本發(fā)明的屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種檢測(cè)藥物性耳聾的pcr熒光分子信標(biāo)探針。

背景技術(shù)：

耳聾是最常見(jiàn)的殘疾之一，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，給個(gè)人和家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。2006年我國(guó)第二次殘疾人抽樣調(diào)查結(jié)果顯示，全國(guó)殘疾人總數(shù)達(dá)8000多萬(wàn)，而其中多重殘疾患者中伴隨聽(tīng)力障礙的為776萬(wàn)^[1]。而耳聾中的50％～70％可能與遺傳因素有關(guān)^[2]。耳聾也與環(huán)境因素有關(guān)，出生前后的感染、聲音過(guò)大和大腦創(chuàng)傷的耳蝸的影響、藥物毒性如氨基糖甙類抗生素等，這些環(huán)境因素結(jié)合遺傳因素，共同導(dǎo)致了耳聾的發(fā)生^[3]。氨基糖甙類抗生素在耳蝸毛細(xì)胞中的主要積聚部位是線粒體和溶酶體，且代謝緩慢，從而對(duì)聽(tīng)力產(chǎn)生傷害^[4]。1993年，prezant等人通過(guò)對(duì)患病家族線粒體基因序列分析,首次報(bào)道了線粒體12srrna上a1555g突變與藥物性耳聾的關(guān)系^[5]；2004年，zhao等人首次在一個(gè)漢族家系中發(fā)現(xiàn)了c1494t突變與藥物性耳聾的相關(guān)性^[6]。

目前的檢測(cè)方法主要采用測(cè)序法^[7]、pcr-rflp法^[8][9]、基因芯片法^[10]和高分辨率熔解曲線法^[11]。但是這些方法都有一些局限性。其中，測(cè)序法和基因芯片法都需要特定的儀器和試劑盒，成本高，不利于在欠發(fā)達(dá)地區(qū)推廣使用。pcr-rflp法必須先進(jìn)行pcr擴(kuò)增后再對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行開(kāi)蓋處理，有可能產(chǎn)生污染而出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。高分辨率熔解曲線法野生型和突變型之間tm值之差較小，容易造成誤判，且難以實(shí)現(xiàn)在一個(gè)反應(yīng)中進(jìn)行兩個(gè)位點(diǎn)的檢測(cè)。因此，目前急需一種低成本、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確明顯、易于推廣的技術(shù)，實(shí)現(xiàn)在單管反應(yīng)中，同時(shí)對(duì)藥物性耳聾相關(guān)位點(diǎn)12srrna的c1494t、a1555g突變進(jìn)行檢測(cè)。

1996年，tyagi和kramer發(fā)明了分子信標(biāo)(molecularbeacon)^[12]，這種熒光探針能特異性的識(shí)別靶序列，在與之雜交之后發(fā)生構(gòu)象變化，發(fā)出熒光，而沒(méi)有與靶序列雜交的探針會(huì)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)發(fā)生自淬滅，從而降低了背景信號(hào)。同時(shí)，由于分子信標(biāo)能夠標(biāo)記多種熒光基團(tuán)，從而便于實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)。分子信標(biāo)技術(shù)背景信號(hào)低，靈敏度高，特異性好，操作簡(jiǎn)便，可以用于活體分析等優(yōu)點(diǎn)，使其在臨床診斷中有著非常廣泛的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明就是基于熒光分子信標(biāo)探針進(jìn)行設(shè)計(jì)的。

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技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有方法的缺陷，提供一種針對(duì)氨基糖甙類抗生素誘導(dǎo)的非綜合征型耳聾相關(guān)位點(diǎn)12srrnac1494t、a1555g單核苷酸多態(tài)性一管多重檢測(cè)方法，以實(shí)現(xiàn)同時(shí)對(duì)這兩個(gè)位點(diǎn)便捷、準(zhǔn)確、低成本的檢測(cè)。

