本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?01080045362.2的中國專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)，原申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2010年10月5日的國際申請(qǐng)pct/ep2010/064830的中國國家階段申請(qǐng)。

本發(fā)明涉及酶促水解木質(zhì)纖維素材料和發(fā)酵糖的工藝。

背景技術(shù)：

木質(zhì)纖維素植物材料，本文中也稱為原料，是糖形式的可再生能源來源，其可被轉(zhuǎn)化為有價(jià)值的產(chǎn)物，例如生物燃料(例如生物乙醇)。該工藝期間，通過(半)纖維素分解酶，原料(麥秸、玉米稈、稻殼等)中存在的(木質(zhì)或半)纖維素被轉(zhuǎn)化為還原糖，接著通過微生物(比如酵母、細(xì)菌和真菌)，所述還原糖被轉(zhuǎn)化為有價(jià)值的產(chǎn)物例如乙醇。

鑒于(半)纖維素是結(jié)晶的并包埋在木質(zhì)素網(wǎng)中，向還原糖的轉(zhuǎn)化通常是慢的且不完全的。典型地，酶促水解未處理原料產(chǎn)生少于理論量的20％的糖。通過應(yīng)用化學(xué)和熱物理預(yù)處理，(半)纖維素對(duì)(半)-纖維素分解酶而言是更可接近的，因而轉(zhuǎn)化更快并在較高產(chǎn)率下轉(zhuǎn)化。

來自源自預(yù)處理的玉米稈的纖維素的典型的乙醇產(chǎn)率是40加侖乙醇/1000kg干玉米稈[1]，或0.3g乙醇/g原料?；诶w維素基的乙醇的最大產(chǎn)率是大約90％。

纖維素分解酶(它們中的大多由下述物種產(chǎn)生：比如trichoderma、humicola和aspergillus)在商業(yè)上被用來將預(yù)處理的原料轉(zhuǎn)化為含有不可溶的(半)纖維素、其制得的還原糖以及木質(zhì)素的糊狀物(mash)。然后該糊狀物被用在發(fā)酵中，發(fā)酵期間還原糖被轉(zhuǎn)化為酵母生物質(zhì)(biomass)(細(xì)胞)、二氧化碳和乙醇。以這種方式產(chǎn)生的乙醇被稱為生物乙醇。

從預(yù)處理的木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)糖的一般工藝中，水解(還被稱為液化、預(yù)糖化或糖化)典型地在45-50℃的升高的溫度下[2]和非滅菌條件下在持續(xù)6-168小時(shí)[2][4]的工藝期間發(fā)生。在該水解期間，存在的纖維素被部分(典型地30-95％，取決于酶活性和水解條件)轉(zhuǎn)化為還原糖。在酶被預(yù)處理原料中存在的化合物和被釋放的糖抑制的情況下，為最小化熱失活，該升溫期盡可能地減到最小。

水解后的發(fā)酵在單獨(dú)的厭氧工藝步驟中發(fā)生，該工藝步驟在相同或不同容器中，其中溫度被調(diào)至30-33℃(嗜溫工藝)以適應(yīng)生長和通過微生物生物質(zhì)(通常為酵母)生產(chǎn)乙醇。在該發(fā)酵工藝期間，通過來自水解步驟的仍存在的酶，剩余的(半)纖維素材料被轉(zhuǎn)化為還原糖，同時(shí)產(chǎn)生微生物生物質(zhì)和乙醇。這種類型的發(fā)酵因而通常被稱為同時(shí)糖化和發(fā)酵(ssf)。一旦(半)纖維素材料被轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖并且所有可發(fā)酵糖被轉(zhuǎn)化為乙醇、二氧化碳和微生物細(xì)胞，發(fā)酵完成。這可耗費(fèi)長達(dá)6天。水解和發(fā)酵的總工藝時(shí)間因而可共達(dá)7天。

這樣獲得發(fā)酵糊狀物由非可發(fā)酵糖、非可水解(半)纖維素材料、木質(zhì)素、微生物細(xì)胞(大多通常為酵母細(xì)胞)、水、乙醇、溶解的二氧化碳組成。在連續(xù)步驟期間，從糊狀物中蒸餾并進(jìn)一步純化乙醇。剩余的固體懸浮液被干燥并被用作例如燃燒燃料、肥料和牛飼料。

就每批次的原料而言，添加酶，以在給定的工藝時(shí)間期間使從預(yù)處理的木質(zhì)素纖維素原料釋放的可發(fā)酵糖的產(chǎn)率和速率最大化。通常，生產(chǎn)酶的成本、原料到乙醇的產(chǎn)率和投資是總生產(chǎn)成本中的主要成本因素[2]。就此而言，通過應(yīng)用來自單種微生物來源或來自多種微生物來源[7]的具有更寬和/或更高(特異性)水解活性的酶產(chǎn)物來實(shí)現(xiàn)酶使用成本降低，使用所述酶目的在于更低的酶需求、更快的轉(zhuǎn)化速率和/或更高的轉(zhuǎn)化產(chǎn)率和因而更低的總生物乙醇生產(chǎn)成本。這需要在研究和開發(fā)這些酶產(chǎn)物中的大筆投資。在由來自多種微生物來源的酶組成的酶產(chǎn)物情況下，需要針對(duì)每種單個(gè)酶化合物的大的資本投資。

因此期望改進(jìn)包括水解和發(fā)酵的上述工藝。

源自talaromyces的熱穩(wěn)定纖維素分解酶已被用于降解木質(zhì)纖維素原料并且這些酶就它們的熱穩(wěn)定性而言在wo2007091231中已知[3]。但沒有給出怎樣優(yōu)化水解和發(fā)酵工藝的公開。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

因此，本發(fā)明的目的是提供這樣的工藝，其中水解步驟和發(fā)酵步驟在最佳溫度條件下進(jìn)行。本發(fā)明的另一方面是提供包括具有減少工藝時(shí)間的水解和發(fā)酵的工藝。本發(fā)明的其他目的是提供這樣的工藝，其中酶的劑量可被減少并且同時(shí)有用的發(fā)酵產(chǎn)物的輸出被保持在相同水平。另一目的是提供這樣的工藝，其中被污染微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)被降低。另一目的是提供這樣的工藝，其中干物質(zhì)含量增加。另一目的是提供包括水解和發(fā)酵的工藝，其中發(fā)酵的工藝條件被優(yōu)化。根據(jù)本發(fā)明達(dá)到這些目的的一個(gè)或多個(gè)。本發(fā)明提供了從木質(zhì)纖維素制備發(fā)酵產(chǎn)物的工藝，其包括下述步驟：

a)任選地預(yù)處理；

b)任選地洗滌；

c)酶促水解；

d)發(fā)酵；和

e)任選地回收發(fā)酵產(chǎn)物；

其中，在步驟c)中，使用了具有55℃或更高的最適溫度的酶組合物，水解時(shí)間是40小時(shí)或更長和水解溫度是50℃或更高。

令人吃驚地，根據(jù)本發(fā)明，通過提供穩(wěn)定的并具有55℃或更高的最適溫度的酶組合物用于酶促水解步驟c)，達(dá)到許多工藝優(yōu)勢(shì)是可能的，包括最佳溫度條件、減少工藝時(shí)間、降低酶劑量、降低污染風(fēng)險(xiǎn)、更高干物質(zhì)濃度、酶的再利用和導(dǎo)致成本降低的其他工藝優(yōu)化。

在該工藝的一種實(shí)施方式中，發(fā)酵時(shí)間是18-120小時(shí)，在一種實(shí)施方式中，使用的穩(wěn)定酶組合物保留活性30小時(shí)或更久。

根據(jù)另外的實(shí)施方式，水解在55℃或更高的溫度下進(jìn)行。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，酶組合物源自talaromyces屬(踝節(jié)菌屬)的微生物。以下將更詳細(xì)地闡釋本發(fā)明的工藝。

附圖說明

圖1：使用穩(wěn)定的纖維素分解踝節(jié)菌屬酶，從原料的10％干物質(zhì)懸浮液中葡萄糖隨時(shí)間釋放。上面的點(diǎn)線表示基于原料中的纖維素組成可釋放的葡萄糖的理論最大值。下面的點(diǎn)線表示90％轉(zhuǎn)化水平。a表示實(shí)現(xiàn)90％水平的時(shí)刻。

圖2：在不同的踝節(jié)菌屬酶劑量(表示為體積酶溶液/原料干物質(zhì)的量)在預(yù)處理的木質(zhì)纖維素原料水解期間釋放的還原糖葡萄糖。點(diǎn)線表示可從原料產(chǎn)生的葡萄糖的90％最大理論量(90％轉(zhuǎn)化)。a表示用0.175ml酶溶液/g原料干物質(zhì)的劑量實(shí)現(xiàn)90％水解的時(shí)刻；b表示用0.075ml酶溶液/g原料干物質(zhì)的劑量實(shí)現(xiàn)90％水解的時(shí)刻。

圖3：使用回收踝節(jié)菌屬酶的情況下，60℃水解原料72小時(shí)期間釋放的糖的量。圖表顯示回收酶的5次循環(huán)(實(shí)驗(yàn)2-6)。在每個(gè)循環(huán)中，從先前循環(huán)回收的酶量被用來水解新批次的預(yù)處理原料。沒有添加新酶?；厥胀ㄟ^使用離心和超濾完成。將每個(gè)循環(huán)釋放的糖量與其中使用了不是回收踝節(jié)菌屬酶的實(shí)驗(yàn)1中釋放的量相比較。

圖4：在不同的踝節(jié)菌屬酶劑量(表示為體積酶溶液/原料干物質(zhì)的量)下對(duì)預(yù)處理的木質(zhì)纖維素原料水解期間釋放的還原糖葡萄糖。顯示了10％w/w原料干物質(zhì)和15％w.w原料干物質(zhì)的結(jié)果。

圖5：在若干酶劑量下，對(duì)10％干物質(zhì)原料懸浮液水解、發(fā)酵和真空蒸餾之前(對(duì)照樣品)和之后每底物單位表示的酶活性總量。一個(gè)底物單位酶活性釋放1mmol還原糖。

圖6：用0.20(●)和0.09(■)g酶組合物/g原料干物質(zhì)，在水解期間釋放葡萄糖(實(shí)施例2)。

圖7：在酒糟水中的不同酶劑量下，從原料釋放的葡萄糖的相對(duì)量(實(shí)施例4)。

圖8展示了菌株bie252在13.8％d.m.下的經(jīng)水解的玉米纖維中的性能。顯示了co2生產(chǎn)速率、乙醇生產(chǎn)和糖轉(zhuǎn)化。

圖9展示了菌株bie252在10％d.m.下的經(jīng)水解的玉米稈中的性能。顯示了co2生產(chǎn)速率、乙醇生產(chǎn)和糖轉(zhuǎn)化。

圖10展示了菌株bie252在10％d.m.下的經(jīng)水解的麥秸中的性能。顯示了co2生產(chǎn)速率、乙醇生產(chǎn)和糖轉(zhuǎn)化。

具體實(shí)施方式

發(fā)明詳述

現(xiàn)在以其所有實(shí)施方式形式更詳細(xì)地描述本發(fā)明。

穩(wěn)定酶組合物

根據(jù)本發(fā)明，在水解步驟中，使用了穩(wěn)定的酶組合物，其具有55℃或更高，優(yōu)選地60℃或更高，或65度或更高的最適溫度。通過在不同的溫度下測(cè)量酶組合物的活性并繪制活性對(duì)溫度圖，然后確定最適溫度(即發(fā)現(xiàn)最高活性下的溫度)。

本文中穩(wěn)定酶組合物表示，酶組合物在30小時(shí)水解反應(yīng)時(shí)間后保留活性，優(yōu)選地，在30小時(shí)水解反應(yīng)時(shí)間后保留其初始活性的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。優(yōu)選地，酶組合物在40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500小時(shí)的水解反應(yīng)時(shí)間后保留活性。

酶組合物可源自微生物。用在本發(fā)明工藝中的組合物包含典型地源自penicillium綱的腐生物真菌微生物和源自talaromyces屬(例如talaromycesemersonii)的酶促活性。talaromycesemersonii還被稱為geosmithiaemersonii或penicilliumemersonii。talaromycesemersonii還被稱為talaromycesduponti和penicilliumduponti。

可用微生物(例如talaromycesemersonii)通過發(fā)酵合適的底物制備酶組合物，其中酶組合物通過微生物生產(chǎn)。任選地，使用了誘導(dǎo)酶組合物中的酶表達(dá)的底物。

