本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體而言，涉及一種耐鹽菌的分離純化方法及分離得到的耐鹽堿菌株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
土壤鹽堿化問題是目前全球最嚴(yán)重的環(huán)境問題之一，包括人口膨脹等各方面的因素，不斷使人類開發(fā)利用大面積土地生產(chǎn)新的次生鹽堿化，加速土壤鹽堿化的進(jìn)程。
鹽堿土因含有過量的鹽分、有毒物質(zhì)、堿度過大及不良的土壤物理性狀,對(duì)植物生長產(chǎn)生抑制作用,導(dǎo)致區(qū)域生態(tài)惡化。在當(dāng)今提倡生態(tài)效益為重的前提下，生物改良措施已成為研究的熱點(diǎn)，而微生物對(duì)鹽堿地的改良作用不可小視。微生物多少是地力或鹽堿地的一個(gè)指標(biāo)，鹽堿地微生物數(shù)量極少，是由于微生物有益菌群在堿性條件下不易生存繁衍。主要原因是鹽堿環(huán)境下不利于微生物生存，沒有微生物就轉(zhuǎn)換不了有機(jī)質(zhì)，從而生不成植物需要的生物蛋白質(zhì)和氨基酸。單憑生物肥是改良不了鹽堿地的，必須實(shí)施“改良鹽堿地系統(tǒng)改造工程”，以改良鹽堿地配套的多個(gè)產(chǎn)品和相應(yīng)的技術(shù)，才能改良鹽堿地，激活有機(jī)質(zhì)，增加微生物數(shù)量。土壤中的有機(jī)質(zhì)愈多，有益菌群微生物愈多，土壤地力愈好。
在土壤，水，空氣及動(dòng)、植物體中，不同種類的微生物絕大多數(shù)都是混雜生活在一起，當(dāng)我們希望獲得某一種微生物時(shí)，就必須從混雜的微生物類群中分理它，以得到只含有這一種微生物的純培養(yǎng)，這種獲得純培養(yǎng)的方法稱為微生物的分離與純化。為了獲得某種微生物的純培養(yǎng)，一般是根據(jù)該微生物對(duì)營養(yǎng)，酸堿度，氧等條件的要求不同，而供給它適宜的培養(yǎng)條件，或加入某種抑制劑造成只利于此菌生長而抑制其他菌生長的環(huán)境，從而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀釋涂布平板法或稀釋混合平板法或平板劃線分離法等分離純化微生物，直至得到純菌株。
若想要增加鹽堿地中微生物的數(shù)量，對(duì)其土壤中耐鹽微生物的分離與純化是行之有效的一個(gè)重要手段。內(nèi)蒙古河套平原地區(qū)的鹽堿地以硫酸鹽、氯化物為主，多為中度和重度鹽堿地，土壤中微生物菌群種類數(shù)量相對(duì)較少，想要分離出目的菌種不容易實(shí)現(xiàn)，尤其是能夠耐受高濃度氯化鈉的菌株?，F(xiàn)有技術(shù)中還沒有針對(duì)鹽堿地微生物分離與純化的有效技術(shù)。
有鑒于此，特提出本發(fā)明。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
基于現(xiàn)有技術(shù)中，針對(duì)內(nèi)蒙古河套平原地區(qū)的鹽堿地中耐鹽堿微生物數(shù)量相對(duì)較少的問題，本發(fā)明的第一目的在于提供一株能夠抗高鹽脅迫的微生物，進(jìn)而有效地進(jìn)行鹽堿地土壤改良。
本發(fā)明的第二目的在于提供一種所述的耐鹽菌的分離純化方法，上述抗高鹽脅迫的微生物即通過該方法分離得到。
本發(fā)明的第三目的在于提供一種所述的耐鹽菌的分離純化方法在鑒定鹽堿地土樣中與否存在耐鹽芽孢桿菌及判斷鹽堿化程度的應(yīng)用。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：
