本發(fā)明涉及動(dòng)物病原分子診斷技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種PCR診斷豬細(xì)小病毒野毒感染的引物、含有該引物的試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

豬細(xì)小病毒病是由豬細(xì)小病毒(Porcine Parvovirus，PPV)所引起的豬繁殖障礙，以胚胎、胎兒感染致死、木乃伊、畸形胎及正常胎兒為特征的傳染病。豬細(xì)小病毒病分布廣泛，全世界范圍內(nèi)均可發(fā)生。該病一年四季均可發(fā)生，但在每年4～10月母豬產(chǎn)仔、交配的季節(jié)多發(fā)。該病呈地方性流行或者散發(fā)，本病發(fā)生后，豬場(chǎng)可連續(xù)幾年不斷出現(xiàn)繁殖失敗。該病的主要傳染對(duì)象是青年母豬，尤其是頭胎母豬感染性極強(qiáng)，病毒進(jìn)入胎盤(pán)可損害胎盤(pán)以及胎兒的很多組織器官，導(dǎo)致死胎、木乃伊胎的發(fā)生。

豬細(xì)小病毒病缺乏有效的治療方法。唯一的防治措施就是對(duì)易感豬進(jìn)行疫苗免疫。使用弱毒疫苗存在散毒的危險(xiǎn)，因此目前國(guó)內(nèi)應(yīng)用的PPV疫苗主要以滅活疫苗為主。PPV滅活疫苗分組織滅活疫苗和細(xì)胞培養(yǎng)滅活疫苗這兩類(lèi)，其中以油佐劑細(xì)胞滅活疫苗最為常用。滅活疫苗免疫豬雖然可以產(chǎn)生完全的保護(hù)，但存在無(wú)法從血清學(xué)上同豬細(xì)小病毒感染區(qū)分的問(wèn)題。血清學(xué)檢測(cè)方法是抗原和抗體反應(yīng)，疫苗免疫和野毒感染均可以引起自身產(chǎn)生抗體，這樣就無(wú)法區(qū)別，因此，血清學(xué)檢測(cè)方法僅能評(píng)價(jià)機(jī)體體液免疫產(chǎn)生抗體的水平，無(wú)法區(qū)分豬細(xì)小病毒感染豬和疫苗免疫豬的問(wèn)題，給豬細(xì)小病毒感染豬和疫苗免疫豬的鑒別診斷帶來(lái)了很大困難。因此亟待建立一種可以準(zhǔn)確區(qū)分豬細(xì)小疫苗免疫豬與豬細(xì)小病毒野毒感染豬的檢測(cè)方法。

目前，PPV較為成熟的實(shí)驗(yàn)室診斷方法主要以血清學(xué)檢測(cè)抗體或可通過(guò)抗體反應(yīng)間接檢測(cè)病毒，主要包括：(1)血凝(HA)：多用于對(duì)病毒培養(yǎng)物的檢測(cè)，依賴(lài)于病毒的血凝活性，因此易受病毒傳代、保存時(shí)限的影響；(2)血凝抑制試驗(yàn)(HI)：該方法具有操作簡(jiǎn)便，不需要特殊設(shè)備等特點(diǎn)，因此國(guó)內(nèi)長(zhǎng)期用于抗體的檢測(cè)。但該方法使用紅細(xì)胞，需對(duì)檢測(cè)樣品做繁雜的處理，雖能進(jìn)行快速、大量的診斷，但靈敏度低、特異性不強(qiáng)，只能做輔助診斷方法；(3)中和試驗(yàn)(SN)：用于中和抗體的檢測(cè)，該方法比HI更加敏感，但操作也更為復(fù)雜；(4)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)：多用于抗體檢測(cè)，Hodals等(1988年)、Westenbrink等(1989年)、邱明建等(1989年)分別建立了ELISA方法用于檢測(cè)PPV抗體，該方法靈敏度高，適合PPV的早期診斷和流行病學(xué)調(diào)查。在實(shí)踐中，由于疫苗的使用，很難通過(guò)抗體檢測(cè)區(qū)分疫苗免疫與野毒感染，需要檢測(cè)抗原的ELISA方法。姜永厚(1997年)建立了檢測(cè)PPV抗原的ELISA方法，比HA敏感、快速。(5)免疫熒光抗體：Rivera等(1986年)應(yīng)用固相免疫熒光技術(shù)快速檢測(cè)PPV感染胎兒的抗原與抗體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該技術(shù)與ELISA具有一致的高敏感性。