酶組合物被用來從包含多糖的木質(zhì)纖維素中釋放糖。主要的多糖有纖維素(葡聚糖)、半纖維素(木聚糖、雜木聚糖(heteroxylans)和木葡聚糖(xyloglucans))。另外，一些半纖維素可在例如得自木材的原料中作為葡甘露聚糖存在。這些多糖向可溶糖(包括單體和多體，例如葡萄糖、纖維二糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、果糖、甘露糖、鼠李糖、核糖、半乳糖醛酸、葡糖醛酸和其他己糖和戊糖)的酶促水解發(fā)生于共同作用(actinginconcert)的不同酶的作用下。

另外，果膠和其他果膠物質(zhì)如阿拉伯聚糖(arabinans)可占來自非木本植物組織典型的細(xì)胞壁干物質(zhì)的可觀的比例(約四分之一到一半的干物質(zhì)可以是果膠)。

纖維素是由通過β-1,4鍵連接的葡萄糖殘基組成的線性多糖。纖維素纖維的線性本質(zhì)以及化學(xué)計(jì)量的β-連接的葡萄糖(相對(duì)于α)產(chǎn)生比淀粉的高度枝化的α-連接的結(jié)構(gòu)更傾向于鏈間(interstrand)氫鍵結(jié)合的結(jié)構(gòu)。因此，纖維素聚合物與淀粉中存在的纖維相比通常溶解度更小，并且形成更緊密結(jié)合的纖維。

現(xiàn)詳細(xì)描述可被包括在用于本發(fā)明的穩(wěn)定酶組合物中的酶：

內(nèi)切葡聚糖酶(eg)和外切纖維二糖水解酶(cbh)催化不溶性纖維素水解成為纖維寡糖(纖維二糖作為主要產(chǎn)物)，而β-葡糖苷酶(bg)將寡糖(主要是纖維二糖和纖維三糖)轉(zhuǎn)化成葡萄糖。

半纖維素是復(fù)合聚合物，并且其組成常常在生物之間、組織類型之間大幅變化。通常，半纖維素的主要成分是β-1,4-連接的木糖(一種五碳糖)。然而，所述木糖通常在木糖的0-3和/或0-2原子處被枝化，并且可以被與阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、葡糖醛酸、半乳糖醛酸形成的鍵取代，或者被乙酸酯化的酯鍵(和阿魏酸對(duì)阿拉伯糖的酯化的酯鍵)取代。半纖維素也可含有葡聚糖，所述葡聚糖是β-連接的六碳糖(如先前提到的β-(1,3)(1,4)葡聚糖和雜葡聚糖)和額外的葡甘露聚糖(其中葡萄糖和甘露糖均存在于線性主鏈中，彼此通過β-鍵連接)的總稱。

木聚糖酶與其他附屬酶例如α-l-阿拉伯呋喃糖酶、阿魏酸酯酶和乙酰木聚糖酯酶、葡糖醛酸糖苷酶和β-木糖苷酶一起，催化半纖維素的水解。

果膠物質(zhì)包括果膠、阿拉伯聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖。果膠是植物細(xì)胞壁中最復(fù)雜的多糖。它們沿著一定程度上散布著l-鼠李糖的α(1,4)-連接的d-半乳糖醛酸單元核心鏈周圍構(gòu)建。在任何細(xì)胞壁中都存在符合所述描述的大量結(jié)構(gòu)單元，并且通常認(rèn)為在單個(gè)果膠分子中，不同結(jié)構(gòu)單元的核心鏈彼此連續(xù)。

結(jié)構(gòu)單元的主要類型是：聚半乳糖醛酸(同聚半乳糖醛酸)，其可被甲醇在羧基上取代，被乙酸酯在o-2和o-3上取代；鼠李半乳糖醛酸聚糖i(rgi)，其中半乳糖醛酸單元與帶有(1,4)-連接的半乳聚糖和(1,5)-連接的阿拉伯聚糖側(cè)鏈的鼠李糖交替存在。阿拉伯聚糖側(cè)鏈可直接與鼠李糖結(jié)合，或者通過半乳聚糖鏈間接結(jié)合；木半乳糖醛酸聚糖，在半乳糖醛酸的o-3上具有單個(gè)木糖基單元(與rgi緊密結(jié)合)；和鼠李半乳糖醛酸聚糖ii(rgii)，含有罕見糖例如芹糖的特別復(fù)雜的小型單元。rgii單元可含有兩個(gè)芹菜糖殘基，所述芹菜糖殘基在合適的離子條件下能夠與硼酸鹽可逆地形成酯。

在本發(fā)明方法中使用的組合物包含至少兩種活性，但是典型地組合物將包含多于兩種活性，例如三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種或更多。典型地，本發(fā)明的組合物可包含至少一種纖維素酶和至少一種半纖維素酶。然而，本發(fā)明的組合物可包含纖維素酶，但是不含木聚糖酶。另外，本發(fā)明的組合物可包含輔助酶活性，即直接或間接導(dǎo)致木質(zhì)纖維素降解的額外的活性。此類輔助活性的例子在本文中有提到。

因此，在本發(fā)明中使用的組合物可含有內(nèi)切葡聚糖酶活性和/或纖維二糖水解酶活性和/或β-葡糖苷酶活性。在本發(fā)明中使用的組合物可包含一個(gè)或多個(gè)這些種類中的多于一種的酶活性。例如，在本發(fā)明中使用的組合物可包含兩種內(nèi)切葡聚糖酶活性，例如內(nèi)切-1,3(1,4)-β葡聚糖酶活性和內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶活性。此類組合物也可包含一種或多種木聚糖酶活性。此類組合物可包含輔助酶活性。

在本發(fā)明中使用的組合物可源自talaromycesemersonii。在本發(fā)明中，預(yù)期核心的一組(降解木質(zhì)纖維素的)酶活性可源自talaromycesemersonii。talaromycesemersonii能夠提供本文中證明對(duì)木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的水解而言高度有效的活性組。隨后可對(duì)所述活性補(bǔ)充來自其他來源的額外的酶活性。此類額外的活性可源自經(jīng)典來源和/或由經(jīng)遺傳改造的生物生產(chǎn)。

本發(fā)明中使用的組合物中的活性可以是熱穩(wěn)定的。本文中這表示該活性具有40℃或更高，例如約50℃或更高，例如約60℃或更高，例如約70℃或更高，例如約75℃或更高，例如約80℃或更高，例如85℃或更高的最適溫度。本發(fā)明中使用的組合物中的活性一般不具有相同的最適溫度，但是優(yōu)選地應(yīng)是熱穩(wěn)定的。

另外，本發(fā)明中使用的組合物中的酶活性可以能夠在低ph下工作。就本發(fā)明的目的而言，低ph表示約5.5或更低，約5或更低，約4.9或更低，約4.8或更低，約4.7或更低，約4.6或更低，約4.5或更低，約4.4或更低，約4.3或更低，約4.2或更低，約4.1或更低，約4.0或更低，約3.9或更低，或約3.8或更低，約3.7或更低，約3.6或更低，或約3.5或更低的ph。

本發(fā)明中使用的組合物中的活性可以通過任何上述最適溫度和ph值的組合來限定。除了源自talaromyces的活性以外，本發(fā)明方法中使用的組合物還可包含纖維素酶(例如源自除talaromyces之外其他來源的纖維素酶)和/或半纖維素酶(例如源自除talaromyces之外其他來源的半纖維素酶)和/或果膠酶。

本發(fā)明中使用的組合物可包含一類、兩類、三類、四類或更多類纖維素酶，例如內(nèi)切葡聚糖酶(eg)的一種、兩種、三種或四種或所有，外切纖維二糖水解酶(cbh)和β-葡糖苷酶(bg)的一種或兩種。本發(fā)明中使用的組合物可包含兩種或更多種任何這些種類的纖維素酶。

已知talaromyces原產(chǎn)的β-葡糖苷酶非常有活性，talaromycesβ-葡糖苷酶cel3a的vmax值是512iu/mg，可觀地高于針對(duì)來自其他真菌來源的β-葡糖苷酶所報(bào)道的數(shù)值(p.murrayetal./proteinexpressionandpuriwcation38(2004)248–257)。盡管根據(jù)本發(fā)明的組合物中β-葡糖苷酶有高活性并且達(dá)到了高葡萄糖水平，但是不發(fā)生葡萄糖抑制。這是有利的，因?yàn)槭褂酶鶕?jù)本發(fā)明的組合物可以將高活性和高葡萄糖水平組合在一起。

本發(fā)明的組合物可包含下述活性，所述活性與本發(fā)明方法中使用的組合物所提供的活性具有不同種類的纖維素酶活性和/或半纖維素酶活性和/或果膠酶活性。例如，本發(fā)明的組合物可包含一類由本文所述的組合物提供的纖維素酶和/或半纖維素酶活性和/或果膠酶活性，和由額外的纖維素酶/半纖維素酶/果膠酶提供的第二類纖維素酶和/或半纖維素酶活性和/或果膠酶活性。

在本文中，纖維素酶是能夠降解或改性纖維素的任何多肽。能夠降解纖維素的多肽是能夠催化下述過程的多肽：將纖維素降解成更小的單元，例如部分地降解成纖維素糊精，或者完全降解成葡萄糖單體。與纖維素酶接觸時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的纖維素酶可得到纖維素糊精與葡萄糖單體的混合種群。此類降解將典型地通過水解反應(yīng)而發(fā)生。

本文中，半纖維素是能夠降解或改性半纖維素的任何多肽。也就是說，半纖維素酶可能能夠降解或改性木聚糖、葡糖醛酸木聚糖、阿拉伯木聚糖、葡甘露聚糖和木葡聚糖之一種或多種。能夠降解半纖維素的多肽是能夠催化下述過程的多肽：將半纖維素降解成更小的多糖，例如部分地降解成寡糖，或者完全降解成糖單體，例如己糖或戊糖單體。與半纖維素酶接觸時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的半纖維素酶可得到寡糖與糖單體的混合種群。此類降解將典型地通過水解反應(yīng)而發(fā)生。

本文中，果膠酶是能夠降解或改性果膠的任何多肽。能夠降解果膠的多肽是能夠催化下述過程的多肽：將果膠降解成更小的單元，例如部分地降解成寡糖，或者完全降解成糖單體。與果膠酶接觸時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的果膠酶可得到寡糖與糖單體的混合種群。此類降解將典型地通過水解反應(yīng)而發(fā)生。

因此，本發(fā)明的組合物可包含任何纖維素酶，例如纖維二糖水解酶，內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶，β-葡糖苷酶或β-(1,3)(1,4)-葡聚糖酶。

本文中，纖維二糖水解酶(ec3.2.1.91)是能夠催化纖維素或纖維四糖中1,4-β-d-葡糖苷鍵水解、從鏈末端釋放纖維二糖的任何多肽。所述酶也可以被稱作纖維素酶1,4-β-纖維二糖苷酶(1,4-β-cellobiosidase)，1,4-β-纖維二糖水解酶，1,4-β-d-葡聚糖纖維二糖水解酶，微晶纖維素酶(avicelase)，外切-1,4-β-d-葡聚糖酶，外切纖維二糖水解酶或外切葡聚糖酶。

本文中，內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶(ec3.2.1.4)是能夠催化纖維素、地衣淀粉或谷類β-d-葡聚糖中1,4-β-d-葡糖苷鍵內(nèi)切水解的任何多肽。此類多肽也可以能夠水解還含有1,3-鍵的β-d-葡聚糖中的1,4-鍵。所述酶也可以被稱作纖維素酶、微晶纖維素酶、β-1,4-內(nèi)切葡聚糖水解酶、β-1,4-葡聚糖酶、羧甲基纖維素酶、纖維糊精酶、內(nèi)切-1,4-β-d-葡聚糖酶、內(nèi)切-1,4-β-d-葡聚糖水解酶、內(nèi)切-1,4-β-葡聚糖酶或內(nèi)切葡聚糖酶。

本文中，β-葡糖苷酶(ec3.2.1.21)是能夠催化末端、非還原性β-d-葡萄糖殘基水解并釋放β-d-葡萄糖的任何多肽。這樣的多肽可具有針對(duì)β-d-葡糖苷的廣泛特異性，并且也可以水解以下一種或多種：β-d-半乳糖苷、α-l-阿拉伯糖苷、β-d-木糖苷或β-d-巖藻糖苷。所述酶也可以被稱作苦杏仁苷酶、β-d-葡糖苷葡糖水解酶、纖維二糖酶或龍膽二糖酶。

