技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)基因OsAAP3在水稻選育中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

植物通過(guò)吸收土壤中的氨、硝酸根、氨基酸、可溶性肽等來(lái)獲得氮素；氮的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)主要依靠銨根運(yùn)輸?shù)鞍祝ˋMT）、硝酸根運(yùn)輸?shù)鞍祝∟RT）、氨基酸運(yùn)輸?shù)鞍祝ˋAT）、肽運(yùn)輸?shù)鞍祝≒TR）等運(yùn)輸?shù)鞍讈?lái)完成（Williams L, Miller A. Transporters responsible for the uptake and partitioning of nitrogenous solutes. Annu Rev Plant Biol and Plant Mol Biol, 2001, 52: 659-688.）。銨通過(guò)植物AMT吸收后再通過(guò)谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸合酶（GOGAT）合成谷氨酰胺和谷氨酸，后者再進(jìn)一步形成其它氨基酸（Sonoda Y, Ikeda A, Saiki S, et al. Feedback regulation of the ammonium transporter gene family AMT1 by glutamine in rice. Plant Cell Physiol, 2003, 44: 1396-1402.）。植物可通過(guò)高親和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（HATS）的NRT2和低親和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)（LATS）的NRT1吸收環(huán)境中的硝酸鹽，由硝酸還原酶（NR）和亞硝酸還原酶（NiR）還原形成銨，再進(jìn)一步形成氨基酸（Paungfoo-Lonhienne C, Lonhienne T G, Rentsch D, et al. Plants can use protein as a nitrogen source without assistance from other organisms. PNAS, 2008, 105: 4524-4529.）。

在高等植物中，AAT是一類跨膜蛋白，將氨基酸從胞外運(yùn)至胞內(nèi)，同時(shí)還在氨基酸遠(yuǎn)距離運(yùn)輸、病原反應(yīng)和非生物脅迫等方面發(fā)揮著重要作用（Tegeder M. Transporters for amino acids in plant cells: some functions and many unknowns. Curr Opin Plant Biol, 2012, 15: 1-7.）。AAT基因被分為兩個(gè)超家族：APC（氨基酸、多胺和膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)）超家族和AAAP（氨基酸/生長(zhǎng)素透性酶）超家族。APC超家族分為三個(gè)亞家族：CATs（陽(yáng)離子氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）家族、ACTs（氨基酸/膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）家族和PHSs（多胺、H+協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）家族。AAAP超家族分為六個(gè)亞家族：AAPs（氨基酸透性酶）家族、LHTs（賴氨酸和組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）家族、ProTs（脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）家族、GATs（γ-氨基酸丁酸，GABA）家族、AUXs（生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）家族和ANTs（芳香族和中性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）家族（Fischer WN, Andre B, Rentsch D, et al. Amino acid transport in plants. Trends Plant Sci, 1998, 3: 188-195.）。

水稻基因組中共找到85個(gè)AAT家族成員（Zhao H, Ma H, Yu L, et al. Genome-wide survey and expression analysis of amino acid transporter gene family in rice (Oryza sativa L.). PLoS ONE, 2012, 7: e49210.）。研究發(fā)現(xiàn)OsAAT5、OsAAT7、OsAAT24、OsAAT49和OsAAT60的T-DNA插入突變體的稻米產(chǎn)量及植物體干重均下降，證明AAT對(duì)水稻的氮素積累及碳氮分配有著重要作用（Lu Y, Song Z, Lu K, et al. Molecular characterization, expression and functional analysis of the amino acid transporter gene family (OsAATs) in rice. Acta physiol Plant, 2012, 34: 1943-1962.）。研究發(fā)現(xiàn)超量表達(dá)OsAAP6會(huì)增加水稻籽粒中儲(chǔ)藏性蛋白和氨基酸含量，從而改善稻米營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味（Peng B, Kong H, Li Y, et al. OsAAP6 functions as an important regulator of grain protein content and nutritional quality in rice. Nat Commun, 2014, 5: doi:10.1038.）。氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)水稻等各種植物體的氨基酸吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和儲(chǔ)藏具有重要的作用。目前關(guān)于水稻AAP家族成員研究的報(bào)道很少，水稻氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)家族OsAAP3基因的蛋白可以運(yùn)輸賴氨酸和精氨酸等多種氨基酸（Taylor M R, Reinders A, Ward J M. Transport function of rice amino acid permeases (AAPs)[J]. Plant and Cell Physiology, 2015, 56(7): 1355-1363.），但對(duì)水稻的生長(zhǎng)發(fā)育目前未有任何研究。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)OsAAP3基因?qū)λ痉痔Y有極其重要的作用，可應(yīng)用于植物株型改良從而使水稻增產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，提供氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)基因OsAAP3在水稻選育中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明以水稻的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)基因OsAAP3為對(duì)象，從水稻中花11中克隆了OsAAP3的cDNA序列。通過(guò)RNAi技術(shù)構(gòu)建OsAAP3基因干涉表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將干擾表達(dá)載體導(dǎo)入正常粳稻品種中花11中，得到OsAAP3基因表達(dá)量下降的干擾植株，干擾植株的分蘗數(shù)與對(duì)照野生型中花11相比顯著提高。同時(shí)構(gòu)建了OsAAP3基因超表達(dá)載體，將超表達(dá)載體導(dǎo)入中花11中，得到OsAAP3基因超表達(dá)植株，其分蘗數(shù)與中花11相比顯著降低。這些結(jié)果表明，通過(guò)降低OsAAP3基因表達(dá)，可以使正常的水稻分蘗數(shù)增加，從而提高穗數(shù)和水稻產(chǎn)量。OsAAP3基因在闡述氨基酸運(yùn)輸影響植物生長(zhǎng)及發(fā)育過(guò)程方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