一株耐鹽菌菌株，所述菌株為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為：CGMCC13060；保藏時(shí)間為：2016年09月29日。
該菌種來源于內(nèi)蒙古河套平原鹽堿地中。
經(jīng)過鑒定，該解淀粉芽孢桿菌屬于細(xì)菌門芽孢桿菌亞目枯草芽孢桿菌屬細(xì)菌，其具有廣泛的能量代謝機(jī)制，在光照條件下能光合作用，好氧生長；可在鹽濃度高達(dá)120g/L的培養(yǎng)基中仍能較好的生長，有很好的改良鹽堿地土壤的應(yīng)用價(jià)值。由于該菌株由內(nèi)蒙古河套平原進(jìn)行分離，因而其尤其適合于改良內(nèi)蒙古河套平原的鹽堿地土壤。
液體培養(yǎng)物為淺黃色，瓶底和瓶壁出現(xiàn)少量的絮狀沉淀物，在固體培養(yǎng)基上形成2～3mm的點(diǎn)狀菌落、邊緣不整齊、表面不光滑，中間突出。
如上所述的耐鹽菌菌株在用作土壤調(diào)理劑中的應(yīng)用。
優(yōu)選的，所述土壤調(diào)理劑主要由以下組份制成：
礦物質(zhì)材料、活化劑A、微生物菌劑、用于為所述微生物菌劑提供營養(yǎng)的活化劑B；
所述礦物質(zhì)材料包括凹凸棒土、海泡石、沸石；
所述活化劑A的主要成分為有機(jī)酸；
所述微生物菌劑中含有的細(xì)菌菌株為本發(fā)明提供的解淀粉芽孢桿菌。
一種耐鹽菌的分離純化方法，包括以下步驟：
1)、將供試鹽堿地土樣經(jīng)稀釋后接種于營養(yǎng)肉湯增菌培養(yǎng)基中，有氧恒溫?fù)u床培養(yǎng)后得到混合菌液；
2)、將所述混合菌液接種到營養(yǎng)肉湯瓊脂平板上劃線培養(yǎng)，從中挑取符合芽孢桿菌形態(tài)的菌落；
3)、重復(fù)步驟2)直至得到形態(tài)單一菌落；
4)、將所述形態(tài)單一菌落進(jìn)行增菌培養(yǎng)；
5)、將步驟4)培養(yǎng)得到的菌接種于斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)并低溫保存；
6)、將步驟5)分離得到的微生物在含有氯化鈉的抗性篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選培養(yǎng)，得到耐鹽菌。
土壤中微生物的種類主要細(xì)菌，放線菌，光合細(xì)菌，真菌等。從菌種的數(shù)量上看，主要是細(xì)菌占優(yōu)勢，而且根據(jù)文獻(xiàn)資料報(bào)道，耐鹽菌株大多數(shù)為細(xì)菌中的芽孢桿菌，因此本發(fā)明把增菌培養(yǎng)基的基本類型定為營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。
此外，在本發(fā)明的實(shí)施例中可以明確得知，利用本發(fā)明提供的篩選方法，在特定的土壤中(內(nèi)蒙古河套平原鹽堿地)進(jìn)行篩選，都可以得到一類耐鹽堿的芽孢桿菌，只是其各自耐鹽能力不同。
優(yōu)選的，如上所述的耐鹽菌的分離純化方法，在步驟6)中，所述篩選培養(yǎng)的具體過程為：
將微生物樣本于含有氯化鈉的抗性篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)1～9次，當(dāng)培養(yǎng)次數(shù)大于1次時(shí)，在每相鄰兩次培養(yǎng)所用抗性篩選培養(yǎng)基中，后一次培養(yǎng)的氯化鈉濃度均不低于前一次，且后一次培養(yǎng)的菌種來源于前一次培養(yǎng)中存活下來的微生物菌種。