本文中，β-(1,3)(1,4)-葡聚糖酶(ec3.2.1.73)是能夠催化含有1,3-和1,4-鍵的β-d-葡聚糖中1,4-β-d-葡糖苷鍵水解的任何多肽。此類多肽可作用于地衣淀粉和谷類β-d-葡聚糖，但不作用于僅含1,3-或1,4-鍵的β-d-葡聚糖。所述酶也可以被稱作地衣淀粉酶(licheninase)，1,3-1,4-β-d-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，β-葡聚糖酶，內(nèi)切-β-1,3-1,4葡聚糖酶，地衣多糖酶(lichenase)或混合鍵β-葡聚糖酶。這類酶的替代方案是被描述為內(nèi)切-1,3(4)-β-葡聚糖酶的ec3.2.1.6。當(dāng)下述葡萄糖殘基在c-3處被自身取代時(shí)，這類酶水解β-d-葡聚糖酶中的1,3-鍵或1,4-鍵，所述葡萄糖殘基的還原基團(tuán)涉及要水解的鍵。替代性的名稱包括內(nèi)切-1,3-β-葡聚糖酶，昆布多糖酶，1,3-(1,3；1,4)-β-d-葡聚糖3(4)葡聚糖水解酶，底物包括昆布多糖，地衣淀粉和谷類β-d-葡聚糖。

本發(fā)明的組合物可以包含任何半纖維素酶，例如內(nèi)切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-d-葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、香豆酸酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-甘露聚糖酶或β-甘露糖苷酶。

本文中，內(nèi)切木聚糖酶(ec3.2.1.8)是能夠催化木聚糖中1,4-β-d-木糖苷鍵內(nèi)切水解的任何多肽。所述酶也可以被稱作內(nèi)切-1,4-β-木聚糖酶或1,4-β-d-木聚糖木聚糖水解酶。一種替代方案是ec3.2.1.136，葡糖醛酸阿拉伯木聚糖內(nèi)切木聚糖酶，一種能夠水解葡糖醛酸阿拉伯木聚糖中1,4木糖苷鍵的酶。

本文中，β-木糖苷酶(ec3.2.1.37)是能夠催化1,4-β-d-木聚糖的水解、從非還原性末端去除相繼的d-木糖殘基的任何多肽。這類酶也可以水解木二糖。所述酶也可以被稱作木聚糖1,4-β-木糖苷酶、1,4-β-d-木聚糖木糖水解酶、外切-1,4-β-木糖苷酶或木二糖酶。

本文中，α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶(ec3.2.1.55)是能夠作用于α-l-阿拉伯呋喃糖苷、含(1,2)和/或(1,3)-和/或(1,5)-鍵的α-l-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖的任何多肽。所述酶也可以被稱作α-n-阿拉伯呋喃糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶或阿拉伯糖苷酶。

本文中，α-d-葡糖醛酸糖苷酶(ec3.2.1.139)是能夠催化以下形式反應(yīng)的任何多肽：α-d-葡糖醛酸苷+h(2)o＝醇+d-葡糖醛酸酯。所述酶也被稱作α-葡糖醛酸糖苷酶或α-葡糖苷酸酶。這些酶也可水解可作為木聚糖中取代基存在的4-o-甲基化的葡糖醛酸。替代方式是ec3.2.1.131：木聚糖α-1,2-葡糖醛酸糖苷酶，其催化α-1,2-(4-o-甲基)葡糖醛?；B接的水解。

本文中，乙?；揪厶酋ッ?ec3.1.1.72)是能夠催化木聚糖和木寡糖脫乙酰化的任何多肽。此類多肽可催化來自多聚木聚糖、乙酰化木糖、乙?；咸烟恰ⅵ?萘基乙酸酯或?qū)ο趸交宜狨サ囊阴；?，但是一般不催化來自于三乙酰基丙三醇的乙?；狻４祟惗嚯囊话悴蛔饔糜谝阴；母事毒厶腔蚬z。

本文中，阿魏酸酯酶(ec3.1.1.73)是能夠催化以下形式反應(yīng)的任何多肽：阿魏酸-糖+h(2)o＝阿魏酸酯+糖。糖可以是例如寡糖或多糖。其典型地可以催化來自酯化的糖的4-羥基-3-甲氧基肉桂酰(阿魏酰)基的水解，所述糖通常是“天然”底物中的阿拉伯糖。對(duì)硝基苯酚乙酸酯和阿魏酸甲基酯是典型地更弱的底物。所述酶也可以被稱作肉桂酰基酯水解酶，阿魏酸酯酶或羥基肉桂?；ッ?。也可以被稱作半纖維素附屬酶，因?yàn)槠淇蓭椭揪厶敲负凸z酶分解植物細(xì)胞壁半纖維素和果膠。

本文中，香豆?；ッ?ec3.1.1.73)是能夠催化以下形式反應(yīng)的任何多肽：香豆?；?糖+h(2)o＝香豆酸酯+糖。糖可以是例如寡糖或多糖。所述酶也可以被稱作反式-4-香豆酰基酯酶、反式-對(duì)香豆酰基酯酶、對(duì)香豆?；ッ富?qū)ο愣顾狨ッ?。所述酶也落入ec3.1.1.73中，從而也可以被稱作阿魏酸酯酶。

本文中，α-半乳糖苷酶(ec3.2.1.22)是能夠催化α-d-半乳糖苷(包括半乳糖寡糖、半乳甘露聚糖、半乳聚糖和阿拉伯半乳聚糖)中末端、非還原性α-d-半乳糖殘基水解的任何多肽。此類多肽也可以能夠水解α-d-巖藻糖苷。所述酶也可以被稱作蜜二糖酶。

本文中，β-半乳糖苷酶(ec3.2.1.23)是能夠催化β-d-半乳糖苷中末端非還原性β-d-半乳糖殘基水解的任何多肽。這樣的多肽也可以能夠水解α-l-阿拉伯糖苷。所述酶也可以被稱作外切-(1->4)-β-d-半乳聚糖酶或乳糖酶。

本文中，β-甘露聚糖酶(ec3.2.1.78)是能夠催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖和葡甘露聚糖中1,4-β-d-甘露糖苷鍵隨機(jī)水解的任何多肽。所述酶也可以被稱作甘露聚糖內(nèi)切-1,4-β-甘露糖苷酶或內(nèi)切-1,4-甘露聚糖酶。

本文中，β-甘露糖苷酶(ec3.2.1.25)是能夠催化β-d-甘露糖苷中末端非還原性β-d-甘露糖殘基水解的任何多肽。所述酶也可以被稱作甘露聚糖酶或甘露糖酶。

本發(fā)明的組合物可包含任何果膠酶，例如內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶，果膠甲基酯酶，內(nèi)切-半乳聚糖酶，β-半乳糖苷酶，果膠乙?；ッ福瑑?nèi)切-果膠裂解酶，果膠酸裂解酶，α-鼠李糖苷酶，外切-半乳糖醛酸酶，外切多聚半乳糖醛酸酯裂解酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶，鼠李半乳糖醛酸聚糖乙?；ッ?，鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸水解酶，木半乳糖醛酸酶。

本文中，內(nèi)切-多聚半乳糖醛酸酶(ec3.2.1.15)是能夠催化果膠酸酯和其他半乳糖醛酸聚糖中1,4-α-d-半乳糖醛酸鍵的隨機(jī)水解的任何多肽。所述酶也可以被稱作多聚半乳糖醛酸酶果膠解聚酶，果膠酶(pectinase)，內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶，果膠酶(pectolase)，果膠水解酶，果膠多聚半乳糖醛酸酶，多聚-α-1,4-半乳糖醛酸苷聚糖水解酶，內(nèi)切半乳糖醛酸酶；內(nèi)切-d-半乳糖醛酸酶或多聚(1,4-α-d-半乳糖醛酸苷)聚糖水解酶。

在本文中，果膠甲基酯酶(ec3.1.1.11)是能夠催化下述反應(yīng)的任何酶：果膠+nh2o＝n甲醇+果膠酸。所述酶也已知為果膠酯酶(pectinesterase)，果膠脫甲氧基酶，果膠甲氧基酶，果膠甲基酯酶，果膠酶，果膠酯酶(pectinoesterase)或果膠果酰基水解酶(pectinpectylhydrolase)。

在本文中，內(nèi)切-半乳聚糖酶(ec3.2.1.89)是能夠催化阿拉伯半乳聚糖中1,4-β-d-半乳糖苷鍵的內(nèi)切水解的任何酶。所述酶也已知為阿拉伯半乳聚糖內(nèi)切-1,4-β-半乳糖苷鍵酶，內(nèi)切-1,4-β-半乳聚糖酶，半乳聚糖酶，阿拉伯半乳聚糖酶或阿拉伯半乳聚糖4-β-d-半乳聚糖水解酶。

本文中，果膠乙酰基酯酶在本文中被定義為下述任何酶，所述酶具有催化果膠gaiua殘基羥基處的乙酰基的脫乙?；饔玫囊阴；ッ富钚?。

本文中，內(nèi)切-果膠裂解酶(ec4.2.2.10)是能夠催化(1→4)-α-d-半乳糖醛酸聚糖甲基酯的清除性切割，得到在其非還原末端具有4-脫氧-6-o-甲基-α-d-半乳-4-糖醛?；墓烟堑娜魏蚊?。酶也可已知為果膠裂解酶，果膠反式消除酶(trans-eliminase)，內(nèi)切果膠裂解酶，多聚甲基半乳糖醛酸反式消除酶，果膠甲基反式消除酶，果膠酶(pectolyase)，pl，pnl或pmgl或(1→4)-6-o-甲基-α-d-半乳糖醛酸聚糖裂解酶。

本文中，果膠酸裂解酶(ec4.2.2.2)是能夠催化(1→4)-α-d-半乳糖醛酸聚糖的消除性切割，得到在其非還原性末端具有4-脫氧-α-d-半乳-4-糖醛?；墓烟堑娜魏蚊浮Ｃ敢部梢砸阎獮槎嗑郯肴樘侨┧岱词较?，果膠酸反式消除酶，多聚半乳糖醛酸酯裂解酶，內(nèi)切果膠甲基反式消除酶，果膠酸反式消除酶，內(nèi)切半乳糖醛酸酯反式消除酶，果膠酸裂解酶，果膠裂解酶，α-1,4-d-內(nèi)切多聚半乳糖醛酸裂解酶，pga裂解酶，ppase-n，內(nèi)切-α-1,4-多聚半乳糖醛酸裂解酶，多聚半乳糖醛酸裂解酶，果膠反式消除酶，多聚半乳糖醛酸反式消除酶或(1→4)-α-d-半乳糖醛酸聚糖裂解酶。

本文中，α-鼠李糖苷酶(ec3.2.1.40)是能夠催化α-l-鼠李糖苷或替代地鼠李半乳糖醛酸聚糖中末端非還原性α-l-鼠李糖殘基水解的任何多肽。所述酶也可以已知為α-l-鼠李糖苷酶t，α-l-鼠李糖苷酶n或α-l-鼠李糖苷鼠李糖水解酶。

本文中，外切-半乳糖醛酸酶(ec3.2.1.82)是能夠從非還原性末端水解果膠酸、釋放二半乳糖醛酸的任何多肽。酶也可以已知為外切-多聚-α-半乳糖醛酸苷酶(exo-poly-α-galacturonosidase)、外切多聚半乳糖醛酸苷酶(exopolygalacturonosidase)或外切多聚聚半乳糖醛酸苷酶(exopolygalacturanosidase)。

本文中，外切-半乳糖醛酸酶(ec3.2.1.67)是能夠催化以下的任何多肽：(1,4-α-d-半乳糖醛酸苷)n+h2o＝(1,4-α-d-半乳糖醛酸苷)n-1+d-半乳糖醛酸酯。所述酶也可以已知為半乳糖醛1,4-α-半乳糖醛酸苷酶(galacturan1,4-α-galacturonidase)，外切多聚半乳糖醛酸酶，多聚(半乳糖醛酸酯)水解酶，外切-d-半乳糖醛酸酶，外切-d-半乳糖醛酸聚糖酶，外切多聚-d-半乳糖醛酸酶或多聚(1,4-α-d-半乳糖醛酸苷)半乳糖醛酸水解酶。

