本發(fā)明屬于分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)病原的檢測(cè)方法，具體涉及一種可同時(shí)檢測(cè)并區(qū)分SIV、SRV、STLV的檢測(cè)引物組及方法。
背景技術(shù)：
：非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物在進(jìn)化上與人類密切相關(guān)，且具有自然分布廣、數(shù)量多，易于飼養(yǎng)等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于生殖生理、藥物毒理、生物制品和人類疾病模型的研究。我國(guó)非人靈長(zhǎng)類資源豐富，主要集中在我國(guó)廣東、廣西、云南、四川、海南等南方地區(qū)，目前飼養(yǎng)的企業(yè)有50余家，存欄規(guī)模30萬(wàn)只以上，每年用于科學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)猴有3萬(wàn)余只，每年出口2萬(wàn)余只。隨著實(shí)驗(yàn)用猴和飼養(yǎng)企業(yè)的增多，猴類自身攜帶的病原逐漸引起人們的關(guān)注，使得人類在與猴接觸的過程中，感染病原的機(jī)會(huì)明顯增加，特別是那些目前很難治愈的諸如AIDS等疾病的出現(xiàn)，更加增加了職業(yè)人員的風(fēng)險(xiǎn)。另外，實(shí)驗(yàn)猴攜帶病原也嚴(yán)重影響科學(xué)研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和真實(shí)性，損害了企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。而目前在實(shí)驗(yàn)猴中三種最常攜帶的病毒為猴D型逆轉(zhuǎn)錄病毒(SRV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)和猴T淋巴細(xì)胞趨向性病毒(STLV)。在現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中，對(duì)上述三個(gè)病原的檢測(cè)方法仍然采用的ELISA或IFA的檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法特異性差，靈敏度低，假陽(yáng)性高，還必須結(jié)合WB檢測(cè)特異性抗體才能最終確診。ELISA法和IFA法檢測(cè)的假陽(yáng)性率高及WB法操作程序復(fù)雜，在一定程度上限制了其應(yīng)用范圍。因此，不論是為了保障整個(gè)飼養(yǎng)猴群的健康還是飼養(yǎng)人員、科研人員的人身安全，都有必要建立一種方便、快捷、靈敏、特異性強(qiáng)的檢測(cè)方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種可同時(shí)檢測(cè)并區(qū)分SIV、SRV、STLV的檢測(cè)引物組。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種可同時(shí)檢測(cè)并區(qū)分SIV、SRV、STLV的方法。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：一種可同時(shí)檢測(cè)并區(qū)分SIV、SRV、STLV的檢測(cè)引物組，包括三對(duì)引物，其核苷酸序列如下所示：SIV引物：SIV-F：5’-ACGACCCGGCGGAAAGAAAAAGT-3’(SEQIDNO:1)；SIV-B：5’-TGCACCAGATGACGCAGACAGT-3’(SEQIDNO:2)；SRV引物：SRV-F：5’-AYGGGGCTACTGCYCCATA-3’(SEQIDNO:3)；SRV-B：5’-GCCATTACCKGCYTGTTGATT-3’(SEQIDNO:4)；STLV引物：STLV-F：5’-GTGCCAATCATGGACCTGCC-3’(SEQIDNO:5)；STLV-B：5’-TCCTGGAGCGTCGATTAGAAGG-3’(SEQIDNO:6)。優(yōu)選的，引物SIV-F、SRV-F、STLV-F引物序列的5’端通過間隔臂序列添加有Tag序列。優(yōu)選的，引物SIV-F、SRV-F、STLV-F引物的Tag序列分別為：SIV-F的Tag序列為：5’-ATCTCAATTACAATAACACACAAA-3’(SEQIDNO:7)；SRV-F的Tag序列為：5’-TACTTCTTTACTACAATTTACAAC-3’(SEQIDNO:8)；STLV-F的Tag序列為：5’-CTTAAACTCTACTTACTTCTAATT-3’(SEQIDNO:9)。優(yōu)選的，引物SIV-R、SRV-R、STLV-R引物序列的5’端添加有生物素標(biāo)記。一種可同時(shí)檢測(cè)并區(qū)分SIV、SRV、STLV的方法，包括如下步驟：1)提取待檢樣品RNA和合成cDNA；2)PCR擴(kuò)增反應(yīng)；3)PCR產(chǎn)物與熒光編碼微球雜交。4)信號(hào)檢測(cè)及結(jié)果判讀。優(yōu)選的，PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)33次；72℃延伸5min。優(yōu)選的，PCR產(chǎn)物與熒光編碼微球溶液的雜交體系為：熒光編碼微球溶液20μl，鏈霉親和素-藻紅蛋白溶液75μl，PCR產(chǎn)物5μl。優(yōu)選的，熒光編碼微球分別標(biāo)記有與上述所述Tag序列反向互補(bǔ)的序列。優(yōu)選的，PCR產(chǎn)物與熒光編碼微球雜交的程序?yàn)椋?5℃雜交35min。