基于本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的OsAAP3基因的功能，其可用于水稻選育中。所述的水稻選育為提高水稻分蘗數(shù)，從而提高穗數(shù)和水稻產(chǎn)量。具體可通過(guò)RNAi技術(shù)降低OsAAP3基因的表達(dá)或用CRISPR等基因編輯技術(shù)敲除OsAAP3基因，使水稻分蘗數(shù)和每株穗數(shù)增加，達(dá)到提高水稻產(chǎn)量的目的。所述的OsAAP3基因編碼的OsAAP3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的OsAAP3基因的cDNA序列優(yōu)選如SEQ ID NO.2所示。

應(yīng)該理解為，在不影響OsAAP3蛋白活性的前提下（即不在蛋白的活性中心），本領(lǐng)域技術(shù)人員可對(duì)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列進(jìn)行各種取代、添加和/或缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸獲得具有同等功能的氨基酸序列。因此，OsAAP3蛋白還包括SEQ ID NO.1所示氨基酸序列經(jīng)取代、替換和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸獲得的具有同等活性的蛋白質(zhì)。此外，應(yīng)理解，考慮到密碼子的簡(jiǎn)并性以及不同物種密碼子的偏愛(ài)性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達(dá)的密碼子。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果：

（1）本發(fā)明克隆的OsAAP3基因干擾表達(dá)后使水稻分蘗能力增強(qiáng)，說(shuō)明OsAAP3基因?qū)μ岣咚痉痔Y數(shù)較明顯，因此，通過(guò)基因工程技術(shù)降低OsAAP3基因的表達(dá)能夠提高植物產(chǎn)量。這不僅有助于通過(guò)正常施氮條件下培育高產(chǎn)水稻，還可以通過(guò)結(jié)合基因編輯技術(shù)和分子育種進(jìn)行植物的品種改良。

（2）OsAAP3基因的成功克隆，進(jìn)一步證實(shí)了氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)家族在氮吸收過(guò)程中的重要作用，對(duì)闡明氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)家族的生物學(xué)功能有重要的意義，另外對(duì)進(jìn)一步了解植物氮代謝途徑，提高氮吸收效率有極大的推動(dòng)作用。

（3）盡管目前已克隆到了一些提高植物產(chǎn)量的基因，但對(duì)植物增產(chǎn)的分子機(jī)制仍不清楚。而本發(fā)明克隆的OsAAP3基因能夠提高水稻的分蘗數(shù)，對(duì)確定植物增產(chǎn)的關(guān)鍵因素有極大的推動(dòng)作用。

附圖說(shuō)明

圖1是對(duì)照中花11、OsAAP3基因超表達(dá)植株3個(gè)株系和OsAAP3基因干擾植株3個(gè)株系的整株表型圖。

圖2是對(duì)照中花11、OsAAP3基因超表達(dá)植株3個(gè)株系和OsAAP3基因干擾植株3個(gè)株系分蘗數(shù)的統(tǒng)計(jì)柱狀圖，數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行變量分析（ANOVA），使用Duncan’s在0.05水平上進(jìn)行差異顯著性分析，不同組別小寫字母（a、b、c）表示差異顯著。