本文中，外切多聚半乳糖醛酸酯裂解酶(ec4.2.2.9)是能夠催化從果膠酸(即脫脂化的果膠)的還原末端消除性切割4-(4-脫氧-α-d-半乳-4-糖醛?；?-d-半乳糖醛酸酯的任何多肽。所述酶可已知為果膠酸二糖裂解酶，果膠酸外切裂解酶，外切果膠酸反式消除酶，外切果膠酸裂解酶，外切多聚半乳糖醛酸-反式-消除酶，pate，外切-pate，外切-pgl或(1→4)-α-d-半乳糖醛酸聚糖還原末端二糖裂解酶。

本文中，鼠李半乳糖醛酸聚糖水解酶是能夠在嚴(yán)格交替出現(xiàn)的鼠李半乳糖醛酸聚糖結(jié)構(gòu)中以內(nèi)切方式水解半乳基糖醛酸酸和吡喃鼠李糖基之間鍵的任何多肽，所述鼠李半乳糖醛酸聚糖結(jié)構(gòu)由二糖[(1,2-α-l-鼠李糖基-(1,4)-α-半乳糖醛酸]組成。

本文中，鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶是能夠以內(nèi)切方式在鼠李半乳糖醛酸聚糖中通過β-消除切割α-l-rhap-(1→4)-α-d-galpa鍵的任何多肽。

本文中，鼠李半乳糖醛酸聚糖乙?；ッ甘悄軌虼呋罄畎肴樘侨┧峋厶侵薪惶娉霈F(xiàn)的鼠李糖和半乳糖醛酸殘基主鏈的脫乙酰化的任何多肽。

本文中，鼠李半乳糖醛酸聚糖半乳糖醛酸水解酶是能夠以外切方式、從嚴(yán)格交替出現(xiàn)的鼠李半乳糖醛酸聚糖結(jié)構(gòu)的非還原性末端水解半乳糖醛酸的任何多肽。

本文中，木半乳糖醛酸酶是通過以內(nèi)切方式切割β-木糖取代的半乳糖醛酸主鏈而作用于木半乳糖醛酸聚糖的任何多肽。所述酶也可以已知為木半乳糖醛酸聚糖水解酶。

本文中，α-l-阿拉伯糖呋喃糖苷酶(ec3.2.1.55)是能夠作用于α-l-阿拉伯呋喃糖苷、含有(1,2)和/或(1,3)-和/或(1,5)-鍵的α-l-阿拉伯聚糖、阿拉伯木聚糖和阿拉伯半乳聚糖的任何多肽。所述酶也可以被稱作α-n-阿拉伯糖呋喃糖苷酶，阿拉伯糖呋喃糖苷酶或阿拉伯糖苷酶。

本文中，內(nèi)切阿拉伯聚糖酶(ec3.2.1.99)是能夠催化1,5-阿拉伯聚糖中1,5-α-阿拉伯呋喃糖苷鍵內(nèi)切水解的任何多肽。所述酶也已知為內(nèi)切阿拉伯糖酶，阿拉伯聚糖內(nèi)切-1,5-α-l-阿拉伯糖苷酶，內(nèi)切-1,5-α-l-阿拉伯聚糖酶，內(nèi)切-α-1,5-阿拉伯聚糖酶；內(nèi)切-阿拉伯聚糖酶或1,5-α-l-阿拉伯聚糖1,5-α-l-阿拉伯聚糖水解酶。

本發(fā)明的組合物將一般包含至少一種纖維素酶和/或至少一種半纖維素酶和/或至少一種果膠酶(其中之一是根據(jù)本發(fā)明的多肽)。本發(fā)明的組合物可包含纖維二糖水解酶，內(nèi)切葡聚糖酶和/或β-葡糖苷酶。此類組合物也可以包含一種或多種半纖維素酶和/或一種或多種果膠酶。

另外，本發(fā)明的組合物中可以存在淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、木質(zhì)酶、己糖基轉(zhuǎn)移酶葡糖醛酸糖苷酶或擴(kuò)展蛋白或纖維素誘導(dǎo)蛋白或纖維素整合蛋白或類似蛋白質(zhì)中的一種或多種(例如兩種、三種、四種或所有)(這些也被稱作上文的輔助活性)。

“蛋白酶”包括水解肽鍵的酶(肽酶)，以及水解肽和其它部分(如糖)之間鍵的酶(糖肽酶)。許多肽酶歸類為ec3.4，它們適合在本發(fā)明中使用并且通過引用并入本文。一些特定類型的蛋白酶包括半胱氨酸蛋白酶(包括胃蛋白酶，木瓜蛋白酶)和絲氨酸蛋白酶(包括糜蛋白酶，羧肽酶和金屬內(nèi)切蛋白酶)。

“脂肪酶”包括水解脂質(zhì)、脂肪酸和?；视王?包括磷酸甘油酯)、脂蛋白、二?；视偷鹊鹊拿?。在植物中，脂質(zhì)被用作結(jié)構(gòu)組分，來限制水損失和病原體感染。這些脂質(zhì)包括來自脂肪酸的蠟質(zhì)，以及角質(zhì)和木栓素(suberin)。

“木質(zhì)酶”包括能夠水解或分解木質(zhì)素聚合物結(jié)構(gòu)的酶。能夠分解木質(zhì)素的酶包括木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶、漆酶和阿魏酸酯酶，和在本領(lǐng)域中已知解聚或以其他方式分解木質(zhì)素聚合物的描述的其他酶。還包括在內(nèi)的是能夠水解在半纖維素糖(主要是阿拉伯糖)和木質(zhì)素之間形成的鍵的酶。木質(zhì)酶包括但不限于以下組的酶：木質(zhì)素過氧化物酶(ec1.11.1.14)、錳過氧化物酶(ec1.11.1.13)、漆酶(ec1.10.3.2)和阿魏酸酯酶(ec3.1.1.73)。

“己糖基轉(zhuǎn)移酶”(2.4.1-)包括能夠催化轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)，但是也能夠催化例如纖維素和/或纖維素降解產(chǎn)物的水解反應(yīng)的酶?？梢栽诒景l(fā)明中使用的己糖基轉(zhuǎn)移酶的例子是β-葡聚糖基轉(zhuǎn)移酶。此類酶可以能夠催化(1,3)(1,4)葡聚糖和/或纖維素和/或纖維素降解產(chǎn)物的降解。

“葡糖醛酸糖苷酶”包括催化葡糖醛酸苷(例如β-葡糖醛酸苷)水解得到醇的酶。許多葡糖醛酸糖苷酶已被表征，并可適合在本發(fā)明中使用，例如β-葡糖醛酸糖苷酶(ec3.2.1.31)，透明質(zhì)酸酶葡糖醛酸糖苷酶(ec3.2.1.36)，葡糖醛?；?二硫葡糖胺葡糖醛酸糖苷酶(3.2.1.56)，甘草酸β-葡糖醛酸糖苷酶(3.2.1.128)或α-d-葡糖醛酸糖苷酶(ec3.2.1.139)。

本發(fā)明中使用的組合物可包含擴(kuò)展蛋白或擴(kuò)展蛋白樣蛋白質(zhì)，如膨脹因子(swollenin)(見salheimoetal.,eur.j.biohem.269,4202-4211,2002)或膨脹因子樣蛋白質(zhì)。

擴(kuò)展蛋白涉及植物細(xì)胞生長期間細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的松弛。已經(jīng)提出擴(kuò)展蛋白破壞纖維素和其他細(xì)胞壁多糖之間的氫鍵，但不具有水解活性。認(rèn)為它們通過這種方式允許纖維素纖維的滑動(dòng)和細(xì)胞壁的擴(kuò)大。一種擴(kuò)展蛋白樣蛋白質(zhì)——膨脹因子，含有n端碳水化合物結(jié)合模塊家族1結(jié)構(gòu)域(cbd)和c端擴(kuò)展蛋白樣結(jié)構(gòu)域。就本發(fā)明的目的而言，擴(kuò)展蛋白樣蛋白質(zhì)或膨脹因子樣蛋白質(zhì)可包含此類結(jié)構(gòu)域中的一種或兩種和/或可破壞細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)(如破壞纖維素結(jié)構(gòu))，任選地不生產(chǎn)可檢測(cè)量的還原糖。

本發(fā)明中使用的組合物可以是纖維素誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)，例如cip1或cip2基因或類似基因的多肽產(chǎn)物(見foremanetal.,j.biol.chem.278(34),31988-31997,2003)，纖維素/纖維體(cellulosome)整合蛋白質(zhì)，例如cipa或cipc基因的多肽產(chǎn)物，或支架蛋白或支架蛋白樣蛋白質(zhì)。支架蛋白和纖維素整合蛋白是多功能整合亞基，其可將分解纖維素的亞基組合進(jìn)多酶復(fù)合物中。這通過兩類互補(bǔ)的結(jié)構(gòu)域(即支架蛋白上的內(nèi)聚結(jié)構(gòu)域(cohesiondomain)和每個(gè)酶單元上的錨定結(jié)構(gòu)域(dockerindomain))的相互作用完成。支架蛋白亞基還帶有介導(dǎo)纖維體與其底物結(jié)合的纖維素結(jié)合模塊(cbm)。就本發(fā)明的目的而言，支架蛋白或纖維素整合蛋白可包含此類結(jié)構(gòu)域中的一種或兩種。

本發(fā)明方法中使用的組合物可由上文提到的每種酶的成員、一個(gè)酶種類的若干成員、或這些酶種類或輔助蛋白(即本文提到的本身不具有酶活性，但是幫助木質(zhì)纖維素降解的這些蛋白質(zhì))的任何組合組成。

在本發(fā)明的方法中使用的組合物可以由來自以下來源的酶組成：(1)供應(yīng)商；(2)經(jīng)克隆的表達(dá)酶的基因；(3)復(fù)合培養(yǎng)液(例如由培養(yǎng)基中微生物菌株的生長得到的，其中所述菌株向培養(yǎng)基中分泌蛋白質(zhì)和酶)；(4)如(3)中培養(yǎng)的菌株的細(xì)胞裂解物；和/或(5)表達(dá)酶的植物材料。本發(fā)明組合物中不同的酶可得自不同的來源。

酶可以在微生物、酵母、真菌、細(xì)菌或植物中外源產(chǎn)生，然后分離并加入例如木質(zhì)纖維素原料中?；蛘?，酶可以被生產(chǎn)但不分離，并可將粗制細(xì)胞群發(fā)酵液或植物材料(如玉米稈或麥秸)等等加入例如原料中?；蛘?，可以處理粗制細(xì)胞群或酶生產(chǎn)培養(yǎng)基或植物材料，以預(yù)防進(jìn)一步的微生物生長(例如通過加熱或添加抗微生物劑)，然后添加至原料。這些粗制酶混合物可包含生產(chǎn)酶的生物?；蛘?，酶可以在下述發(fā)酵中生產(chǎn)，所述發(fā)酵使用(預(yù)處理的)原料(例如玉米稈或麥秸)對(duì)生產(chǎn)酶的生物提供營養(yǎng)。通過這種方式，生產(chǎn)酶的植物自身可以發(fā)揮木質(zhì)纖維素原料的作用，并且被添加進(jìn)木質(zhì)纖維素原料中。

在本文所述的用途和方法中，上述組合物的組分可以共同(即本身作為單一組合物)或單獨(dú)或先后提供。

本發(fā)明因此涉及其中使用上述組合物的方法，和所述組合物在工業(yè)工藝中的用途。

木質(zhì)纖維素材料

本文中木質(zhì)纖維素材料包括任何木質(zhì)纖維素材料和/或半纖維素材料。適于用作本發(fā)明原料的木質(zhì)纖維素材料包括下述生物質(zhì)，所述生物質(zhì)例如原生生物質(zhì)(virginbiomass)和/或非原生生物質(zhì)如農(nóng)業(yè)生物質(zhì)，商業(yè)有機(jī)物，建筑和拆除碎片，市政固體廢棄物，廢紙和庭院廢棄物。常見的生物質(zhì)形式包括樹木，灌木叢(shrubs)和草，小麥，麥秸，甘蔗渣，柳枝稷，芒草(miscanthus)，玉米，玉米稈(cornstover)，玉米殼，玉米芯(corncobs)，蕓苔莖，大豆莖，高粱，玉米粒(包括來自玉米粒的纖維)，來自谷物如玉米、小麥和大麥研磨(包括濕磨和干磨)的通常稱作“麩或纖維”的產(chǎn)物和副產(chǎn)物，以及市政固體廢棄物，廢紙和庭院廢棄物。生物質(zhì)也可以是，但不限于草本材料，農(nóng)業(yè)殘余物，林業(yè)殘余物，市政固體廢棄物，廢紙，和紙漿和造紙廠殘余物?！稗r(nóng)業(yè)生物質(zhì)”包括樹枝，灌木(bushes)，藤蔓(canes)，玉米和玉米殼，能量作物，森林，水果，鮮花，谷物，草，草本作物，樹葉，樹皮，針葉，原木，根，樹苗，短期輪種木本作物(short-rotationwoodycrops)，灌木叢，柳枝稷，樹木，蔬菜，水果皮，蔓藤(vines)，甜菜漿，小麥麩皮(wheatmidlings)，燕麥殼，和硬木材或軟木材(不包括帶有有害材料的木材)。另外，農(nóng)業(yè)生物質(zhì)包括由農(nóng)業(yè)加工產(chǎn)生的有機(jī)廢棄物材料，所述農(nóng)業(yè)加工包括農(nóng)業(yè)和林業(yè)活動(dòng)，特定地包括林業(yè)木材廢棄物。農(nóng)業(yè)生物質(zhì)可以是前述任一或其任何組合或混合物。

