本發(fā)明涉及用于確定來自小群體或個體CYP2D6基因拷貝數(shù)變化的方法，該方法可以快速高效準確的檢測CYP2D6基因的拷貝數(shù)變化，并發(fā)現(xiàn)在生物學和醫(yī)學中的應用。
背景技術(shù)：
CYP2D6是第一個被確認由單基因控制的P450酶。CYP2D6位于第22號染色體上，共含有9個外顯子和8個內(nèi)含子，總長度約為5400bp，是一個完整的功能性基因?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，肝臟中CYP2D6的含量僅占P450肝臟蛋白總量的2％，但是它卻參與代謝約25％的臨床用藥，包括抗抑郁藥、抗心律失常藥、抗精神病藥和鎮(zhèn)痛藥等。目前已發(fā)現(xiàn)超過100種CYP2D6等位基因的變異，主要包括單核苷酸變異、大片段基因的丟失以及拷貝數(shù)變異。這些變異使CYP2D6基因呈現(xiàn)多態(tài)性，并決定其編碼蛋白的酶活性表現(xiàn)為缺失、降低、正常或是增加等幾種類型，進一步對藥物的代謝同樣表現(xiàn)出多樣性，。
目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CYP2D6基因有超過100個變異位點，但影響中國人CYP2D6功能的常見變異有8個，包括快代謝型基因變異(基因拷貝數(shù)增多)、中間代謝型基因變異(CYP2D6*9、*10、*14和*41)和慢代謝型基因變異(CYP2D6*3、*4和*5)。CYP2D6基因的這些變異可引起酶活性以及酶數(shù)量的差異，導致療效不足或毒副作用的產(chǎn)生，最終產(chǎn)生藥物療效的個體差異。因此，CYP2D6的多態(tài)性研究對臨床具有重要的意義，已經(jīng)成為目前研究的熱點。
CYP2D6基因的拷貝數(shù)變化尤其重要，因為基因重復引起的拷貝數(shù)增加和基因缺失引起的拷貝數(shù)減少是影響CYP2D6酶活性增高和降低的重要原因。檢測CYP2D6基因的單核苷酸多態(tài)性、寡核苷酸插入和缺失能夠檢測CYP2D6酶活性的缺失和降低，但是只有基因拷貝數(shù)的增加能夠決定CYP2D6酶活性的增加。因此，CYP2D6基因拷貝數(shù)檢測在臨床應用具有重要意義。
目前國內(nèi)外檢測CYP2D6基因突變的產(chǎn)品，如Luminex的xTAG液相芯片、Roche的AmpliChip CYP450芯片、直接測序法、PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)檢測等靈敏性均不高，檢測結(jié)果可重復性差。這些方法需要耗費大量人力，同時所需的檢測時間較長，從核酸提取到結(jié)果獲取超過8小時，即超過1天正常工作時間。另外這些方法都無法快速準確的測定CYP2D6基因的拷貝數(shù)變化。目前，較為準確的鑒定CYP2D6基因拷貝數(shù)變化的方法有數(shù)字PCR技術(shù)(專利CN 101821619 B)和基于定量PCR的標準曲線法技術(shù)(專利CN 104263820 A)，但是兩種方法試劑成本較高，不宜推廣。
在本申請中，我們采用實時熒光PCR法檢測CYP2D6基因的拷貝數(shù)變化。實時熒光PCR法靈敏度高，分型準確，操作簡便快捷，所用儀器容易普及，易于推廣使用。同時，在我們的研究中，針對CYP2D6基因，我們采用了多個探針，能夠做到結(jié)果準確性高，檢測便捷高效，同時也能夠?qū)Υ髽颖玖窟M行快速檢測。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
基于背景技術(shù)存在的技術(shù)問題，本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的缺點，實時定量熒光PCR檢測方法沒有PCR后處理，能夠大量節(jié)省時間與人力。從DNA提取到熒光PCR實驗結(jié)束，及數(shù)據(jù)分析，全部過程僅需4小時，實體實驗操作時間小于2小時。
傳統(tǒng)的實時定量熒光PCR檢測技術(shù)及產(chǎn)品往往只是針對單一位點設計，不能同時獲得多個位點信息。在檢測單位點情況下不能準確的獲得CYP2D6基因拷貝數(shù)變化的準確信息。本發(fā)明詳細的分析了CYP2D6基因與其同源基因的序列差異，進一步針對CYP2D6基因的特異DNA序列，分別在CYP2D6基因的第二外顯子附近、第六內(nèi)含子區(qū)和第九外顯子區(qū)分別設計了一對檢測引物和探針，從而能夠獲取CYP2D6基因的多個位點信息，為準確的鑒定CYP2D6基因打下了良好的科學基礎。此外，該方法建立在普通熒光PCR的基礎上，具有操作簡便快捷，成本低廉，易于推廣的優(yōu)點。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
1、一組檢測CYP2D6基因多態(tài)性的引物，其特征在于：包括CYP2D6基因3個區(qū)段的PCR擴增引物和熒光探針。CYP2D6基因?qū)结樣肍AM進行5’端標記。
具體CYP2D6基因的3組引物和探針序列如下：
2、為了研究CYP2D6基因的拷貝數(shù)變異，選用人類基因組單拷貝基因RPP30(ribonuclease P/MRP 30kDa subunit)作為參考序列。RPP30基因?qū)结樣肏EX進行5’端標記。