圖3是對(duì)照中花11、OsAAP3基因超表達(dá)植株3個(gè)株系和OsAAP3基因干擾植株3個(gè)株系表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)柱狀圖，數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行變量分析（ANOVA），使用Duncan’s在0.05水平上進(jìn)行差異顯著性分析，不同組別星號(hào)（*）表示與對(duì)照相比具有差異顯著。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。若未特別指明，下述實(shí)施例所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段；所用的實(shí)驗(yàn)方法均為常規(guī)方法，并可按照已描述的重組技術(shù)（參見(jiàn)分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港，紐約）完成；所用的材料、試劑等，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1 OsAAP3基因干擾植株的構(gòu)建

提取水稻中花11的RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用引物對(duì)：

F1：5'-GGTACCAAGGACGTGGAGATGGCG-3'（Kpn I），

R1：5'-GGATCCATCGCCAGTGCGGTAGCAGTC-3'（BamH I）；

F2：5'-ACTAGTAAGGACGTGGAGATGGCG-3'（Spe I），

R2：5'-GAGCTCATCGCCAGTGCGGTAGCAGTC-3'（Sac I）；

各自PCR擴(kuò)增出OsAAP3基因的cDNA片段，通過(guò)上述相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切后連入pTCK303載體，構(gòu)建出OsAAP3基因的干擾表達(dá)載體OsAAP3-pTCK303。采用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將干擾表達(dá)載體導(dǎo)入正常粳稻品種中花11中。

將得到的所有轉(zhuǎn)基因小苗移栽于帶泥土的筐中，定期澆水，施肥，待小苗長(zhǎng)高約10cm時(shí)，種于大田中，待苗長(zhǎng)大后，提取基因組DNA通過(guò)PCR對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)引物對(duì)為：

F3：5'-GATGTTGGCGACCTCGTATT-3'，

R3：5'-TCGTTATGTTTATCGGCACTTT-3'。

若擴(kuò)增出517bp的片段，則說(shuō)明轉(zhuǎn)基因植株為陽(yáng)性植株。陽(yáng)性植株單株收種并種植，直至T2代鑒定出純合的轉(zhuǎn)基因植株，即得到OsAAP3基因干擾植株。OsAAP3基因干擾植株的分蘗數(shù)遠(yuǎn)多于對(duì)照中花11植株，差異顯著，如圖1、2中所示。

取OsAAP3基因干擾植株葉片，提取RNA并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)OsAAP3基因在干擾植株的表達(dá)量，結(jié)果顯示（圖3）干擾植株中OsAAP3基因的表達(dá)量比對(duì)照中花11降低，將對(duì)照的表達(dá)量定為1的話，干擾植株三個(gè)株系的表達(dá)量平均值依次為0.36、0.52、0.56。實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物對(duì)：

F4：5'-GCGGAGAACAAGACGATGAA-3'，

R4：5'-ATGGGCTGGCAGAACACC-3'。

實(shí)施例2 OsAAP3基因超表達(dá)植株的構(gòu)建

提取水稻中花11的RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用引物對(duì)：

F5：5'-AGATCTATGGCGAAGGACGTGGAGATGGCG-3'（Bgl II），

R5：5'-CTTAAGTCACGACTTGGTCTTGAAGGGGACGTA-3'（Afl II）；

通過(guò)PCR擴(kuò)增OsAAP3基因的cDNA后，通過(guò)Bgl II和Afl II酶切后連入pCAMBIA-1301載體（pCAMBIA-1301載體購(gòu)自Cambia公司），構(gòu)建出OsAAP3基因的超表達(dá)載體OsAAP3-p1301。采用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將超表達(dá)載體導(dǎo)入正常水稻品種中花11中。

將得到的所有轉(zhuǎn)基因小苗移栽于帶泥土的筐中，定期澆水，施肥，待小苗長(zhǎng)高約10cm時(shí)，種于大田中，待苗長(zhǎng)大后，提取基因組DNA通過(guò)PCR對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)引物對(duì)為：