預(yù)處理

任選地，原料可通過本領(lǐng)域中已知的任何方式用熱、機(jī)械和/或化學(xué)改性或此類方法的任何組合預(yù)處理，以便增強(qiáng)底物對(duì)酶促水解的可接近性和/或水解半纖維素和/或使半纖維素和/或纖維素和/或木質(zhì)素溶解。在一種實(shí)施方式中，通過用蒸汽噴發(fā)、熱水處理或用稀酸或稀堿處理木質(zhì)纖維素進(jìn)行預(yù)處理。

洗滌步驟

任選地，根據(jù)本發(fā)明的工藝包括洗滌步驟。任選的洗滌步驟可被用來去除可能作為發(fā)酵步驟的抑制劑的水可溶化合物。洗滌步驟可以已知的方式進(jìn)行。

酶促水解

根據(jù)本發(fā)明的工藝包括酶促水解步驟。酶促水解包括但不限于液化原料的目的的水解和從原料或發(fā)酵液釋放糖的目的的水解。在該步驟中，任選地預(yù)處理的和任選地洗滌的木質(zhì)纖維素材料開始與根據(jù)本發(fā)明的酶組合物接觸。取決于木質(zhì)纖維素材料和預(yù)處理，不同的反應(yīng)條件例如溫度、酶劑量、水解反應(yīng)時(shí)間和干物質(zhì)濃度可由技術(shù)人員調(diào)節(jié)，以實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素向糖的期望轉(zhuǎn)化。一些指標(biāo)在下文給出。

在本發(fā)明的一個(gè)方面中，水解在50℃或更高，55℃或更高，60℃或更高，65℃或更高，或70℃或更高的溫度下進(jìn)行。水解期間的高溫具有許多優(yōu)勢(shì)，所述優(yōu)勢(shì)包括在酶組合物的最適溫度下工作、(細(xì)菌)污染風(fēng)險(xiǎn)降低、降低的粘性、需要更少量的冷卻水、使用具有更高溫度的冷卻水、酶的再利用和更多的優(yōu)勢(shì)。

在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，添加的酶組合物的量(本文中也稱為酶劑量或酶負(fù)載量)低。在一種實(shí)施方式中，酶量是6mg蛋白/g干物質(zhì)重量或更低，5mg蛋白/g干物質(zhì)或更低，4mg蛋白/g干物質(zhì)或更低，3mg蛋白/g干物質(zhì)或更低，2mg蛋白/g干物質(zhì)或更低或1mg蛋白/g干物質(zhì)或更低(表示為mg蛋白/g干物質(zhì)形式的蛋白)。在一種實(shí)施方式中，酶量是0.5mg酶/g干物質(zhì)重量或更低，0.4mg酶組合物/g干物質(zhì)重量或更低，0.3mg酶/g干物質(zhì)重量或更低，0.25mg酶/g干物質(zhì)重量或更低，0.20mg酶/g干物質(zhì)重量或更低，0.18mg酶/g干物質(zhì)重量或更低，0.15mg酶/g干物質(zhì)重量或更低或0.10mg酶/g干物質(zhì)重量或更低(表示為以mg酶/g干物質(zhì)形式的總纖維素酶)。低酶劑量是可能的，由于酶的活性和穩(wěn)定性，增加水解反應(yīng)時(shí)間是可能的。

在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，水解反應(yīng)時(shí)間是40小時(shí)或更多，50小時(shí)或更多，60小時(shí)或更多，70小時(shí)或更多，80小時(shí)或更多，90小時(shí)或更多，100小時(shí)或更多，120小時(shí)或更多，130小時(shí)或更多。在另一方面中，水解反應(yīng)時(shí)間是40-130小時(shí)，50-120小時(shí)，60-120小時(shí)，60-110小時(shí)，60-100小時(shí)，70-100小時(shí)，70-90小時(shí)或70-80小時(shí)。由于酶組合物的穩(wěn)定性，更長水解反應(yīng)時(shí)間是可能的，這對(duì)應(yīng)更高的糖產(chǎn)率。

水解期間的ph可由技術(shù)人員選擇。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，水解期間的ph可以是3.0-6.4。本發(fā)明的穩(wěn)定酶可具有高至2個(gè)ph單位，高至3個(gè)ph單位，高至5個(gè)ph單位的寬ph范圍。最適ph可位于ph2.0至8.0，3.0-8.0，3.5-7.0，3.5-6.0，3.5-5.0，3.5-4.5，4.0-4.5的界限內(nèi)或大約4.2。

在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，進(jìn)行水解步驟c)直到木質(zhì)纖維素材料中的70％或更多，80％或更多，85％或更多，90％或更多，92％或更多，95％或更多的可利用糖被釋放出。

顯著地，本發(fā)明的工藝可在水解反應(yīng)中使用高水平的(木質(zhì)纖維素材料的)干物質(zhì)進(jìn)行。因而，本發(fā)明可用大約5％或更高，大約8％或更高，大約10％或更高，大約11％或更高，大約12％或更高，大約13％或更高，大約14％或更高，大約15％或更高，大約20％或更高，大約25％或更高，大約30％或更高，大約35％或更高或大約40％或更高的干物質(zhì)含量進(jìn)行。在另外的實(shí)施方式中，在水解步驟c)中的干物質(zhì)含量是14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％(w/dmw)或更多或14-33％?？s寫詞dmw在本文中表示“干物質(zhì)重量”，重量以g(克)表示。

發(fā)酵

根據(jù)本發(fā)明的工藝包含發(fā)酵步驟d)。在另一個(gè)方面中，本發(fā)明因而包括步驟d)發(fā)酵工藝，其中微生物被用于發(fā)酵包含糖(例如葡萄糖、l-阿拉伯糖和/或木糖)的碳源。碳源可包括包含l-阿拉伯糖、木糖或葡萄糖單元的任何碳水化合物寡聚體或多聚體，例如木質(zhì)纖維素、木聚糖、纖維素、淀粉、阿拉伯聚糖等等。就從此類碳水化合物釋放木糖或葡萄糖單元而言，可將適宜糖酶(例如木聚糖酶、葡聚糖酶、淀粉酶等等)添加至發(fā)酵培養(yǎng)基或其可通過經(jīng)改造的宿主細(xì)胞生產(chǎn)。在后者的情況下，經(jīng)改造的宿主細(xì)胞可被遺傳工程改造，以生產(chǎn)并分泌此類糖酶。使用葡萄糖的寡聚體或多聚體來源的其他優(yōu)勢(shì)是，其能在發(fā)酵期間保持低的(較低的)游離葡萄糖濃度，例如通過使用限制速率的糖酶的量來實(shí)現(xiàn)。這反過來會(huì)防止對(duì)需要非葡萄糖的糖(例如木糖)的代謝和運(yùn)送的體系抑制。在優(yōu)選的工藝中，所述經(jīng)改造的的宿主細(xì)胞發(fā)酵l-阿拉伯糖(任選地木糖)和葡萄糖二者，優(yōu)選地同時(shí)發(fā)酵，這種情況下優(yōu)選地使用經(jīng)改造的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞對(duì)葡萄糖抑制不敏感，以防止二次生長。除了l-阿拉伯糖來源，任選地木糖(和葡萄糖)作為碳源之外，發(fā)酵培養(yǎng)基還會(huì)包含對(duì)經(jīng)改造的宿主細(xì)胞生長而言需要的適宜成分。用于微生物(例如酵母或絲狀真菌)生長的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成是本領(lǐng)域中已知的。

在相同條件下發(fā)酵時(shí)間可比在常規(guī)發(fā)酵中更短，其中部分酶促水解在發(fā)酵期間仍必定參與。在一種實(shí)施方式中，就50g/l葡萄糖和來自木質(zhì)纖維素原料的相應(yīng)的其他糖(例如50g/l木糖，35g/l的l-阿拉伯糖和10g/l的半乳糖)的糖組合而言，發(fā)酵時(shí)間是100小時(shí)或更短，90小時(shí)或更短，80小或更短，70小時(shí)或更短，或60小時(shí)或更短。對(duì)于更稀的糖組合，發(fā)酵時(shí)間可相應(yīng)地被減少。

發(fā)酵工藝可以是需氧或厭氧發(fā)酵工藝。厭氧發(fā)酵工藝在本文中被定義為下述發(fā)酵工藝，所述發(fā)酵工藝在沒有氧或基本上沒有氧被消耗的情況下進(jìn)行，優(yōu)選地少于5、2.5或1mmol/l/h、更優(yōu)選地0mmol/l/h(即氧消耗未被檢測(cè)出)的氧被消耗的情況下進(jìn)行，并且其中有機(jī)分子既作為電子供體又作為電子受體。沒有氧時(shí)，在糖酵解和生物質(zhì)形成中產(chǎn)生的nadh不可被氧化磷酸化所氧化。為解決該問題，許多微生物使用丙酮酸鹽或其衍生物之一作為電子和氫受體，因此產(chǎn)生nad⁺。因而，在優(yōu)選的厭氧發(fā)酵工藝中，丙酮酸鹽被用作電子(和氫受體)并被還原為發(fā)酵產(chǎn)物，例如乙醇、乳酸、3-羥基丙酸、丙烯酸、乙酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸、延胡索酸、氨基酸、1,3-丙烷-二醇、乙烯、甘油、丁醇、β-內(nèi)酰胺類抗生素和頭孢菌素。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，發(fā)酵工藝是厭氧的。厭氧工藝是有利的，因?yàn)槠浔刃柩豕に嚫阋耍盒枰^少專門的設(shè)備。而且，預(yù)計(jì)厭氧工藝給出比需氧工藝更高的產(chǎn)率。在需氧條件下，通常生物質(zhì)產(chǎn)率比在厭氧條件下更高。結(jié)果，通常在需氧條件下，期望的產(chǎn)物產(chǎn)率比在厭氧條件下低。

在另一實(shí)施方式中，發(fā)酵工藝在限氧條件下。更優(yōu)選地，發(fā)酵工藝是需氧的并在限氧條件下。限氧發(fā)酵工藝是這樣的工藝，其中氧消耗被氧從氣體至液體的轉(zhuǎn)移所限制。氧限制的程度由進(jìn)入氣流的量和組成以及使用的發(fā)酵設(shè)備的實(shí)際的混合/質(zhì)量轉(zhuǎn)移特性確定。優(yōu)選地，在限氧條件下的工藝中，氧消耗的速率為至少5.5mmol/l，更優(yōu)選地至少6mmol/l和甚至更優(yōu)選地至少7mmol/l。