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明具有高特異性、高靈敏度、快速高效、成本低、結(jié)果準(zhǔn)確易讀等有益效果：1)高特異性：本發(fā)明根據(jù)SIV、SRV、STLV三個(gè)病毒高度保守序列，分別設(shè)計(jì)了三套特異性引物，三套引物Tm值接近，可接受高退火溫度進(jìn)行PCR反應(yīng)，保證了可以進(jìn)行多重PCR反應(yīng)和高特異性；2)高靈敏度：由于采取熒光信號(hào)讀取方式判定檢測(cè)結(jié)果，該檢測(cè)方法比傳統(tǒng)的PCR檢測(cè)方法要高出1至2個(gè)數(shù)量級(jí)。3)快速高效：只需提取一份樣本即可同時(shí)對(duì)三個(gè)病毒進(jìn)行檢測(cè)并予以區(qū)分，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間和樣本量；3)成本低：由于只需要一份試劑便可檢測(cè)一份樣本的多個(gè)指標(biāo)，打破傳統(tǒng)方法一份試劑檢測(cè)一份樣本的一個(gè)指標(biāo)的局限，實(shí)現(xiàn)真正的高通量檢測(cè)，大大降低了檢測(cè)試劑的成本；4)結(jié)果準(zhǔn)確易讀：檢測(cè)熒光信號(hào)通過Luminex200儀器進(jìn)行讀取，不需要進(jìn)行電泳，檢測(cè)結(jié)果容易判定，準(zhǔn)確度高，該檢測(cè)方法符合現(xiàn)代化檢測(cè)的需求。附圖說明圖1是實(shí)施例3特異性的檢測(cè)結(jié)果圖；圖2是實(shí)施例4各病毒質(zhì)粒的靈敏度檢測(cè)結(jié)果圖。具體實(shí)施方式以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。實(shí)施例1可同時(shí)檢測(cè)并區(qū)分SIV、SRV、STLV的檢測(cè)引物組的設(shè)計(jì)分別以猴逆轉(zhuǎn)錄病毒(SIV)的主要核心蛋白gag基因部分序列(GenBank登錄號(hào)為M74931.1)、猴逆轉(zhuǎn)錄病毒(SRV1，SRV2，SRV3)的p27蛋白中的部分保守基因序列(GenBank登錄號(hào)分別為M11841.1、AF126467.1、M12349)、猴T淋巴細(xì)胞趨向性病毒Ⅰ型的env基因部分序列主要為靶基因，利用PrimerPremier6設(shè)計(jì)特異性的引物，分別對(duì)設(shè)計(jì)的上游引物的5’端添加Tag序列，Tag序列與引物序列之間用SpacerC18隔開，下游引物5’端添加生物素標(biāo)記。最后用于PCR擴(kuò)增的檢測(cè)引物序列見表1。表1.SIV、SRV、STLV檢測(cè)引物組實(shí)施例2可同時(shí)檢測(cè)并區(qū)分SIV、SRV、STLV的方法的建立。(1)病毒總RNA的提取：采用美基生物公司的病毒總RNA提取試劑盒分別對(duì)SIV、SRV病毒培養(yǎng)液中的總病毒RNA進(jìn)行提取，并采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA.(2)PCR擴(kuò)增反應(yīng)：20μl反應(yīng)體系含有：SIVfd0.2μM，SIVbk0.2μM，SRVfd0.2μM，SRVbk0.2μM，STLV1fd0.2μM，STLVbk0.2μM，MultiplexPCRAssayKit中反應(yīng)液10.0μl，PCREnzymeMix0.1μl，待檢cDNA2.0μl，用DEPC水補(bǔ)齊到20μl；設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照；將配制好的PCR管混勻后離心，按如下程序進(jìn)行PCR反應(yīng)：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)33次；72℃延伸5min。(3)PCR產(chǎn)物與熒光編碼微球雜交。A、配制熒光編碼微球溶液：將包被有與設(shè)計(jì)引物的Tag序列反向互補(bǔ)的熒光微球(3種微球購(gòu)自Luminex公司，濃度為2500個(gè)/μl，具體的SIV、SRV、STLV分別對(duì)應(yīng)的熒光編碼微球號(hào)為MTAG-67、MTAG-15、MTAG-56)用1.1×的HybrdizationBuffer稀釋到每微升溶液中含有每種熒光編碼微球50個(gè)。B、配制鏈霉親和素-藻紅蛋白溶液：將1mg/ml的SAPE溶液用1×HybrdizationBuffer稀釋到10ug/ml.C、配制雜交體系：試劑體積熒光編碼微球溶液20μl鏈霉親和素-藻紅蛋白溶液75μlPCR產(chǎn)物5μl總體積100μlD、雜交程序：45℃雜交35min(4)信號(hào)檢測(cè)及結(jié)果判讀。通過Luminex200儀器對(duì)雜交產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)及分析，讀取每個(gè)樣本中每種熒光微球的MFI值并統(tǒng)計(jì)出平均的MFI值作為判定依據(jù)。根據(jù)儀器軟件設(shè)置，選取陰性對(duì)照為參考，當(dāng)樣本的MFI值大于1000時(shí)，可判為陽(yáng)性。實(shí)施例3特異性實(shí)驗(yàn)用實(shí)施例2的方法同時(shí)對(duì)SIV、SRV、STLV的混合cDNA模板進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證特異性。檢測(cè)結(jié)果顯示：三種病毒引物彼此間沒有交叉反應(yīng)(見圖1)。