分子診斷技術(shù)用于檢測(cè)病原核酸，極大的提高診斷的敏感性與特異性，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)是80年代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。PCR反應(yīng)類(lèi)似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成，即在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模版DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。通過(guò)PCR，能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬(wàn)乃至百萬(wàn)倍，具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易于自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)，PCR已廣泛應(yīng)用于生物檢測(cè)和疾病診斷等領(lǐng)域。

由于豬細(xì)小病毒基因組是單股負(fù)鏈DNA，因此可用PCR的方法來(lái)擴(kuò)增病毒目的片段。合理的引物設(shè)計(jì)是成功應(yīng)用PCR技術(shù)的關(guān)鍵。引物的特異性對(duì)反應(yīng)有很大影響，如果引物特異性不高，可能在擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)生非靶標(biāo)條帶，影響檢測(cè)結(jié)果的判定。目前國(guó)內(nèi)外已有PPV的PCR檢測(cè)方法研究報(bào)道，這些方法多技術(shù)含量要求高或未能形成產(chǎn)品化，只能在專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，不適合大面積臨床診斷和現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提出一種PCR診斷豬細(xì)小病毒野毒感染的引物、含有該引物的試劑盒及其應(yīng)用，利用本發(fā)明的引物所建立的PCR方法具有靈敏度高、特異性好、可重復(fù)性好、檢測(cè)結(jié)果快速客觀準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合臍帶血的檢測(cè)，能同時(shí)反映母、仔豬細(xì)小病毒帶毒和排毒狀況，評(píng)估母豬豬瘟疫苗的免疫效果，側(cè)面反映母豬的健康狀況水平，有益于對(duì)群體豬瘟病毒感染的凈化和免疫情況的早期預(yù)警評(píng)判，進(jìn)一步有助于豬場(chǎng)做好該疾病的預(yù)警、防控工作?？梢钥焖贉?zhǔn)確診斷豬細(xì)小病毒野毒感染。

基于上述目的，本發(fā)明提供的一種PCR診斷豬細(xì)小病毒野毒感染的引物，所述引物的核苷酸序列如下所示：

上游引物：5’-GAACCTACCACAGAAGGAGAC-3’，其為SEQ ID NO:1序列；

下游引物：5’-GCTTTGGAGCTCTTCCACTAA-3’，其為SEQ ID NO:2序列。

豬屬于上皮絨毛胎盤(pán)，豬胎盤(pán)生理正常的結(jié)構(gòu)即血胎屏障，胎盤(pán)屏障的存在使正常的臍帶血內(nèi)不存在任何病原和抗體等大分子物質(zhì)，即就是不會(huì)存在豬細(xì)小VP2基因片段，即為豬細(xì)小病毒也就不存在。而目前市場(chǎng)上使用的豬細(xì)小疫苗均為滅活疫苗，豬群免疫疫苗后，抗原很快會(huì)在母豬體內(nèi)被識(shí)別和清除且不會(huì)通過(guò)血胎屏障在仔豬臍帶血中存在，本發(fā)明主要通過(guò)檢測(cè)臍帶血中是否含有豬細(xì)小病毒VP2的基因片段，進(jìn)而區(qū)分豬細(xì)小病毒疫苗免疫與病毒野毒感染，評(píng)估判斷豬細(xì)小病毒疫苗的質(zhì)量和免疫的效果，準(zhǔn)確判定母豬免疫保護(hù)力。