用此方法可篩選到針對(duì)不同濃度氯化鈉敏感的菌種，亦即該體系能夠快速篩選出不同程度的耐鹽菌株。
進(jìn)一步優(yōu)選的，在步驟6)中，在相鄰濃度梯度的抗性篩選培養(yǎng)基中，后一次培養(yǎng)所用培養(yǎng)基中的氯化鈉濃度是前一次的1.5～5倍。
具體的抗性篩選培養(yǎng)基的氯化鈉濃度梯度可設(shè)置為10g/L，30g/L，50g/L，70g/L，100g/L，150g/L，200g/L，等等。
根據(jù)發(fā)明人在土壤改良中的實(shí)踐，一般認(rèn)為篩選到的菌株耐鹽程度在100g/L則具有較好的應(yīng)用價(jià)值。
優(yōu)選的，如上所述的耐鹽菌的分離純化方法，在步驟6)中，所述含有氯化鈉的抗性篩選培養(yǎng)基包括以下組份：
蛋白胨8g/L～12g/L、牛肉膏2g/L～4g/L、氯化鈉5g/L～200g/L、酵母粉2g/L～4g/L、檸檬酸鈉2g/L～4g/L；溶劑為水。
抗性篩選培養(yǎng)基可為固體培養(yǎng)基(再添加10g/L～20g/L的瓊脂)，也可以用液體培養(yǎng)基。
優(yōu)選的，如上所述的耐鹽菌的分離純化方法，在步驟2)中，所述營養(yǎng)肉湯瓊脂平板中的培養(yǎng)基包括以下組份：
蛋白胨8g/L～12g/L、牛肉膏2g/L～4g/L、氯化鈉4g/L～6g/L、瓊脂10g/L～20g/L、制霉菌素40mg/L～60mg/L；溶劑為水。
制霉菌素具有共軛多烯大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，能抑制真菌和皮蘚菌的活性，對(duì)細(xì)菌無抑制作用。
優(yōu)選的，如上所述的耐鹽菌的分離純化方法，在步驟1)中，所述營養(yǎng)肉湯增菌培養(yǎng)基包括以下組份：
蛋白胨8g/L～12g/L、牛肉膏2g/L～4g/L、氯化鈉4g/L～6g/L；溶劑為水；
在步驟4)中，所述增菌培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基包括以下組份：
蛋白胨8g/L～12g/L、牛肉膏2g/L～4g/L、氯化鈉4g/L～6g/L、酵母粉2g/L～4g/L、檸檬酸鈉2g/L～4g/L；溶劑為水；
在步驟5)中，所述斜面培養(yǎng)基包括以下組份：
蛋白胨8g/L～12g/L、牛肉膏2g/L～4g/L、氯化鈉4g/L～6g/L、瓊脂10g/L～20g/L；溶劑為水。
優(yōu)選的，如上所述的耐鹽菌的分離純化方法，在步驟4)中，所述增菌培養(yǎng)的培養(yǎng)終點(diǎn)為所培養(yǎng)菌的芽孢率達(dá)到90％以上則終止培養(yǎng)。
優(yōu)選的，如上所述的耐鹽菌的分離純化方法，其特征在于，步驟5)具體包括：
將步驟4)增菌培養(yǎng)后的菌種劃線于斜面培養(yǎng)基上，28℃～32℃培養(yǎng)2～3天，結(jié)束培養(yǎng)后置于4℃冰箱保存。
如上所述的耐鹽菌的分離純化方法在鑒定鹽堿地土樣中與否存在耐鹽芽孢桿菌及判斷鹽堿化程度的應(yīng)用。
如果樣品中存在目標(biāo)微生物，則可以按照本發(fā)明提供的篩選方法獲得相應(yīng)的微生物；如果樣品中不存在目標(biāo)微生物，同樣也可以重復(fù)篩選檢定的過程，以確定是否具有目標(biāo)微生物以及該微生物耐鹽的能力，若耐鹽能力越強(qiáng)，則說明土壤樣品來源地的鹽堿化程度較高，且生境惡劣，不適合農(nóng)作物生長，這同樣可以達(dá)到降低成本的目的。因此，所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可以重復(fù)本發(fā)明提供的技術(shù)方案，并能夠解決申請所要解決的技術(shù)問題，達(dá)到該技術(shù)方案的效果。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