本發(fā)明是按如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種藥物性耳聾相關(guān)位點(diǎn)12srrnac1494t、a1555g單核苷酸多態(tài)性的檢測(cè)方法，包括以下步驟：

a、在12srrna基因上1494、1555位點(diǎn)的上下游設(shè)計(jì)并合成一對(duì)引物，其產(chǎn)生的靶序列為200bp；

b、分別針對(duì)1494和1555兩個(gè)位點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成分子信標(biāo)探針，探針覆蓋所檢測(cè)位點(diǎn)，1494位點(diǎn)在5’末端標(biāo)記fam熒光基團(tuán)，1555位點(diǎn)在5’末端標(biāo)記hex熒光基團(tuán)，兩個(gè)探針的3’末端采用bhq1淬滅基團(tuán)；

c、提取待測(cè)標(biāo)本中的dna，使用步驟a中的引物、步驟b中的探針，與其他pcr反應(yīng)體系成分混合，進(jìn)行pcr反應(yīng)，擴(kuò)增靶基因片段；

d、反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行一次高分辨率熔解曲線分析，根據(jù)fam和hex通道熔解曲線中熔解峰的位置，分別對(duì)待測(cè)標(biāo)本dna在1494和1555兩個(gè)位點(diǎn)的基因型進(jìn)行分析。

本發(fā)明方法的pcr反應(yīng)體系與常規(guī)pcr反應(yīng)體系相似，包括聚合酶(taq)、dntps、緩沖體系、引物、探針及模板。體系包含二重反應(yīng)，每管同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)位點(diǎn)，采用不對(duì)稱擴(kuò)增的方式，便于后續(xù)探針的雜交。

靶序列(seqidno.1)為：

1gagtagagtgcttagttgaacagggccctgaagcgcgtacacaccgcccg

51tcaccctcctcaagtatacttcaaaggacatttaactaaaacccctacgc

101atttatatagaggagacaagtcgtaacatggtaagtgtactggaaagtgc

151acttggacgaaccagagtgtagcttaacacaaagcacccaacttacactt

所述的引物序列為：

引物1(seqidno.2)：5’gagtagagtgcttagttgaacaggg3’；

引物2(seqidno.3)：5’aagtgtaagttgggtgctttgtg3’；

所述的熒光分子信標(biāo)探針序列為

探針1(seqidno.4)：5’cccgtcaccctcctcaagtatacggg3’；

探針2(seqidno.5)：5’cccgaggagacaagtcgtaacatcggg3’；

本發(fā)明方法中的陰性對(duì)照可以選用雙蒸水。

本發(fā)明方法的pcr反應(yīng)在rochelightcycler96熒光實(shí)時(shí)pcr儀，本發(fā)明中pcr反應(yīng)采用三步法，pcr擴(kuò)增溫度條件如下：95℃預(yù)變性300s，擴(kuò)增為三步法：每個(gè)循環(huán)95℃變性15s，58℃退火20s，72℃延伸20s，共45循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后在72℃延伸300s。擴(kuò)增結(jié)束后即進(jìn)行熔解曲線檢測(cè)，選擇的檢測(cè)通道為fam和hex，熔解過(guò)程為95℃退火60s，迅速冷卻到45℃并保持60s，檢測(cè)溫度范圍為45～95℃，每升高1℃采集15次熒光數(shù)據(jù)。熔解曲線使用pcr儀器對(duì)應(yīng)軟件進(jìn)行分析。

本發(fā)明的基因分型采用熒光分子信標(biāo)探針高分辨率熔解曲線分析，曲線的熔解峰值表示有一半雙鏈解鏈時(shí)的溫度，本發(fā)明中可以理解為單鏈與探針雜交時(shí)的tm值。其中

1494位點(diǎn)對(duì)應(yīng)探針與野生型、突變型的熔解峰分別位于63℃和55℃，溫度差為8℃，1555位點(diǎn)對(duì)應(yīng)探針與野生型、突變型的熔解峰分別位于58℃和52℃，溫度差為6℃。

本發(fā)明還涉及一種通過(guò)高分辨率熔解曲線分析檢測(cè)氨基糖甙類抗生素誘導(dǎo)的非綜合征型耳聾相關(guān)位點(diǎn)12srrnac1494t、a1555g突變基因型的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括：

(1)擴(kuò)增覆蓋c1494t和a1555g突變區(qū)域的一組引物對(duì)，所述的引物對(duì)的序列如seqidno.2和seqidno.3所示