本發(fā)明還提供了上述PCR診斷豬細(xì)小病毒野毒感染的引物在制備PCR診斷豬細(xì)小病毒野毒感染試劑中的應(yīng)用。

進(jìn)一步的，本發(fā)明提供了一種PCR診斷豬細(xì)小病毒野毒感染的試劑盒，所述試劑盒包含所述的引物。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，上游引物和下游引物的摩爾比為1:1。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述試劑盒還包括陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照、10×PCR緩沖液、Taq酶及dNTP。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述陰性對(duì)照為豬細(xì)小滅活疫苗免疫若干次母豬后分離得到的仔豬臍帶血DNA；所述陽(yáng)性對(duì)照為感染豬細(xì)小病毒的仔豬臍帶血DNA。

進(jìn)一步的，本發(fā)明提供了上述PCR診斷豬細(xì)小病毒野毒感染的試劑盒在區(qū)分豬細(xì)小病毒疫苗免疫和野毒感染試劑中的應(yīng)用。

更進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了上述PCR診斷豬細(xì)小病毒野毒感染的試劑盒的使用方法，包括以下步驟：

a.采集經(jīng)豬細(xì)小疫苗免疫的同一頭母豬分娩的所有同窩仔豬的臍帶血，同窩仔豬的臍帶血混合后作為樣品；

b.提取步驟a中的樣品中的DNA；

c.以步驟b中提取的DNA為模板，采用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物序列PCR擴(kuò)增豬細(xì)小病毒VP2基因中的片段，所述豬細(xì)小病毒VP2基因中的片段如SEQ ID NO:3所示；

d.對(duì)PCR結(jié)果進(jìn)行分析：①有擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為343bp，且陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照均成立，則表明所檢測(cè)的臍帶血樣品中有豬細(xì)小病毒野毒感染；②沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物，且陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照均成立，則表明所檢測(cè)的臍帶血樣品中沒(méi)有有豬細(xì)小病毒野毒感染，豬細(xì)小疫苗免疫成功。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，PCR反應(yīng)體系以25μL計(jì)為：

20umol/L的SEQ ID NO:1所示的上游引物：1μL；

20umol/L的SEQ ID NO:2所示的下游引物：1μL；

10×PCR緩沖液：2.5μL；

200ng/μL的DNA模板：4μL；

5U/ml的Taq酶：0.5μL；

dNTP：2uL；

ddH₂O：補(bǔ)足至25μL。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；然后72℃延伸10min，最后4℃保護(hù)，結(jié)束反應(yīng)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)采用本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物所建立的PCR方法可對(duì)仔豬臍帶血中的豬細(xì)小病毒野毒感染情況做診斷，從而可以評(píng)價(jià)母豬豬細(xì)小病毒疫苗的保護(hù)力，而且可以預(yù)測(cè)和預(yù)警仔豬感染豬細(xì)小病毒野毒的狀況，為疾病防控提供有效的科學(xué)依據(jù)。

(2)本發(fā)明的的PCR方法更能直接，有效、綜合評(píng)價(jià)疫苗免疫母豬后的效果，與傳統(tǒng)的血清學(xué)抗體檢測(cè)評(píng)估相比更具有優(yōu)勢(shì)，該法也是血清學(xué)抗體評(píng)估疫苗效果的有效的補(bǔ)充，是非常好的疫苗評(píng)估質(zhì)量、免疫效果和免疫程序優(yōu)化的有力工具，可進(jìn)一步推廣和臨床應(yīng)用。

(3)使用本發(fā)明的的PCR方法進(jìn)行仔豬臍帶血檢測(cè)，即可診斷豬細(xì)小病毒野毒感染，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果制定相應(yīng)的防控策略，最終達(dá)到最終凈化該病的目的。