1)、本發(fā)明所選用的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)是在河套地區(qū)鹽堿地土壤中提取篩選出來的具有顯著抗鹽堿作用的微生物，具有優(yōu)秀的改善河套地區(qū)土壤活力的能力。
2)、本發(fā)明提供的這種篩選方法，采用了富集分離的培養(yǎng)方式從供試土樣中篩選了出具有高耐鹽性能的微生物，具有針對(duì)性強(qiáng)，篩選結(jié)果理想的效果，以期為周期短、見效快的鹽堿地土壤修復(fù)提供保障。
本申請?zhí)峁┑慕獾矸垩挎邨U菌(Bacillus amyloliquefaciens)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所；保藏時(shí)間為：2016年09月29日，保藏編號(hào)CGMCC NO.13060。經(jīng)保藏中心于2016年09月29日檢測為存活菌株。
具體實(shí)施方式
下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
實(shí)施例1
本實(shí)施例提供了一種微生物篩選方法，該方法包括如下步驟：
1)、將供試鹽堿地土樣1:1000稀釋后接種于營養(yǎng)肉湯增菌培養(yǎng)基中，在30℃條件下，進(jìn)行有氧恒溫培養(yǎng)搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)3天，得到混合菌液；
所述營養(yǎng)肉湯增菌培養(yǎng)基包括以下組份：蛋白胨8g/L、牛肉膏4g/L、氯化鈉4g/L；溶劑為水；
2)、將所述混合菌液接種到營養(yǎng)肉湯瓊脂平板上劃線培養(yǎng)，從中挑取符合芽孢桿菌形態(tài)的菌落；
芽孢桿菌單菌落的形態(tài)一般為白色，周邊不整齊，中間突出，革蘭氏陽性，顯微鏡觀察會(huì)看到透明的芽孢出現(xiàn)。
所述營養(yǎng)肉湯瓊脂平板中的培養(yǎng)基包括以下組份：蛋白胨12g/L、牛肉膏2g/L、氯化鈉6g/L、瓊脂10g/L～20g/L、制霉菌素60mg/L；溶劑為水。
3)、重復(fù)步驟2)直至得到形態(tài)單一菌落；30℃恒溫培養(yǎng)，每次培養(yǎng)2～4天；
4)、將所述形態(tài)單一菌落進(jìn)行增菌培養(yǎng)；30℃恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)菌的芽孢率達(dá)到90％以上則終止培養(yǎng)；
所述增菌培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基包括以下組份：蛋白胨8g/L、牛肉膏4g/L、氯化鈉6g/L、酵母粉2g/L、檸檬酸鈉2g/L；溶劑為水；
5)、將步驟4)增菌培養(yǎng)后的菌種劃線于斜面培養(yǎng)基上，28℃～32℃培養(yǎng)2～3天，結(jié)束培養(yǎng)后置于4℃冰箱保存；
所述斜面培養(yǎng)基包括以下組份：蛋白胨12g/L、牛肉膏4g/L、氯化鈉4g/L、瓊脂10g/L；溶劑為水。
6)、將步驟5)分離得到的微生物在含有氯化鈉的抗性篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選培養(yǎng)：