發(fā)酵工藝優(yōu)選地在就經(jīng)改造的細(xì)胞而言最佳的溫度下運(yùn)行。因而，就大多數(shù)酵母或真菌細(xì)胞而言，發(fā)酵工藝在小于42℃，優(yōu)選地小于38℃下的溫度下進(jìn)行。就酵母或絲狀真菌宿主細(xì)胞而言，發(fā)酵工藝優(yōu)選地在低于35、33、30或28℃的溫度下并在高于20、22或25℃的溫度下進(jìn)行。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，在步驟d)中，用能夠發(fā)酵至少一種c5糖的微生物進(jìn)行發(fā)酵。在一種實(shí)施方式中，工藝是用于乙醇生產(chǎn)的工藝，其中，工藝包括步驟d)，步驟d)包括用能發(fā)酵至少一種c5糖的微生物發(fā)酵含糖培養(yǎng)基，其中宿主細(xì)胞能將葡萄糖、l-阿拉伯糖和木糖發(fā)酵為乙醇。在一種實(shí)施方式中，能發(fā)酵至少一種c5糖的微生物是酵母。在一種實(shí)施方式中，酵母屬于saccharomyces屬，優(yōu)選地是saccharomycescerevisiae種，其中已制得下述遺傳改造：

a)由在強(qiáng)啟動(dòng)子控制下的ppp-基因tal1、tkl1、rpe1和rki1組成的簇，

b)由都在組成型啟動(dòng)子控制下的xyla-基因和xks1-基因組成的簇，

c)由基因araa、arab和arad組成的簇和/或xyla-基因和xks1-基因的簇；

d)缺失醛糖還原酶基因；

和產(chǎn)生的經(jīng)改造的微生物的適應(yīng)性進(jìn)化。此類微生物及其制備被詳細(xì)地描述在wo2008/041840和于2010年4月21日提交的歐洲專利申請(qǐng)ep10160622.6中。在一個(gè)實(shí)施方式中，用于生產(chǎn)乙醇的發(fā)酵工藝是厭氧的。厭氧已在本文上文定義過。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，用于生產(chǎn)乙醇的發(fā)酵工藝是需氧的。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，用于生產(chǎn)乙醇的發(fā)酵工藝在限氧條件下，更優(yōu)選地所述工藝是需氧的并在限氧條件下。限氧條件已在本文上文定義過。

在此類工藝中，乙醇體積生產(chǎn)力優(yōu)選地至少0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、5.0或10.0g乙醇/升/小時(shí)。在工藝中在l-阿拉伯糖和任選地木糖和/或葡萄糖上的乙醇產(chǎn)率優(yōu)選地至少20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、95或98％。乙醇產(chǎn)率在本文中被定義為理論最大產(chǎn)率的百分比，對(duì)于葡萄糖、l-阿拉伯糖和任選地木糖，乙醇理論最大產(chǎn)率為0.51g乙醇/g葡萄糖或木糖。

在一個(gè)方面中，導(dǎo)致乙醇生產(chǎn)的發(fā)酵工藝具有與已知乙醇發(fā)酵工藝相比的若干優(yōu)勢(shì)：

-厭氧工藝是可能的；

-限氧條件也是可能的；

-可獲得較高的乙醇產(chǎn)率和乙醇生產(chǎn)速率；

-使用的菌株可能夠使用l-阿拉伯糖和任選地木糖。

備選地，針對(duì)上述的發(fā)酵工藝，可使用至少兩種有區(qū)別的細(xì)胞，這表示該工藝是共發(fā)酵工藝。如上所述的發(fā)酵工藝的所有優(yōu)選實(shí)施方式也是該共發(fā)酵工藝的優(yōu)選實(shí)施方式：發(fā)酵產(chǎn)物類別、l-阿拉伯糖來源和木糖來源類別、發(fā)酵條件(需氧或厭氧條件、限氧條件、工藝進(jìn)行的溫度、乙醇生產(chǎn)力、乙醇產(chǎn)率)。

可進(jìn)行發(fā)酵工藝而無任何調(diào)整發(fā)酵期間ph的需要。也就是說，所述工藝是不用添加任何酸或堿而可進(jìn)行的工藝。不管怎樣，這排除了可添加酸的預(yù)處理步驟。要點(diǎn)是本發(fā)明的組合物能在低ph下起作用并因而不需要為了糖化可發(fā)生而調(diào)整酸預(yù)處理原料的酸的ph。因此，本發(fā)明的方法是僅使用有機(jī)產(chǎn)物不需要無機(jī)化學(xué)輸入物的零廢物方法。

總反應(yīng)時(shí)間

根據(jù)本發(fā)明，可減少總反應(yīng)時(shí)間(即水解步驟c)和發(fā)酵步驟d)的合起來的反應(yīng)時(shí)間)。在一種實(shí)施方式中，在90％葡萄糖產(chǎn)率下總反應(yīng)時(shí)間為150小時(shí)或更少，140小時(shí)或更少，130小時(shí)或更少，120小時(shí)或更少，110小時(shí)或更少，100小時(shí)或更少，90小時(shí)或更少，80小時(shí)或更少，75小時(shí)或更少，或大約72小時(shí)。相應(yīng)地，可在較低的葡萄糖產(chǎn)率下達(dá)到較少反應(yīng)時(shí)間。這取決于其中工藝在shf或ssf模式中進(jìn)行的模式。

發(fā)酵產(chǎn)物

可根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的發(fā)酵產(chǎn)物包括氨基酸、維生素、藥物、動(dòng)物飼料補(bǔ)充物、特種化學(xué)品、化學(xué)原料、塑料、溶劑、燃料或其他有機(jī)聚合物、乳酸和乙醇包括燃料乙醇(術(shù)語“乙醇”被理解為包括乙醇(ethylalcohol)或乙醇和水的混合物)。

可通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的具體的價(jià)值增加產(chǎn)物包括但不限于，生物燃料(包括乙醇和丁醇)；乳酸；3-羥基-丙酸；丙烯酸；乙酸；1,3-丙烷-二醇；乙烯；甘油；塑料；特種化學(xué)品；有機(jī)酸，包括檸檬酸、琥珀酸和馬來酸；溶劑；動(dòng)物飼料補(bǔ)充物；藥物例如β-內(nèi)酰胺類抗生素或頭孢菌素；維生素；氨基酸，例如賴氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、蘇氨酸和天冬氨酸；酶例如蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶、脂肪酶、裂解酶、氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶或木聚糖酶；化學(xué)原料；或動(dòng)物飼料補(bǔ)充物。

發(fā)酵產(chǎn)物分離

根據(jù)本發(fā)明的工藝任選地包括回收發(fā)酵產(chǎn)物。發(fā)酵產(chǎn)物可以任何已知的方式從發(fā)酵液中分離出。對(duì)于每種發(fā)酵產(chǎn)物，技術(shù)人員因此能選擇合適的分離技術(shù)。例如，可以常規(guī)方式通過蒸餾(例如蒸汽蒸餾/真空蒸餾)將乙醇從酵母發(fā)酵液中分離出。

以下將更詳細(xì)地描述本發(fā)明的某些實(shí)施方式，但絕不是限制本發(fā)明的范圍。

在最佳溫度條件下使用熱穩(wěn)定酶

在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及在水解和發(fā)酵分離工藝(shf)和ssf工藝中使用熱穩(wěn)定酶(talaromyces的纖維素分解酶)，用于在乙醇生產(chǎn)(但不限于乙醇生產(chǎn))中從預(yù)處理的木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)還原糖。應(yīng)用于預(yù)處理的木質(zhì)纖維素原料的talaromyces的纖維素分解酶顯示了在50-70℃范圍內(nèi)的溫度下的最大轉(zhuǎn)化速率。酶在這些環(huán)境下保留活性達(dá)14天及更久，而沒有完全停止活性。

通過使用最佳溫度條件，最大量的還原糖能在可能的最短的水解時(shí)間內(nèi)從原料(完全水解)釋放出。以這種方式，使用0.175ml(6mg蛋白)/g原料干物質(zhì)的酶劑量，在shf工藝中，在不到5天(120h，見圖1)實(shí)現(xiàn)了以葡萄糖形式的纖維素的100％轉(zhuǎn)化。在ssf條件下在33℃下，在木質(zhì)纖維素原料中的纖維素的總轉(zhuǎn)化將持續(xù)近168h[2]并且因此這些嗜溫條件決定從原料中最大乙醇生產(chǎn)所需要的工藝時(shí)間。

在熱穩(wěn)定纖維素分解酶(例如來自talaromyces)被用于有嗜熱的生產(chǎn)乙醇的微生物的ssf工藝的情況下，發(fā)酵時(shí)間會(huì)更短，因?yàn)閠alaromyces的纖維素分解酶在更高的溫度下比在嗜溫溫度下更快地釋放還原糖。

在ssf操作中，產(chǎn)物濃度(g/l)取決于生產(chǎn)的葡萄糖量，但因?yàn)樵趕sf中糖被轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物，所以這是不可見的，并且產(chǎn)物濃度可以通過與理論最大產(chǎn)率(以gr產(chǎn)物/克葡萄糖計(jì)的ypsmax)相乘而與基礎(chǔ)的葡萄糖濃度相關(guān)。

發(fā)酵產(chǎn)物的理論最大產(chǎn)率(以gr產(chǎn)物/克葡萄糖計(jì)的ypsmax)可得自生物化學(xué)教科書。對(duì)乙醇而言，1摩爾葡萄糖(180gr)根據(jù)酵母中正常的糖酵解發(fā)酵通路產(chǎn)生2摩爾乙醇(＝2x46＝92gr乙醇)。因此，基于葡萄糖的乙醇的理論最大產(chǎn)率為92/180＝0.511gr乙醇/gr葡萄糖。

對(duì)丁醇(mw74gr/摩爾)或異丁醇而言，理論最大產(chǎn)率是每摩爾葡萄糖1摩爾丁醇。因此，(異)丁醇的ypsmax＝74/180＝0.411gr(異)丁醇/gr葡萄糖。

對(duì)乳酸而言，純?nèi)樗岚l(fā)酵(homolacticfermentation)的發(fā)酵產(chǎn)率是每摩爾葡萄糖2摩爾乳酸(mw＝90gr/摩爾)。根據(jù)所述化學(xué)計(jì)量法，ypsmax＝1gr乳酸/gr葡萄糖。

對(duì)其他發(fā)酵產(chǎn)物而言，可以進(jìn)行類似的計(jì)算。

應(yīng)用talaromyces的纖維素分解酶實(shí)現(xiàn)的成本降低是總工藝時(shí)間減少的結(jié)果。

用熱穩(wěn)定酶減少工藝時(shí)間

鑒于穩(wěn)定酶允許延長水解時(shí)間而沒有顯著活性損失，可應(yīng)用例如72小時(shí)的水解時(shí)間，導(dǎo)致僅用0.175ml酶/g原料干物質(zhì)(見圖1，點(diǎn)a)獲得還原糖的理論最大值的近似90％轉(zhuǎn)化。因此獲得的糊狀物可被用作為連續(xù)發(fā)酵步驟中的底物，用于例如但不限于乙醇生產(chǎn)。仍未被轉(zhuǎn)化為還原糖的剩余的近似10％的纖維素會(huì)在發(fā)酵期間(ssf)被轉(zhuǎn)化為還原糖并被直接轉(zhuǎn)化為乙醇。鑒于此類發(fā)酵用在發(fā)酵起始下可利用的糖的最大量的90％開始，還原糖的釋放速率不會(huì)如其在常規(guī)ssf期間那樣決定生產(chǎn)乙醇的微生物的生長速率。以這種方式，乙醇生產(chǎn)可在更高的生產(chǎn)速率下發(fā)生，允許在不到48h，不到45h，不到40h，不到35h，不到30h，不到25h，例如24h中完成乙醇生產(chǎn)?？偣に嚂r(shí)間可因此被從7天減至不到5天，不到4天，不到3天，不到2天(48小時(shí))。由于更短的發(fā)酵時(shí)間，使用了用于維持生產(chǎn)乙醇的微生物的更少底物。較之常規(guī)的預(yù)糖化和ssf，延長水解時(shí)間并縮短發(fā)酵時(shí)間的該方法的總產(chǎn)率可導(dǎo)致基于底物的5-15％更高的乙醇產(chǎn)率。

應(yīng)用穩(wěn)定的纖維素分解酶(如talaromyces的那些)實(shí)現(xiàn)成本降低，這起因于總工藝時(shí)間減少。

使用talaromyces酶，用延長水解時(shí)間補(bǔ)償減少的酶劑量

由于穩(wěn)定酶的高穩(wěn)定性，活性不會(huì)及時(shí)停止，而較少的還原糖在水解期間被釋出。通過延長水解時(shí)間來減少酶劑量并來延長酶的使用以獲得釋放的還原糖的類似水平是可能的。例如，0.175ml酶/g原料干物質(zhì)導(dǎo)致在72小時(shí)內(nèi)從預(yù)處理的原料中釋放還原糖的理論最大值的近似90％(圖2中的點(diǎn)a)。當(dāng)使用0.075ml酶/g原料干物質(zhì)時(shí)，在120h內(nèi)實(shí)現(xiàn)理論最大值的近似90％轉(zhuǎn)化(圖2中的點(diǎn)b)。結(jié)果顯示，由于酶活性的穩(wěn)定性，減少的酶劑量可通過延長水解時(shí)間補(bǔ)償，以獲得相同量的還原糖。對(duì)在高于10％干物質(zhì)含量下的預(yù)處理原料水解的相同保持顯示了在15％干物質(zhì)原料下延長水解時(shí)間的補(bǔ)償作用。