(4)本發(fā)明的PCR方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、可重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。該方法檢測(cè)過(guò)程中無(wú)需特殊儀器的使用，檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)便，檢測(cè)時(shí)間短，結(jié)果判定簡(jiǎn)單。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例A廠家臍帶血DNA樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖；其中，M：DL2000 DNA Marker，1-12：1#臍帶血樣品-12#臍帶血樣品，+：陽(yáng)性對(duì)照，-：陰性對(duì)照；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例B廠家臍帶血DNA樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖；其中，M：DL2000 DNA Marker，1-14：1#臍帶血樣品-14#臍帶血樣品，+：陽(yáng)性對(duì)照，-：陰性對(duì)照；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例C廠家臍帶血DNA樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖；其中，M：DL2000 DNA Marker，1-14：1#臍帶血樣品-14#臍帶血樣品，+：陽(yáng)性對(duì)照，-：陰性對(duì)照；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例試劑盒特異性試驗(yàn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖；其中，M：DL2000 DNA Marker，1：陽(yáng)性對(duì)照，2-7泳道：分別為PRRSV、CSFV、PRV、TGE、PED和PCV2的病毒核酸樣品，8-10泳道：為3株P(guān)PV野毒分離株的核酸樣品；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例試劑盒靈敏度試驗(yàn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖；其中，M：DL2000 DNA Marker，1：去離子水，2：陰性對(duì)照，3：陽(yáng)性對(duì)照，4-10：分別為PPV病毒10-10⁷拷貝數(shù)的DNA樣品。

圖6為本發(fā)明實(shí)施例試劑盒重復(fù)性試驗(yàn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖；其中，M：DL2000 DNA Marker，1-6為PPV病毒不同批次提取的DNA模板。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例1

1.臍帶血中DNA的提取

(1)臍帶血的采集

臍帶血采集包括以下步驟：a.取干凈的青霉素瓶和瓶塞，清洗干凈，煮沸滅菌30分鐘，烘干后收集備用；

b.當(dāng)仔豬出生時(shí)，將每頭母豬分娩的所有仔豬的“臍帶血”都擠到一個(gè)干凈的青霉素瓶中，每頭仔豬3-5滴即可，將其“臍帶血”擠到青霉素瓶，密封；

注意事項(xiàng)：①必須要采集同窩母豬產(chǎn)的所有的仔豬，避免同窩母豬所產(chǎn)仔豬的個(gè)體差異造成漏檢；②可以雙人操作，也可以單獨(dú)操作，若仔豬臍帶血不便擠出，可以將臍帶剪成幾段再操作即可；③若母豬分娩出現(xiàn)木乃伊，死胎時(shí)，同窩仔豬臍帶血重點(diǎn)檢測(cè)；④弱仔的臍帶血可以另外單獨(dú)再收集一份，重點(diǎn)檢測(cè)；

c.臍帶血收集完后蓋好瓶塞，用標(biāo)簽紙或者醫(yī)用白膠布在青霉素瓶做好標(biāo)記，注明采集時(shí)間、母豬耳號(hào)、胎次等信息；

d.將收集的臍帶血的青霉素瓶放至-20°冰箱冷凍保存，送至實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，并附上采集臍帶血樣品的數(shù)量、母豬耳號(hào)、需要檢測(cè)項(xiàng)目的清單。

(2)提取臍帶血中的DNA

取臍帶血樣品900μL，向樣品中加入300μL的消化液，在50℃水浴消化3h，然后加入等體積的酚仿混勻后12000r/min離心10min，取上清，反復(fù)抽提3次；在上清中加入2倍體積的無(wú)水乙醇，室溫放置10min沉淀DNA，12000r/min離心10min，沉淀用70％乙醇清洗1次，繼續(xù)12000r/min離心10min，沉淀自然干燥10min。

上述消化液是由255μL TNE緩沖液、15μL 10％SDS聚丙烯酰胺、30μL 2mg/mL蛋白酶K組成的混合溶液。上述酚仿為苯酚∶氯仿∶異戊醇按照質(zhì)量比25:24:1混合的溶液。

同時(shí)設(shè)有陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照同時(shí)進(jìn)行核酸DNA的提取和PCR擴(kuò)增。陰性對(duì)照為豬細(xì)小滅活疫苗免疫若干次母豬后分離得到的仔豬臍帶血DNA；陽(yáng)性對(duì)照為感染豬細(xì)小病毒的仔豬臍帶血DNA。