RPP30基因引物和探針分別為：
3、熒光定量PCR反應：
采用單管二重定量PCR的方法檢測檢測CYP2D6基因的拷貝數(shù)變異，具體反應體系為10μL，包含8ng基因DNA，5μL 2x TaqMan mix,RPP30基因引物和探針以及一組CYP2D6基因的引物和探針(引物和探針終濃度均為0.2μM)，然后補水到10μL。針對每個樣品，進行4個重復。PCR擴增條件為95℃10min進行熱啟動，然后95℃15s變性，60℃退火和擴增1min，共計40個循環(huán)。
4、取CYP2D6基因為單拷貝的樣品作為對照樣品。檢測對象和對照樣品各進行4個重復的PCR反應，獲取實時定量PCR擴增的Ct值。
5、熒光定量PCR結(jié)果分析算法：
(1)利用內(nèi)參基因確定CYP2D6的加權(quán)值。
加權(quán)值＝樣品CYP2D6平均Ct值÷樣品內(nèi)參基因RPP30平均Ct值
(2)利用對照人群的CYP2D6拷貝數(shù)計算檢測對象的基因拷貝數(shù)。
α＝檢測對象加權(quán)值÷對照樣品加權(quán)值
如果α<0.2，檢測對象的CYP2D6拷貝數(shù)為0；
如果α為0.5-1.3，檢測對象的CYP2D6拷貝數(shù)為1；
如果α為1.5-2.3，檢測對象的CYP2D6拷貝數(shù)為2；
如果α為2.5-3.3，檢測對象的CYP2D6拷貝數(shù)為3；
如果α為3.5-4.3，檢測對象的CYP2D6拷貝數(shù)為4；
如果α為其他值則需要重新檢測。
本發(fā)明的有益之處在于：
(1)本發(fā)明采用實時熒光定量PCR檢測技術(shù)，設計了全新的CYP2D6基因及單拷貝基因內(nèi)參引物和熒光探針用于拷貝數(shù)變化的檢測。
(2)本發(fā)明要求測試人群和對照人群進行多組重復并且在同一個PCR板進行檢測，采用了16x24的384孔板反應體系。能夠準確、快速、高效的進行多個病人樣品的拷貝數(shù)檢測。
(3)本發(fā)明極大的降低了CYP2D6基因拷貝數(shù)檢測的成本，提高了基因拷貝數(shù)檢測的準確性。
(4)本發(fā)明的原理可以應用到現(xiàn)有的任何熒光實時定量PCR儀器，方便使用，易于大范圍內(nèi)推廣。
(5)本發(fā)明所述檢測方法可以簡單快速的檢測CYP2D6基因的拷貝數(shù)，結(jié)果可以用于以下多種藥物的個性化用藥指導，如β受體阻滯劑、抗抑郁藥、抗心律失常藥、抗精神病藥、鎮(zhèn)痛藥等，相應的藥物種類有阿立哌唑、阿托西汀、文拉法辛、利哌利酮、塞托溴胺吸入、他莫昔芬、噻嗎洛爾、氟西汀、奧氮平、西維美林、托特羅定、特比萘芬、曲馬多、氯氮平、美托洛爾、普萘洛爾、卡維地洛、普羅帕酮、硫利達嗪、普羅替林、可待因、匹莫齊特、丁苯那嗪、伊潘立酮等。
附圖說明
圖1為本發(fā)明的流程圖。
具體實施方式
實施例1制備檢測CYP2D6基因多態(tài)性的引物：
包括CYP2D6基因3個區(qū)段的PCR擴增引物和熒光探針。CYP2D6基因?qū)结樣肍AM進行5’端標記。
具體CYP2D6基因的3組引物和探針序列如下：
實施例2制備RPP30基因引物和探針：
為了研究CYP2D6基因的拷貝數(shù)變異，選用人類基因組單拷貝基因RPP30(ribonuclease P/MRP 30kDa subunit)作為參考序列。RPP30基因?qū)结樣肏EX進行5’端標記。
RPP30基因引物和探針分別為：
實施例3熒光定量PCR反應：
采用單管二重定量PCR的方法檢測檢測CYP2D6基因的拷貝數(shù)變異，具體反應體系為10μL，包含8ng基因DNA，5μL 2x TaqMan mix,RPP30基因引物和探針以及一組CYP2D6基因的引物和探針(引物和探針終濃度均為0.2μM)，然后補水到10μL。針對每個樣品，進行4個重復。PCR擴增條件為95℃10min進行熱啟動，然后95℃15s變性，60℃退火和擴增1min，共計40個循環(huán)。
實施例4：
取CYP2D6基因為單拷貝的樣品作為對照樣品。檢測對象和對照樣品各進行4個重復的PCR反應，獲取實時定量PCR擴增的Ct值。
實施例5熒光定量PCR結(jié)果分析算法：
(1)利用內(nèi)參基因確定CYP2D6的加權(quán)值。
加權(quán)值＝樣品CYP2D6平均Ct值÷樣品內(nèi)參基因RPP30平均Ct值
(2)利用對照人群的CYP2D6拷貝數(shù)計算檢測對象的基因拷貝數(shù)。
α＝檢測對象加權(quán)值÷對照樣品加權(quán)值
如果α<0.2，檢測對象的CYP2D6拷貝數(shù)為0；
如果α為0.5-1.3，檢測對象的CYP2D6拷貝數(shù)為1；
如果α為1.5-2.3，檢測對象的CYP2D6拷貝數(shù)為2；
如果α為2.5-3.3，檢測對象的CYP2D6拷貝數(shù)為3；
如果α為3.5-4.3，檢測對象的CYP2D6拷貝數(shù)為4；
如果α為其他值則需要重新檢測。
可見，與現(xiàn)有技術(shù)相比，該技術(shù)具有檢測結(jié)果準確可靠、通量較高、實驗設計靈活、操作簡便快捷、檢測速度快、易于推廣，而且成本低廉。
以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。