F3：5'-GATGTTGGCGACCTCGTATT-3'，

R3：5'-TCGTTATGTTTATCGGCACTTT-3'；

若擴(kuò)增出517bp的片段，則說(shuō)明轉(zhuǎn)基因植株為陽(yáng)性植株。陽(yáng)性植株單株收種并種植，直至T2代鑒定出純合的轉(zhuǎn)基因植株，即得到OsAAP3基因超表達(dá)植株。OsAAP3基因超表達(dá)植株的分蘗數(shù)遠(yuǎn)少于對(duì)照中花11植株，差異顯著，如圖1、2中所示。

取OsAAP3基因超表達(dá)植株葉片，提取RNA并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)OsAAP3基因在超表達(dá)植株的表達(dá)量，操作同實(shí)施例1，結(jié)果顯示（圖3）超表達(dá)植株中OsAAP3基因的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照中花11，將對(duì)照的表達(dá)量定為1的話，超表達(dá)植株三個(gè)株系的表達(dá)量平均值依次為101.13、82.33、135.77。

上述結(jié)果表明，OsAAP3基因可以通過(guò)表達(dá)量的降低，提高水稻的分蘗數(shù)和每株穗數(shù)，最終提高水稻產(chǎn)量。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 武漢生物工程學(xué)院

<120> 氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)基因OsAAP3在水稻選育中的應(yīng)用

<130> 1

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 487

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 1

Met Ala Lys Asp Val Glu Met Ala Val Arg Asn Gly Asp Gly Gly Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Tyr Tyr Ala Thr His Pro His Gly Gly Ala Gly Gly Glu