2.引物的設(shè)計(jì)

采用PCR方法鑒別豬細(xì)小病毒疫苗免疫和病毒野毒感染，其引物設(shè)計(jì)是關(guān)鍵。在GenBank基因庫(kù)中查找PPV野毒株和豬細(xì)小疫苗的基因序列，然后進(jìn)行序列比對(duì)，找出存在序列差異的片段，最終選取豬細(xì)小病毒VP2基因保守區(qū)域，并設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，序列如下：

上游引物：5’-GAACCTACCACAGAAGGAGAC-3’，(SEQ ID NO:1)；

下游引物：5’-GCTTTGGAGCTCTTCCACTAA-3’，(SEQ ID NO:2)。

上述引物由華大基因合成并進(jìn)行標(biāo)記，用于擴(kuò)增豬細(xì)小病毒VP2基因中的片段，目的片段為343bp，序列如下所示：

GAACCTACCACAGAAGGAGACCTACACCCAGGAACACTACCAGCAGCTGACACAAGAAAAGGTTATCACCAAACAACTAATAATAGCTACACAGAAGCAACAGCAATTAGGCCAGCTCAGGTAGGATATAATACACCATACATGAATTTTGAATACTCCAATGGTGGACCATTTCTAACTCCTATAGTACCAACAGCAGACACACAATATAACTATGATGATGAACCAAATGGTGCTATAAGACTTACAATGGGTTACCAACATGGACAATTAACCACATCTTCACAAGAGGTAGAAAGATACACATTCAATCCACAAAGTAAATGTGGAAGAGCTCCAAAGC(SEQ ID NO:3)。

3.本發(fā)明試劑盒的成分

上游擴(kuò)增引物：5’-GAACCTACCACAGAAGGAGAC-3’(SEQ ID NO:1)；

下游擴(kuò)增引物：5’-GCTTTGGAGCTCTTCCACTAA-3’(SEQ ID NO:2)；

陽(yáng)性對(duì)照：感染豬細(xì)小病毒的仔豬臍帶血DNA；

陰性對(duì)照：豬細(xì)小滅活疫苗免疫若干次母豬后分離得到的仔豬臍帶血DNA；

10×PCR緩沖液；

Taq酶；

dNTP。

4.采用PCR技術(shù)檢測(cè)DNA中的VP2基因片段

(1)以步驟1中提取的DNA為模板，采用20μL的緩沖液TE溶解DNA模板配制成濃度為200ng/μL的樣品DNA，反應(yīng)體系如下(25μL)：

20umol/L的上游引物：1μL；

20umol/L的下游引物：1μL；

10×PCR緩沖液：2.5μL；

200ng/μL的DNA模板：4μL；

5U/ml的Taq酶：0.5μL；

dNTP：2uL；

ddH₂O:14uL。

其中，上游引物：5’-GAACCTACCACAGAAGGAGAC-3’，下游引物：5’-GCTTTGGAGCTCTTCCACTAA-3’。

(2)按照上述體系混合之后，將PCR管放入PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；然后72℃延伸10min，最后4℃保護(hù)，結(jié)束反應(yīng)。

取10，結(jié)束PCR產(chǎn)物跑1％的瓊脂糖膠，觀察跑膠結(jié)果。

4.檢測(cè)結(jié)果的判定

待測(cè)樣品擴(kuò)增得到343bp的目的片段，同時(shí)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照均成立，即陰性對(duì)照沒(méi)有檢測(cè)到目的片段，陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)到目的片段，則判斷為陽(yáng)性，即仔豬臍帶血中感染豬細(xì)小病毒野毒，表明母豬存在排毒現(xiàn)象，疫苗保護(hù)力存在一定不足，建議加強(qiáng)免疫接種或調(diào)整免疫程序；若待測(cè)樣品沒(méi)有擴(kuò)增得到343bp的目的片段，同時(shí)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照均成立，即陰性對(duì)照沒(méi)有檢測(cè)到目的片段，陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)到目的片段，則判斷為陰性，即仔豬臍帶血中沒(méi)有感染豬細(xì)小病毒野毒，表明豬細(xì)小疫苗免疫母豬保護(hù)力很好，且仔豬無(wú)感染豬細(xì)小病毒，疫苗免疫效果和免疫程序很到位。