實(shí)施例4靈敏度實(shí)驗(yàn)以每個(gè)病毒的cDNA為模板，分別對(duì)應(yīng)的采用SIV-F/SIV-R、SRV-F/SRV-R、STLV-F/STLV-R引物組擴(kuò)增目標(biāo)片段并克隆到pMD19-T載體中，構(gòu)建特定質(zhì)粒，然后進(jìn)行10倍梯度進(jìn)行稀釋，用實(shí)施例2的操作方法分別對(duì)稀釋后的各梯度質(zhì)粒DNA進(jìn)行靈敏度的檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示：對(duì)于SIV，SIVfd/SIVbk引物組對(duì)質(zhì)粒的檢測(cè)靈敏度為10fg/μl；對(duì)于SRV1、SRV2、SRV3，SRVfd/SRVbk引物組對(duì)質(zhì)粒的檢測(cè)靈敏度分別為100fg/μl、10fg/μl、10fg/μl，對(duì)于STLV，STLVfd/STLVbk引物組對(duì)質(zhì)粒的檢測(cè)靈敏度為1fg/μl(見圖2)。實(shí)施例5不同引物組檢測(cè)效果的比較用實(shí)施例2的方法，采用其他的檢測(cè)引物組按照實(shí)施例4的方法對(duì)各濃度的質(zhì)粒進(jìn)行靈敏度檢測(cè)，其他檢測(cè)引物組序列及檢測(cè)結(jié)果如下表2和表3。表2其他檢測(cè)引物組序列表3不同檢測(cè)引物組的檢測(cè)效果比較備注：檢測(cè)引物組A來(lái)自于本發(fā)明的引物組。檢測(cè)結(jié)果顯示：本發(fā)明的檢測(cè)引物組相比其他的引物組具有更高的檢測(cè)靈敏度，引物彼此間干擾更??；引物組B未出現(xiàn)假陽(yáng)性，但檢測(cè)靈敏度有所下降；檢測(cè)引物組C的陰性對(duì)照檢測(cè)為陽(yáng)性，表明檢測(cè)引物組出現(xiàn)了干擾作用。本發(fā)明具有高特異性、高靈敏度、快速高效、成本低、結(jié)果準(zhǔn)確易讀等優(yōu)點(diǎn)，適合于各級(jí)檢測(cè)單位在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原檢測(cè)過程中進(jìn)行推廣應(yīng)用。上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所<120>一種可同時(shí)檢測(cè)并區(qū)分SIV、SRV、STLV的檢測(cè)引物組及方法<130><160>20<170>PatentInversion3.5<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>1acgacccggcggaaagaaaaagt23<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2tgcaccagatgacgcagacagt22<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>3ayggggctactgcyccata19<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>4gccattacckgcytgttgatt21<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>5gtgccaatcatggacctgcc20<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>6tcctggagcgtcgattagaagg22<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>7atctcaattacaataacacacaaa24<210>8<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>8tacttctttactacaatttacaac24<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>9cttaaactctacttacttctaatt24<210>10<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>10cgacccggcggaaagaaaaagt22<210>11<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>11tgcgccccaaatagctcagtttt23<210>12<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>12agctggaatggggacaggttcact24<210>13<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>13tgcggttttcccttctcccttct23<210>14<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>14aggcagttggctgggttcggtatt24<210>15<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>15acccagaagctaagggaacggcat24<210>16<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>16acagttctgccacctctgcact22<210>17<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>17atgcgccccaaatagctcagtttt24<210>18<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>18tggggacaggttcactacctggaa24<210>19<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>19agccatctccagcccttactggaa24<210>20<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>20agaagggagaagggaaaaccgca23當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3