20 25 30

Asp Val Asp Asp Asp Gly Lys Gln Arg Arg Thr Gly Asn Val Trp Thr

35 40 45

Ala Ser Ala His Ile Ile Thr Ala Val Ile Gly Ser Gly Val Leu Ser

50 55 60

Leu Ala Trp Ala Thr Ala Gln Leu Gly Trp Val Val Gly Pro Val Thr

65 70 75 80

Leu Met Leu Phe Ala Leu Ile Thr Tyr Tyr Thr Ser Gly Leu Leu Ala

85 90 95

Asp Cys Tyr Arg Thr Gly Asp Pro Val Ser Gly Lys Arg Asn Tyr Thr

100 105 110

Tyr Met Asp Ala Val Ala Ala Tyr Leu Gly Gly Trp Gln Val Trp Ser

115 120 125

Cys Gly Val Phe Gln Tyr Val Asn Leu Val Gly Thr Ala Ile Gly Tyr

130 135 140

Thr Ile Thr Ala Ser Ile Ser Ala Ala Ala Val His Lys Ala Asn Cys

145 150 155 160

Tyr His Lys Asn Gly His Asp Ala Asp Cys Gly Val Tyr Asp Thr Thr

165 170 175

Tyr Met Ile Val Phe Gly Val Val Gln Ile Phe Phe Ser Met Leu Pro

180 185 190

Asn Phe Ser Asp Leu Ser Trp Leu Ser Ile Leu Ala Ala Val Met Ser

195 200 205

Phe Ser Tyr Ser Thr Ile Ala Val Gly Leu Ser Leu Ala Arg Thr Ile

210 215 220

Ser Gly Ala Thr Gly Lys Thr Thr Leu Thr Gly Val Glu Val Gly Val

225 230 235 240

Asp Val Thr Ser Ala Gln Lys Ile Trp Leu Ala Phe Gln Ala Leu Gly

245 250 255

Asp Ile Ala Phe Ala Tyr Ser Tyr Ser Met Ile Leu Ile Glu Ile Gln

260 265 270

Asp Thr Val Lys Ser Pro Pro Ala Glu Asn Lys Thr Met Lys Lys Ala

275 280 285

Thr Leu Leu Gly Val Ser Thr Thr Thr Ala Phe Tyr Met Leu Cys Gly

290 295 300

Cys Leu Gly Tyr Ala Ala Phe Gly Asn Ala Ala Pro Gly Asn Met Leu

305 310 315 320

Thr Gly Phe Gly Phe Tyr Glu Pro Tyr Trp Leu Ile Asp Phe Ala Asn

325 330 335

Val Cys Ile Val Val His Leu Val Gly Ala Tyr Gln Val Phe Cys Gln

340 345 350

Pro Ile Phe Ala Ala Val Glu Thr Phe Ala Ala Arg Arg Trp Pro Gly

355 360 365

Ser Glu Phe Ile Thr Arg Glu Arg Pro Val Val Ala Gly Arg Ser Phe

370 375 380

Ser Val Asn Met Phe Arg Leu Thr Trp Arg Thr Ala Phe Val Val Val

385 390 395 400

Ser Thr Val Leu Ala Ile Val Met Pro Phe Phe Asn Asp Ile Leu Gly

405 410 415

Phe Leu Gly Ala Val Gly Phe Trp Pro Leu Thr Val Tyr Tyr Pro Val

420 425 430

Glu Met Tyr Ile Arg Gln Arg Arg Ile Gln Arg Tyr Thr Ser Arg Trp

435 440 445

Val Ala Leu Gln Thr Leu Ser Leu Leu Cys Phe Leu Val Ser Leu Ala

450 455 460

Ser Ala Val Ala Ser Ile Glu Gly Val Ser Glu Ser Leu Lys His Tyr

465 470 475 480

Val Pro Phe Lys Thr Lys Ser

485

<210> 2

<211> 1464

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 2

atggcgaagg acgtggagat ggcggtgcgg aacggagacg gcggcggcgg cggcggctac 60

tacgccaccc acccgcacgg cggcgccggc ggcgaggacg tcgacgacga cggcaagcag 120

cggcgaaccg gtaacgtatg gacggcgagc gcgcacatca tcacggcggt gatcggctcc 180

ggcgtgctct ctctcgcatg ggcaacggcg cagctcggct gggtggtcgg gccggtgact 240

ctgatgctct tcgccctcat cacgtactac acctctgggc tcctcgccga ctgctaccgc 300

actggcgatc cggtcagcgg caagcgcaac tacacctaca tggatgccgt tgcggcctac 360

ttaggtggct ggcaagtctg gtcctgtggt gttttccaat atgtcaacct ggttgggaca 420

gcaattgggt acacaatcac agcatccatc agcgcagcgg ctgtgcacaa ggccaactgc 480

taccacaaga acggccacga tgccgattgc ggtgtctacg acaccacgta catgatcgtc 540

tttggagtcg tccagatctt cttctccatg ctgcccaact tcagtgacct ctcatggctt 600

tccatcctcg ccgcggtcat gtcattctca tactcgacca ttgccgttgg cctctcgctt 660

gcgcgaacaa tatcaggtgc tactggtaag actactctga ctggcgttga ggttggagtt 720

gacgtcactt cagcccagaa gatctggctc gcgttccaag cgctcggtga catcgcgttc 780

gcctactcct actccatgat ccttatagaa attcaggaca cggtgaagtc tccaccggcg 840

gagaacaaga cgatgaagaa ggcaacgctg ctgggggtgt cgaccacgac ggcgttctac 900

atgctgtgcg ggtgcctggg gtacgcggcg ttcgggaacg cggcgccggg gaacatgctc 960

accgggttcg gcttctacga gccctactgg ctgatcgact tcgccaacgt ctgcatcgtg 1020

gtccacctgg tcggcgccta ccaggtgttc tgccagccca tcttcgccgc cgtcgagacg 1080

ttcgccgcca ggcggtggcc gggctcggag ttcatcaccc gggagcgccc cgtcgtggcc 1140

ggcaggtcgt tcagcgtcaa catgttcagg ctgacgtggc ggacggcgtt cgtggtcgtc 1200

agcacggtgc tcgccatcgt gatgcccttc ttcaacgaca tcctgggctt cctcggcgcc 1260

gtcgggttct ggccgctgac ggtgtactac ccggtggaga tgtacatccg gcagcggcgg 1320

atacagcggt acacgtccag gtgggtggcg ctgcagacgc tcagcctcct ctgcttcctc 1380

gtctcgctcg cctccgccgt cgcctccatc gagggcgtca gcgagtcgct caagcactac 1440

gtccccttca agaccaagtc gtga 1464

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物F1

<400> 3

ggtaccaagg acgtggagat ggcg 24

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物R1

<400> 4

ggatccatcg ccagtgcggt agcagtc 27

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物F2

<400> 5

actagtaagg acgtggagat ggcg 24

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物R2

<400> 6

gagctcatcg ccagtgcggt agcagtc 27

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物F3

<400> 7

gatgttggcg acctcgtatt 20

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物R3

<400> 8

tcgttatgtt tatcggcact tt 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物F4

<400> 9

gcggagaaca agacgatgaa 20

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物R4

<400> 10

atgggctggc agaacacc 18

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物F5

<400> 11

agatctatgg cgaaggacgt ggagatggcg 30

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 引物R5

<400> 12

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