實(shí)施例2

北方某1000頭母豬豬場(chǎng)，母豬跟胎接種豬細(xì)小滅活疫苗，為了進(jìn)一步評(píng)估豬群細(xì)小疫苗對(duì)母豬的保護(hù)力效果和仔豬感染情況，故采集12窩分娩母豬的仔豬臍帶血，按照實(shí)施1所述的方法進(jìn)行鑒別豬細(xì)小病毒疫苗免疫和病毒野毒感染，評(píng)估豬細(xì)小疫苗的免疫效果，仔豬感染豬細(xì)小病毒的情況。結(jié)果如圖1所示。

從圖1中可以看出，陽(yáng)性對(duì)照樣品的臍帶血中存在豬細(xì)小病毒，陰性對(duì)照樣品的臍帶血中沒(méi)有檢測(cè)出豬細(xì)小病毒，樣品3、8-10和12的臍帶血中均存在豬細(xì)小病毒的VP2基因中的片段，進(jìn)一步表明樣品3、8-10和12的臍帶血中存在豬細(xì)小病毒，表明母豬存在排毒現(xiàn)象和仔豬感染現(xiàn)象，疫苗保護(hù)力存在一定不足，建議加強(qiáng)免疫接種或調(diào)整免疫程序。樣品1-2、4-7和11的臍帶血中不存在豬細(xì)小病毒的VP2基因中的片段，進(jìn)一步表明樣品1-2、4-7和11的臍帶血中不存在豬細(xì)小病毒，表明豬細(xì)小疫苗免疫母豬保護(hù)力很好，且仔豬無(wú)感染豬細(xì)小病毒，疫苗免疫效果和免疫程序很到位。

實(shí)施例3

北方某500頭母豬豬場(chǎng)，母豬跟胎接種豬細(xì)小滅活疫苗，為了進(jìn)一步評(píng)估豬群細(xì)小疫苗對(duì)母豬的保護(hù)力效果和仔豬感染情況，故采集14窩分娩母豬的仔豬臍帶血，按照實(shí)施1所述的方法進(jìn)行鑒別豬細(xì)小病毒疫苗免疫和病毒野毒感染，評(píng)估豬細(xì)小疫苗的免疫效果，仔豬感染豬細(xì)小病毒的情況。結(jié)果如圖2所示。

從圖2中可以看出，陽(yáng)性對(duì)照樣品的臍帶血中存在豬細(xì)小病毒，陰性對(duì)照樣品的臍帶血中沒(méi)有檢測(cè)出豬細(xì)小病毒，樣品1-14的臍帶血中均不存在豬細(xì)小病毒的VP2基因中的片段，進(jìn)一步表明樣品1-14的臍帶血中不存在豬細(xì)小病毒，表明母豬不存在豬細(xì)小病毒的排毒和仔豬感染現(xiàn)象，母豬健康水平高，進(jìn)一步表明母豬的豬細(xì)小疫苗免疫效果且免疫程序很好。

實(shí)施例4

北方某2000頭母豬豬場(chǎng)，母豬跟胎接種豬細(xì)小滅活疫苗，為了進(jìn)一步評(píng)估豬群細(xì)小疫苗對(duì)母豬的保護(hù)力效果和仔豬感染情況，故采集14窩分娩母豬的仔豬臍帶血，按照實(shí)施1所述的方法進(jìn)行鑒別豬細(xì)小病毒疫苗免疫和病毒野毒感染，評(píng)估豬細(xì)小疫苗的免疫效果，仔豬感染豬細(xì)小病毒的情況。結(jié)果如圖3所示。