通過使用穩(wěn)定的(例如talaromyces的)纖維素分解酶實(shí)現(xiàn)成本降低，這起因于需要較少的酶劑量，導(dǎo)致相似的水解轉(zhuǎn)化產(chǎn)率。

用穩(wěn)定酶優(yōu)化發(fā)酵工藝

如果水解導(dǎo)致還原糖水平在來自預(yù)處理原料的還原糖的理論最大值下或接近來自預(yù)處理原料的還原糖的理論最大值，還原糖溶液可被調(diào)整并被處理，目的在于獲得用于發(fā)酵步驟的最佳底物溶液組合。該調(diào)整和處理包括但不限于，濃縮、純化、ph調(diào)整、額外營養(yǎng)素的補(bǔ)充等等?？赏ㄟ^將還原糖溶液轉(zhuǎn)移至發(fā)酵容器或通過將必要營養(yǎng)素和接種物添加至含有還原糖溶液的容器開始發(fā)酵。

另外，針對(duì)最大發(fā)酵效率，可優(yōu)化將還原糖溶液添加至發(fā)酵容器的模式，在分批、補(bǔ)料分批和連續(xù)模式中在例如限制碳的條件下添加。

由于酶的穩(wěn)定性，活性會(huì)在發(fā)酵期保留存在并會(huì)繼續(xù)將剩余的纖維素和部分經(jīng)水解的纖維素轉(zhuǎn)化為還原糖。以這種方式，穩(wěn)定酶允許發(fā)酵步驟優(yōu)化而沒有總轉(zhuǎn)化產(chǎn)率損失。

應(yīng)用穩(wěn)定的纖維素分解酶(如talaromyces的那些)實(shí)現(xiàn)成本降低，這起因于使工藝效率最大化。

用穩(wěn)定酶降低污染風(fēng)險(xiǎn)

在將木質(zhì)纖維素材料轉(zhuǎn)化為乙醇的常見工藝中，工藝步驟優(yōu)選地在感染性條件下進(jìn)行，以減少操作成本。污染微生物的污染和生長可因而發(fā)生并導(dǎo)致不期望的副作用，此類乳酸、甲酸和乙酸生產(chǎn)，基于底物的乙醇的產(chǎn)率損失，毒素和細(xì)胞外多糖的產(chǎn)生可顯著影響生產(chǎn)成本。高工藝溫度和/或短工藝時(shí)間會(huì)限制水解和發(fā)酵期間的污染風(fēng)險(xiǎn)。熱穩(wěn)定酶(比如talaromyces的那些)能在高于60℃的溫度下水解木質(zhì)纖維素原料。在這些溫度下，污染微生物引起不期望副作用的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)減小至幾乎為零。

在發(fā)酵步驟期間，其中乙醇被生產(chǎn)，溫度典型地在30-37℃之間并且由于產(chǎn)量損失而優(yōu)選地不會(huì)被升高。通過應(yīng)用盡可能短的發(fā)酵工藝時(shí)間，污染的風(fēng)險(xiǎn)和作用和/或污染物的生長會(huì)盡可能大的被減小。使用穩(wěn)定酶(比如talaromyces的那些)，可應(yīng)用盡可能短的發(fā)酵時(shí)間(見說明書上文)，并且因而污染風(fēng)險(xiǎn)和/或污染物生長可被盡可能大的降低。應(yīng)用talaromyces的熱穩(wěn)定纖維素分解酶實(shí)現(xiàn)成本降低，這起因于降低了由于污染導(dǎo)致工藝失敗的風(fēng)險(xiǎn)。

穩(wěn)定酶減少冷卻成本并增加乙醇植物(ethanolplants)的生產(chǎn)力

熱預(yù)處理后的第一個(gè)步驟是將預(yù)處理的原料冷卻至酶為最佳活性的溫度。大規(guī)模時(shí)，這典型地通過添加(冷卻)水完成，這除了降低溫度外，會(huì)減少干物質(zhì)含量。通過使用熱穩(wěn)定酶(比如talaromyces的那些)，可通過下述事實(shí)實(shí)現(xiàn)成本降低：i)更少需要對(duì)預(yù)處理原料冷卻，因?yàn)樵谒馄陂g允許更高溫度，和ii)添加更少的水，這會(huì)增加水解和發(fā)酵期間的干物質(zhì)含量并因而增加乙醇植物的乙醇生產(chǎn)能力(每體積每時(shí)間單位產(chǎn)生的量)。同樣，通過使用根據(jù)本發(fā)明的熱穩(wěn)定酶(比如talaromyces的那些)，成本降低也可通過使用比用在有非熱穩(wěn)定酶的工藝中的水具有更高溫度的冷卻水實(shí)現(xiàn)。

利用穩(wěn)定酶水解后回收酶

水解結(jié)束時(shí)，酶活性看起來是低的，因?yàn)橐坏缀跛欣w維素被轉(zhuǎn)化，幾乎沒有還原糖被釋放出。但是，存在的酶促活性的量僅減少少許，假設(shè)這主要是由于酶對(duì)底物的吸收。通過在水解后應(yīng)用固液分離，例如離心、過濾、沉淀等等，溶液中的酶活性的60％或更多，例如70％可被回收并被重新使用用于在下一水解期間水解新的預(yù)處理的木質(zhì)纖維素原料(見圖3)。

而且，固液分離后，溶液中的酶可從含有還原糖和來自酶促作用的其他水解產(chǎn)物的溶液中分離出。可借助或不借助首先將酶吸附到任何類型的載體，通過但不限于(超或微)過濾、離心、沉淀、沉降進(jìn)行該分離。

例如，用0.175ml/g原料干物質(zhì)的酶量對(duì)預(yù)處理的原料水解20h后，還原糖的理論最大量的50％被釋出，并且相同水解72h后，還原糖的理論最大量的90％被釋出。通過離心和超濾，在滲余物中回收60-70％的酶活性，而濾液含有超過80％的釋出的還原糖。通過再利用滲余物或被進(jìn)一步純化和/或濃縮后的滲余物，在下一水解步驟期間的酶劑量可被減少60-70％。通過使用穩(wěn)定纖維素分解酶(例如talaromyces的那些)實(shí)現(xiàn)成本降低，這起因于需要更少的酶劑量。

利用穩(wěn)定酶的水解后回收酶與酶生產(chǎn)和回收酵母細(xì)胞

包括如上文所述的水解后回收的酶的工藝可與發(fā)酵后回收生產(chǎn)乙醇的微生物的工藝組合，并與在酶生產(chǎn)發(fā)酵中使用含還原糖的濾液作為底物(純化的和/或濃縮的或稀釋的)和使用含還原糖的濾液作為底物用于培養(yǎng)生產(chǎn)乙醇的微生物組合。

利用穩(wěn)定酶的真空蒸餾后回收酶

酶(比如來自talaromyces的那些)的熱穩(wěn)定性導(dǎo)致在酒糟水中的水解、發(fā)酵和真空蒸餾后剩余的纖維素分解活性。酶的總活性在三個(gè)連續(xù)的工藝步驟期間降低10-15個(gè)底物單位(substrateunits)/g干物質(zhì)原料，這不依賴于初始酶劑量(見圖5)。真空蒸餾后獲得的酒糟水可因而被再利用作為酶來源，用于將預(yù)處理麥秸轉(zhuǎn)化為乙醇的新開始的水解-發(fā)酵-蒸餾工藝循環(huán)。酒糟水可被以濃縮形式或(未)稀釋形式使用和/或被純化并有或沒有額外的酶補(bǔ)充物。

用于纖維素材料、玉米粗粉(corngrid)和乳糖的水解的酒糟水的再利用被描述用于多級(jí)ssf反應(yīng)器[2]，目標(biāo)在于揮發(fā)性發(fā)酵產(chǎn)物的連續(xù)生產(chǎn)和分離。在該系統(tǒng)中，氣-液接觸柱被用來從糊狀物中連續(xù)分離乙醇。但是，該復(fù)雜系統(tǒng)需要大量酶以實(shí)現(xiàn)從木質(zhì)纖維素原料足夠快地釋放還原糖，因?yàn)楣に嚄l件對(duì)使用的酶而言是次優(yōu)的。通過使用熱穩(wěn)定纖維素分解酶(比如talaromyces的那些)實(shí)現(xiàn)成本降低，這起因于再利用酶活性的能力。

利用熱穩(wěn)定酶的真空蒸餾后回收酶與酶補(bǔ)充的組合

在最佳工藝中，酶在新工藝循環(huán)中再利用之前，補(bǔ)充到酒糟水中的酶量等于在先前的工藝循環(huán)的三個(gè)連續(xù)工藝步驟期間損失的活性量。以這種方式，避免超劑量的酶，并因此獲得酶的最有效使用。

而且，通過在第一個(gè)工藝循環(huán)中提供高酶劑量并補(bǔ)充等于在隨后的工藝循環(huán)中的三個(gè)連續(xù)工藝步驟期間損失的活性量，可在每個(gè)工藝循環(huán)中獲得最高可能的水解速率，導(dǎo)致少于48h的短的水解時(shí)間和酶的最有效使用。

在混合系統(tǒng)中使用穩(wěn)定酶

通過在水解期間應(yīng)用混合，酶開始更經(jīng)常地與底物接觸，這導(dǎo)致催化活性更有效使用。這會(huì)導(dǎo)致酶劑量更低并因而導(dǎo)致成本更低，除非混合對(duì)酶具有負(fù)面作用。穩(wěn)定酶(比如得自talaromyces的熱穩(wěn)定酶)，是穩(wěn)健的并可抵抗(局部)高剪切和高溫環(huán)境，所述高剪切和高溫環(huán)境是漿體充分混合期間的情況。在混合物系統(tǒng)中使用穩(wěn)定酶因而是有益的并會(huì)導(dǎo)致劑量減少并因此導(dǎo)致成本降低。

本發(fā)明通過下述實(shí)施例進(jìn)一步描述，其不應(yīng)被解釋為限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例

實(shí)施例1

在升溫下通過使用保留活性超過30小時(shí)的酶組合物來減少工藝時(shí)間

在其中水解被延長至72小時(shí)的工藝和其中水解時(shí)間被限制至20小時(shí)的工藝之間做比較，以表明在延長的水解中使用保留活性的酶組合物的益處。

材料和方法

水解和發(fā)酵方法被描述在專利申請(qǐng)wo2010018105(pct/ep2009/060098)中。預(yù)處理麥秸被用作原料并在70℃的自來水中洗滌直到ph高于3，優(yōu)選地在6.0和6.5之間。制備經(jīng)洗滌的預(yù)處理原料的10％w/w漿體并在56℃下預(yù)孵育。酶組合物以0.20g酶組合物/g原料干物質(zhì)的濃度添加?；旌衔锉环譃閮蓚€(gè)相等部分a和b并在56℃下在孵育器中孵育同時(shí)平穩(wěn)地?fù)u動(dòng)。在該水解期間，每日取樣以測(cè)定從纖維素釋放的存在于漿體中的葡萄糖量。部分a表示其中使用20小時(shí)水解時(shí)間的工藝；部分b表示其中在延長的72小時(shí)水解中使用保留活性的工藝。20小時(shí)后，從孵育器中取出部分a并冷卻至33℃。根據(jù)wo2010018105(pct/ep2009/060098)，通過添加酵母細(xì)胞和鹽并在33℃下孵育另外6天來進(jìn)行發(fā)酵。部分a的工藝時(shí)間由此等于約7天(20小時(shí)水解和6天發(fā)酵)。

72小時(shí)后，從孵育器中取出部分b并冷卻至33℃。以如部分a的相同的方式在33℃下進(jìn)行發(fā)酵，但在48小時(shí)后停止。部分b的工藝時(shí)間由此等于約5天(3天水解和2天發(fā)酵)。

結(jié)果和討論

發(fā)酵期間，釋放的糖被轉(zhuǎn)化為酵母細(xì)胞、co2和乙醇。一旦酵母細(xì)胞生產(chǎn)停止，產(chǎn)生的乙醇量與產(chǎn)生的二氧化碳量成比例。鑒于二氧化碳可在線測(cè)量，其產(chǎn)量反映了產(chǎn)生的乙醇的量。表1給出了在部分a和b中釋放的葡萄糖的量、產(chǎn)生的二氧化碳的量和乙醇的最終產(chǎn)率。

