

100 105 110

Leu His Ile Gly Thr Phe Thr Pro Glu Gly Thr Leu Asp Ala Ala Ala

115 120 125

Glu Lys Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Leu Gly Ile Asp Phe Val Glu Leu

130 135 140

Leu Pro Val Asn Gly Phe Asn Gly Thr His Asn Trp Gly Tyr Asp Gly

145 150 155 160

Val Gln Trp Tyr Ala Val His Glu Gly Tyr Gly Gly Pro Ala Ala Tyr

165 170 175

Gln Arg Phe Val Asp Ala Ala His Ala Ala Gly Leu Gly Val Ile Gln

180 185 190

Asp Val Val Tyr Asn His Leu Gly Pro Ser Gly Asn Tyr Leu Ser Lys

195 200 205

Phe Gly Pro Tyr Leu Lys Gln Gly Asp Ala Asn Thr Trp Gly Asp Ser

210 215 220

Val Asn Leu Asp Gly Pro Gly Ser Asp Val Val Arg Glu Tyr Ile Leu

225 230 235 240

Asp Asn Leu Ala Leu Trp Leu Arg Asp Tyr His Val Asp Gly Leu Arg

245 250 255

Leu Asp Ala Val His Ala Leu Lys Asp Glu Arg Ala Val His Ile Leu

260 265 270

Glu Glu Phe Gly Ala Leu Gly Asp Ala Val Ser Ala Glu Thr Gly Leu

275 280 285

Pro Lys Thr Leu Ile Ala Glu Ser Asp Leu Asn Asn Pro Arg Leu Leu

290 295 300

Tyr Pro Arg Asp Val Asn Gly Tyr Gly Leu Ala Gly Gln Trp Ser Asp

305 310 315 320

Asp Phe His His Ala Val His Val Ser Val Ser Gly Glu Thr Thr Gly

325 330 335

Tyr Tyr Glu Asp Phe Gln Ser Leu Ala Val Leu Ala Lys Val Leu Lys

340 345 350

Asp Gly Phe Leu His Asp Gly Ser Tyr Ser Ser Phe Arg Gly Arg His

355 360 365

His Gly Arg Pro Ile Asn Ala Ser Leu Val His Pro Ala Ala Leu Val

370 375 380

Val Cys Asn Gln Asn His Asp Gln Ile Gly Asn Arg Ala Thr Gly Asp

385 390 395 400

Arg Leu Ser Gln Ser Leu Ser His Gly Gln Leu Ala Val Ala Ala Val

405 410 415

Leu Thr Leu Thr Ser Pro Phe Thr Pro Met Leu Phe Met Gly Glu Glu

420 425 430

Phe Ala Ala Ser Thr Pro Trp Gln Phe Phe Thr Ser His Pro Glu Pro

435 440 445

Glu Leu Gly Lys Ala Thr Ala Glu Gly Arg Ile Lys Glu Phe Glu Arg

450 455 460

Met Gly Trp Asp Pro Ala Val Val Pro Asp Pro Gln Asp Pro Glu Thr

465 470 475 480

Phe Arg Arg Ser Lys Leu Asp Trp Asn Glu Ser Ser Gly Gly Asp His

485 490 495

Ala Arg Leu Leu Glu Leu Tyr Arg Ser Leu Thr Ala Leu Arg Arg Gly

500 505 510

His Pro Glu Leu Ala Gly Leu Gly Phe Thr Glu Thr Asp Val Thr Phe

515 520 525

Asp Asp Asp Ala Gly Trp Pro Arg Phe Arg Arg Gly Ser Val Glu Val

530 535 540

Leu Leu Asn Leu Ser Asp Ala Lys Val Arg Leu Glu Asp Val Ser Gly

545 550 555 560

Thr Val Leu Leu Ala Thr Asp Glu Gly Thr Gly Leu Asp Gly Glu Ala

565 570 575

Leu Ala Leu Ala Pro Trp Ser Ala Ala Ile Val Lys Ser

580 585