從圖3中可以看出，陽(yáng)性對(duì)照樣品的臍帶血中存在豬細(xì)小病毒，陰性對(duì)照樣品的臍帶血中沒(méi)有檢測(cè)出豬細(xì)小病毒，樣品1-14的臍帶血中不存在豬細(xì)小病毒的VP2基因中的片段，進(jìn)一步表明樣品1-14的臍帶血中不存在豬細(xì)小病毒，表明母豬不存在豬細(xì)小病毒的排毒和仔豬感染現(xiàn)象，母豬健康水平高，進(jìn)一步表明母豬的豬細(xì)小疫苗免疫效果且免疫程序很好。

實(shí)施例5特異性研究

分別提取其他常見(jiàn)豬病毒核酸，豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGE)、豬流行性腹瀉病毒(PED)和豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)的核酸為模板，以實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行PCR分析，驗(yàn)證SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的上游引物和下游引物的特異性。

結(jié)果如圖4所示，從圖4中可以看出，本發(fā)明PCR方法能特異性擴(kuò)增出豬細(xì)小病毒343bp的特異性片段，而其它常見(jiàn)病毒，如PRRSV、CSFV、PRV、TGE、PED、PCV2樣品均未擴(kuò)增出基因片段，表明本發(fā)明使用的引物特異性高，適合作為PCR引物。

實(shí)施例6靈敏度研究

用實(shí)施例1所述的方法對(duì)10倍稀釋的陽(yáng)性對(duì)照感染豬細(xì)小病毒的仔豬臍帶血的DNA為模板進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)圖5，圖5表明，該P(yáng)CR方法對(duì)陽(yáng)性對(duì)照的DNA模板的最低檢出量為100個(gè)拷貝。

實(shí)施例7重復(fù)性研究

選用陽(yáng)性對(duì)照感染豬細(xì)小病毒的仔豬臍帶血，分別提取不同批次的DNA為模板，用實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行重復(fù)性PCR擴(kuò)增試驗(yàn)，PCR擴(kuò)增樣品經(jīng)1％瓊脂糖電泳觀察。結(jié)果見(jiàn)圖6，不同提取批次的DNA模板均能有效擴(kuò)增出343bp的特異性片段，且亮度基本一致，表明該試劑盒擴(kuò)增重復(fù)性良好。

綜上可見(jiàn)，本發(fā)明設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物以及構(gòu)成的試劑盒可以快速區(qū)分豬細(xì)小病毒疫苗免疫和野毒感染，而且該檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、快速、特異性好、靈敏度高、可重復(fù)性好，檢測(cè)結(jié)果真實(shí)可靠。

所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：以上任何實(shí)施例的討論僅為示例性的，并非旨在暗示本公開(kāi)的范圍(包括權(quán)利要求)被限于這些例子；在本發(fā)明的思路下，以上實(shí)施例或者不同實(shí)施例中的技術(shù)特征之間也可以進(jìn)行組合，并存在如上所述的本發(fā)明的不同方面的許多其它變化，為了簡(jiǎn)明它們沒(méi)有在細(xì)節(jié)中提供。因此，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何省略、修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

<110>湖南新南方養(yǎng)殖服務(wù)有限公司

<120>一種PCR診斷豬細(xì)小病毒野毒感染的引物、含有該引物的試劑盒及其應(yīng)用

<130> FI160452-ND

<160>3

<170>PatentIn version 3.5

<210> 1

<211>21

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

gaacctaccacagaaggaga c 21

<210> 2

<211>21

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

gctttggagctcttccacta a 21

<210> 3

<211>343

<212> PPV VP2

<213>人工序列

<400> 3

gaacctaccacagaaggagacctacacccaggaacactaccagcagctgacacaagaaaa 60

ggttatcaccaaacaactaataatagctacacagaagcaacagcaattaggccagctcag 120

gtaggatataatacaccatacatgaattttgaatactccaatggtggaccatttctaact 180

cctatagtaccaacagcagacacacaatataactatgatgatgaaccaaatggtgctata 240

agacttacaatgggttaccaacatggacaattaaccacatcttcacaagaggtagaaaga 300

tacacattcaatccacaaagtaaatgtggaagagctccaaagc 343