(2)兩條分別特異性結(jié)合擴(kuò)增的片段上相應(yīng)的突變區(qū)的熒光分子信標(biāo)探針，所述的探針的序列如seqidno.4和seqidno.5所示；

(3)必要的核酸擴(kuò)增和雜交試劑。

本發(fā)明還涉及一組用于檢測(cè)氨基糖甙類抗生素誘導(dǎo)的非綜合征型耳聾相關(guān)位點(diǎn)12srrnac1494t、a1555g突變的引物組和熒光分子信標(biāo)探針，所述的引物組的核酸序列如seqidno.2和seqidno.3所示；所述的熒光分子信標(biāo)探針的核酸序列如seqidno.4和seqidno.5所示。

本發(fā)明還涉及所述的引物組和熒光分子信標(biāo)探針在檢測(cè)氨基糖甙類抗生素誘導(dǎo)的非綜合征型耳聾中的應(yīng)用。

本發(fā)明針對(duì)藥物性耳聾相關(guān)位點(diǎn)12srrnac1494t、a1555g突變檢測(cè)的臨床需求而設(shè)計(jì)，具有快速準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)成本低等特點(diǎn)。突出特點(diǎn)在于利用了分子信標(biāo)與不同基因型的靶序列雜交時(shí)有不同的tm值，通過(guò)高分辨率熔解曲線分辨tm值來(lái)將不同基因型分開(kāi)。通過(guò)標(biāo)記不同的熒光基團(tuán)，可以在一個(gè)反應(yīng)中實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)。本發(fā)明的有益效果是：可以擴(kuò)增出12srrna上藥物性耳聾相關(guān)位點(diǎn)1494和1555附近的靶序列，并且實(shí)現(xiàn)靈敏準(zhǔn)確的分型，可以據(jù)此判斷患者是否攜帶這兩個(gè)易感突變，從而指導(dǎo)臨床的用藥。檢測(cè)手段采用熒光實(shí)時(shí)pcr方法，具有很高的靈敏度；體系使用分子信標(biāo)，特異性好，背景信號(hào)低，能夠多重檢測(cè)。擴(kuò)增和檢測(cè)一次性完成，閉管反應(yīng)避免交叉污染，操作簡(jiǎn)便快捷，有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1、熒光分子信標(biāo)進(jìn)行分型的原理圖。圖中顯示本發(fā)明中實(shí)際引物、探針在靶序列上的分布情況。

圖2、兩個(gè)位點(diǎn)野生型和突變型的分型結(jié)果圖，

[2a]：1494位點(diǎn)上探針1與野生型、突變型的熔解溫度(tm)，其中，野生型退火溫度為63℃，突變型退火溫度為55℃，△tm為8℃；

[2b]：1555位點(diǎn)上探針2與野生型、突變型的熔解溫度(tm)，其中，野生型退火溫度為58℃，突變型寡退火溫度為52℃，△tm為6℃。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1、藥物性耳聾相關(guān)位點(diǎn)12srrnac1494t、a1555g突變檢測(cè)試劑盒(熒光分子信標(biāo)探針?lè)?的組成

(1)靶序列為人12srrna編碼基因上的一段，包含了待測(cè)的1494、1555位點(diǎn)及其前后共200bp的dna序列，熒光分子信標(biāo)探針雜交區(qū)域均位于引物對(duì)之間，且分別覆蓋對(duì)應(yīng)的待測(cè)位點(diǎn)。

引物序列為：

引物1(seqidno.2)：5’gagtagagtgcttagttgaacaggg3’；

引物2(seqidno.3)：5’aagtgtaagttgggtgctttgtg3’；

熒光分子信標(biāo)探針序列為

探針1(seqidno.4)：5’cccgtcaccctcctcaagtatacggg3’；

探針2(seqidno.5)：5’cccgaggagacaagtcgtaacatcggg3’；

(2)試劑盒的配制過(guò)程如下：

配制pcr反應(yīng)液：

每人份反應(yīng)液：

實(shí)施例2、使用藥物性耳聾相關(guān)位點(diǎn)12srrnac1494t、a1555g突變檢測(cè)試劑盒(熒光分子信標(biāo)探針?lè)?雙盲實(shí)驗(yàn)考察