表1：部分a和b的葡萄糖、二氧化碳和乙醇分析的結(jié)果

結(jié)果顯示，20小時(shí)水解期隨后6天發(fā)酵期產(chǎn)生了與72小時(shí)水解期隨后48小時(shí)發(fā)酵的相同量的乙醇。因而，用5天工藝時(shí)間，實(shí)現(xiàn)了如用7天工藝時(shí)間的類似乙醇生產(chǎn)水平。

這些的原因是在部分a中的20小時(shí)水解期間釋放了少于理論最大量的60％的糖。盡管由于溫度較低處于欠佳條件下，剩余的量在發(fā)酵期間被釋放出。

部分b中，酶組合物在更佳條件下在72小時(shí)水解期期間保留活性。該水解期間，釋放了葡萄糖的理論最大量的95％，而剩余的5％在48小時(shí)發(fā)酵期期間被釋放出。由此表明，保留的酶組合物的活性可用來縮短工藝時(shí)間并因而降低操作成本。

實(shí)施例2

在升溫下，用保留活性超過30小時(shí)的酶組合物，通過增長工藝時(shí)間來減少酶劑量

在另一實(shí)施方式中，通過延長水解，保留酶組合物活性的特性可被用來補(bǔ)償?shù)偷拿竸┝俊?/p>

材料和方法

使用了如在實(shí)施例1中提及的水解和發(fā)酵方法。

制備經(jīng)洗滌的預(yù)處理原料的10％w/w漿體并在56℃下預(yù)孵育。漿體被分為兩個(gè)相等部分a和b。酶組合物被以0.20g酶組合物/g原料干物質(zhì)的濃度添加至部分a，并以0.09g酶組合物/g原料干物質(zhì)的濃度被添加至部分b。部分a和b在56℃下在孵育器中孵育220小時(shí)同時(shí)平穩(wěn)地?fù)u動(dòng)。在該水解期間，每日取樣以測(cè)定從纖維素釋放的存在于漿體中的葡萄糖量。將測(cè)量的葡萄糖對(duì)水解時(shí)間繪圖(見圖5)。

在單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，用0.20g酶組合物/g原料干物質(zhì)的部分a以及用0.09g酶組合物/g原料干物質(zhì)的部分b在56℃下孵育。72小時(shí)(部分a)和120小時(shí)(部分b)后，從孵育器中取出兩個(gè)部分并冷卻至33℃。根據(jù)wo2010018105(pct/ep2009/060098)，通過添加酵母細(xì)胞和鹽并在33℃下孵育另外48小時(shí)來進(jìn)行發(fā)酵。

結(jié)果和討論

圖6顯示在0.20g酶組合物/g原料干物質(zhì)重量和0.09g酶組合物/g原料干物質(zhì)重量的劑量下，從在酸預(yù)處理的原料的10％w/w干物質(zhì)懸浮液中的纖維素釋放葡萄糖。其顯示，當(dāng)酶劑量減少時(shí)，若水解時(shí)間延長可實(shí)現(xiàn)相似水平的葡萄糖。令人吃驚地，盡管酶量被減少多于一半，需要延長60％的水解時(shí)間以對(duì)減少的酶量補(bǔ)償。當(dāng)使用0.20g酶組合物/g原料干物質(zhì)重量的劑量時(shí)，在72小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)52g/l水平，而當(dāng)使用0.09g酶組合物/g原料干物質(zhì)重量時(shí)，在120小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)相同水平。

在單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中，兩部分在72小時(shí)(部分a)和120小時(shí)(部分b，見表2)后被發(fā)酵。但就部分b而言水解時(shí)間長60％，發(fā)酵后獲得相似的乙醇水平。這樣，表明保留的酶組合物活性可被用來減少酶劑量并因而相應(yīng)地減少操作成本。

表2：部分a和b的水解、發(fā)酵和比較結(jié)果

實(shí)施例3

有保留活性的酶組合物的使用允許水解后再利用活性

進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，來證明水解后原料酶漿體的液體部分用作下一工藝循環(huán)中水解的活性來源。

材料和方法

使用了如在實(shí)施例1中提及的水解方法。

制備預(yù)處理原料的10％w/w漿體并在60℃下預(yù)孵育。酶組合物被以0.20g酶組合物/g原料干物質(zhì)的濃度添加并在56℃下在孵育器中孵育120小時(shí)同時(shí)平穩(wěn)地?fù)u動(dòng)。然后從孵育器中取出漿體并在4500g下離心。小團(tuán)粒被洗滌一次，離心并且洗滌的上清液與第一次固液分離的上清液組合。使用z200過濾器(pall的大約0.2um厚的濾紙)過濾組合的上清液并在10℃下使用10kdpes的螺旋卷式超濾單元濃縮組合的上清液。因此獲得的濃縮物被用做使用在如上述條件下預(yù)處理的新原料的第二次水解中的酶來源。針對(duì)葡萄糖和酶活性分析所有的工藝液流。

結(jié)果和討論

對(duì)液流的分析表明，通過使用固液分離，隨后通過過濾和超濾，葡萄糖可與酶分開。如圖4所示的，水解后uf濃縮物的酶活性保留在初始活性的70％水平上。這表示，使用有保留活性的酶組合物并用本文描述的回收步驟，酶可被再利用，用于在連續(xù)工藝循環(huán)中對(duì)原料水解。大約86％的纖維素被回收并可在發(fā)酵中用作清潔工藝液流。

通過在水解后回收酶活性，使得允許再利用該酶活性并因而削減關(guān)于酶的成本。而且，因?yàn)樵诎l(fā)酵和蒸餾期間沒有固體，含有葡萄糖的清潔工藝液流會(huì)導(dǎo)致較低的維護(hù)和能源成本。

實(shí)施例4

具有保留活性的酶組合物的使用允許在蒸餾后再利用活性

進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，來表明用具有保留活性的酶組合物水解、發(fā)酵和蒸餾后獲得的酒糟水用做水解的活性來源。

材料和方法

使用了如在實(shí)施例1中提及的水解和發(fā)酵方法。

制備經(jīng)洗滌的預(yù)處理原料的10％w/w漿體并在56℃下預(yù)孵育。酶組合物被以0.20g酶組合物/g原料干物質(zhì)的濃度添加并在56℃下在孵育器中孵育20小時(shí)同時(shí)平穩(wěn)地?fù)u動(dòng)。然后從孵育器中取出漿體并冷卻至33℃。根據(jù)pct/ep2009/060098，通過添加酵母細(xì)胞和鹽并在33℃下孵育另外148小時(shí)來進(jìn)行發(fā)酵。

在100mbar和60±1℃下，使用真空蒸餾，蒸餾漿體20分鐘直到所有乙醇被去除。含有不可溶殘留物、酵母細(xì)胞和酶的漿體被離心，以去除不可溶殘留物和酵母細(xì)胞；并收集上清液。上清液還被稱為酒糟水。

將預(yù)處理的原料以10％干物質(zhì)重量的濃度添加至酒糟水。因此獲得的漿體被分為若干相等部分，每一部分被添加0g酶/g原料干物質(zhì)至0.58g酶/g原料干物質(zhì)的范圍內(nèi)的酶量。然后在56℃下孵育漿體并釋放葡萄糖量。

結(jié)果和討論

為在高酶活性和低酶活性之間區(qū)分，直到所有纖維素被水解前，水解應(yīng)持續(xù)。因而，這里使用了20小時(shí)的水解時(shí)間。在這些20小時(shí)內(nèi)釋放的葡萄糖的量取決于在水解期間存在的酶量。最大葡萄糖量是如在圖6中所示的水平并且這里被設(shè)為100％。

如可在圖7中看出，沒有添加酶的酒糟水含有水解活性，這起因于在先前工藝循環(huán)中使用具有保留活性的酶組合物。因而，較之懸浮在水中的酶組合物，使用懸浮在酒糟水中的酶組合物增強(qiáng)了葡萄糖釋放。這種增強(qiáng)在更低的酶劑量下是更顯著，這可通過下述事實(shí)解釋：也如在圖7中所示的，隨著酶活性增加，葡萄糖釋放速率早期及時(shí)增加。高酶劑量曲線比低酶劑量曲線更早地彎曲。

通過在水解中再利用酒糟水，酶劑量可被減少并且因而可獲得成本降低。

實(shí)施例5

木質(zhì)纖維素材料的酶促水解和用轉(zhuǎn)化c5的酵母發(fā)酵

水解

通過使用實(shí)驗(yàn)性廣譜纖維素酶制備物，在60℃下，酶促水解玉米稈和麥秸的稀酸預(yù)處理的樣品3天(72小時(shí))。水解開始時(shí)的ph為5.0。水解開始時(shí)的干物質(zhì)含量為10％w/w。

除了水解溫度為50℃并且水解開始時(shí)干物質(zhì)含量為13.8％之外，預(yù)處理的玉米纖維樣品的水解條件基本上相同。

水解(72小時(shí))后，允許樣品冷卻至室溫。使用10％naoh將ph調(diào)至5.5。隨后，添加1毫升200克/升的(nh4)2s04和1毫升100克/升的kh2p04。

發(fā)酵

然后，以相當(dāng)于每千克水解產(chǎn)物1克酵母的酵母干物質(zhì)含量添加酵母樣品。使用afm(乙醇發(fā)酵監(jiān)測(cè)器：halotecinstrumentsbv,veenendaal,thenetherlands)及時(shí)監(jiān)視co2發(fā)展。在33℃下至少一式三份進(jìn)行實(shí)驗(yàn)72小時(shí)。在固定間隔下對(duì)這些中的一份取樣，以能夠分析乙醇形成和剩余的糖濃度。這些數(shù)據(jù)被用來計(jì)算發(fā)酵產(chǎn)率。其他兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的發(fā)酵液不被取樣。相反，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，在45％蒸汽下使用buchik-355蒸餾裝置，發(fā)酵液被蒸餾15分鐘。使用antonpaardma5000密度計(jì)(antonpaarbeneluxbvba,dongen，荷蘭)測(cè)定產(chǎn)生的乙醇。

用于發(fā)酵的菌株是bie252，其制備被描述在于2010年4月21日提交的歐洲專利申請(qǐng)ep10160622.6中。該菌株是酵母菌屬釀酒酵母(saccharomycescerevisae)菌株，其已被遺傳工程改造，以允許代謝c5糖，即木糖和阿拉伯糖。

bie252在含有補(bǔ)充有2％葡萄糖的yep培養(yǎng)基的搖瓶中過夜培養(yǎng)。通過離心收獲細(xì)胞，以50克干物質(zhì)/升的濃度再懸浮。

測(cè)試的原料由多批次的玉米纖維、玉米稈和麥秸組成。如材料和方法部分描述的進(jìn)行水解和發(fā)酵。

結(jié)果在圖17(玉米纖維)、18(玉米稈)和19(麥秸)中列出。在玉米稈和麥秸的情況下，原料具有相對(duì)低量的半乳糖和阿拉伯糖而主要由葡萄糖和木糖組成，所有的糖在72小時(shí)內(nèi)被轉(zhuǎn)化為co2和乙醇。在玉米纖維(圖17)的情況下，有剩余的低殘留量阿拉伯糖、半乳糖和木糖。

在下表中，以水解結(jié)束時(shí)釋出的糖和發(fā)酵結(jié)束時(shí)產(chǎn)生的乙醇的量為基礎(chǔ)，計(jì)算發(fā)酵產(chǎn)率。

表3：針對(duì)不同的木質(zhì)纖維素原料，釋放的總糖(g/l)、bie252發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇(g/l)和乙醇產(chǎn)率(g乙醇/g糖)，

﹡(釋放的，開始發(fā)酵時(shí)的單體糖)

以如通過antonpaardma5000密度計(jì)測(cè)量測(cè)定的發(fā)酵結(jié)束時(shí)產(chǎn)生的乙醇量和使用的預(yù)處理原料的量為基礎(chǔ)，一式二份計(jì)算總水解和發(fā)酵的產(chǎn)率。這些數(shù)字在表4中示出。

表4：針對(duì)不同的木質(zhì)纖維素原料，bie252發(fā)酵的總水解和發(fā)酵產(chǎn)率(每噸干物質(zhì)的乙醇的加侖)

文獻(xiàn)

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