樣品采集

經(jīng)過(guò)測(cè)序證實(shí)突變類型的基因組標(biāo)本總計(jì)56份。樣品由中國(guó)優(yōu)生優(yōu)育協(xié)會(huì)遺傳與健康專家指導(dǎo)中心提供，為口腔黏膜樣本，采用qiaampdnaminikit試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行dna的抽提。其中男13例，女43例，年齡2～59歲，包括漢族、蒙古族、維吾爾族等多個(gè)民族，采集了樣本提供者的耳聾程度、氨基糖甙類藥物史等信息。所有標(biāo)本提供者均簽署了知情同意書(shū)，操作均符合科研倫理。獲得樣品時(shí)僅有編號(hào)，并未獲得對(duì)應(yīng)的任何信息。獲得樣本后首先測(cè)定濃度進(jìn)行質(zhì)控，其中有4份樣品由于濃度過(guò)低無(wú)法進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，因而不納入考察，其余均為20ng/μl。

基因分型

按照上文中每人份反應(yīng)液的體積和順序，按照檢測(cè)的總?cè)藬?shù)配制總管，配制完成后顛倒混勻，分裝至每個(gè)pcr反應(yīng)管中，分別加入待測(cè)模板，蓋好管蓋后放入rochelightcycler96熒光實(shí)時(shí)pcr儀，采用以下程序進(jìn)行pcr反應(yīng)：95℃預(yù)變性300s，擴(kuò)增為三步法：每個(gè)循環(huán)95℃變性15s，58℃退火20s，72℃延伸20s，共45循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后在72℃延伸300s。擴(kuò)增結(jié)束后即進(jìn)行熔解曲線檢測(cè)，選擇的檢測(cè)通道為fam和hex，熔解過(guò)程為95℃退火60s，迅速冷卻到45℃并保持60s，檢測(cè)溫度范圍為45～95℃，每升高1℃采集15次熒光數(shù)據(jù)。熔解曲線使用pcr儀器對(duì)應(yīng)軟件進(jìn)行分析。

結(jié)果

經(jīng)過(guò)篩查，在52份質(zhì)控合格的樣品中，在1494位點(diǎn)上2個(gè)樣品檢測(cè)到突變型信號(hào)，其余為野生型；在1555位點(diǎn)上共有9個(gè)樣品檢測(cè)到突變型信號(hào)，其余均為野生型。將結(jié)果反饋至樣品提供方，其經(jīng)過(guò)核對(duì)后確認(rèn)，檢測(cè)結(jié)果與先前的測(cè)序的結(jié)論完全符合。

結(jié)論

熒光分子信標(biāo)探針?lè)ú捎幂^短的探針序列，從而將一個(gè)位點(diǎn)兩個(gè)基因型之間的tm值差距拉大，能夠?qū)崿F(xiàn)更為明確的分型，避免了傳統(tǒng)高分辨率熔解曲線法野生型與突變型峰值接近，難以判讀的問(wèn)題。熒光分子信標(biāo)探針采用熒光基團(tuán)進(jìn)行標(biāo)記，可以在不同的位點(diǎn)使用不同且互不干擾的熒光基團(tuán)，從而實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)，提高了檢測(cè)效率。而分子信標(biāo)探針獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，使得探針在不與靶序列雜交時(shí)會(huì)發(fā)生自淬滅而沒(méi)有熒光產(chǎn)生，相比于熒光染料其具有更低的背景，具有很高的靈敏度。本方法使用熒光實(shí)時(shí)pcr儀，而無(wú)需特殊儀器，全程閉管操作，避免了污染的風(fēng)險(xiǎn)，且一管反應(yīng)檢測(cè)兩個(gè)位點(diǎn)，操作簡(jiǎn)便，便于其推廣。以上結(jié)果表明，藥物性耳聾相關(guān)位點(diǎn)12srrnac1494t、a1555g突變檢測(cè)試劑盒(熒光分子信標(biāo)法)適用于進(jìn)行臨床檢測(cè)和用藥指導(dǎo)，有很高的推廣和應(yīng)用價(jià)值。

最后需要說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用于幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，并不用作對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。

sequencelisting

<110>上海澤因生物科技有限公司

<120>一種檢測(cè)藥物性耳聾的pcr熒光分子信標(biāo)探針

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