所述含有氯化鈉的抗性篩選培養(yǎng)基包括以下組份：蛋白胨8g/L、牛肉膏2g/L、氯化鈉Xg/L、酵母粉2g/L、檸檬酸鈉4g/L；溶劑為水；
上述抗性篩選培養(yǎng)基中氯化鈉X設(shè)置為不同的濃度梯度，具體的，具體的濃度梯度設(shè)計(jì)為5g/L，10g/L，30g/L，50g/L，70g/L，100g/L，逐級(jí)篩選耐鹽菌株。選取在10％鹽離子下生長良好的菌株。
吸取增菌培養(yǎng)基中活化好的單菌株菌液0.1ml，涂布在以上不同濃度的鹽培養(yǎng)基上，30度培養(yǎng)3天，選取在100g/L鹽濃度生長良好的菌落，經(jīng)反復(fù)活化后，4度保存在營養(yǎng)肉湯瓊脂斜面上備用。
實(shí)施例2
本實(shí)施例提供了一種微生物篩選方法，該方法包括如下步驟：
1)、將供試鹽堿地土樣1:1000稀釋后接種于營養(yǎng)肉湯增菌培養(yǎng)基中，在30℃條件下，進(jìn)行有氧恒溫培養(yǎng)搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)3天，得到混合菌液；
所述營養(yǎng)肉湯增菌培養(yǎng)基包括以下組份：蛋白胨12g/L、牛肉膏2g/L、氯化鈉6g/L；溶劑為水；
2)、將所述混合菌液接種到營養(yǎng)肉湯瓊脂平板上劃線培養(yǎng)，從中挑取符合芽孢桿菌形態(tài)的菌落；
芽孢桿菌單菌落的形態(tài)一般為白色，周邊不整齊，中間突出，革蘭氏陽性，顯微鏡觀察會(huì)看到透明的芽孢出現(xiàn)。
所述營養(yǎng)肉湯瓊脂平板中的培養(yǎng)基包括以下組份：蛋白胨8g/L、牛肉膏4g/L、氯化鈉4g/L、瓊脂20g/L、制霉菌素40mg/L；溶劑為水。
3)、重復(fù)步驟2)直至得到形態(tài)單一菌落；30℃恒溫培養(yǎng)，每次培養(yǎng)2～4天；
4)、將所述形態(tài)單一菌落進(jìn)行增菌培養(yǎng)；30℃恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)菌的芽孢率達(dá)到90％以上則終止培養(yǎng)；
所述增菌培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基包括以下組份：蛋白胨12g/L、牛肉膏2g/L、氯化鈉4g/L、酵母粉4g/L、檸檬酸鈉4g/L；溶劑為水；
5)、將步驟4)增菌培養(yǎng)后的菌種劃線于斜面培養(yǎng)基上，28℃～32℃培養(yǎng)2～3天，結(jié)束培養(yǎng)后置于4℃冰箱保存；
所述斜面培養(yǎng)基包括以下組份：蛋白胨8g/L、牛肉膏2g/L、氯化鈉6g/L、瓊脂20g/L；溶劑為水。
6)、將步驟5)分離得到的微生物在含有氯化鈉的抗性篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選培養(yǎng)：
所述含有氯化鈉的抗性篩選培養(yǎng)基包括以下組份：蛋白胨12g/L、牛肉膏4g/L、氯化鈉Xg/L、酵母粉4g/L、檸檬酸鈉2g/L；溶劑為水；
上述抗性篩選培養(yǎng)基中氯化鈉X設(shè)置為不同的濃度梯度，具體的，具體的濃度梯度設(shè)計(jì)為5g/L，10g/L，15g/L，30g/L，50g/L，70g/L，100g/L，150g/L，逐級(jí)篩選耐鹽菌株。選取在10％鹽離子下生長良好的菌株。
吸取增菌培養(yǎng)基中活化好的單菌株菌液0.1ml，涂布在以上不同濃度的鹽培養(yǎng)基上，30度培養(yǎng)3天，選取在100g/L鹽濃度生長良好的菌落，經(jīng)反復(fù)活化后，4度保存在營養(yǎng)肉湯瓊脂斜面上備用。
實(shí)施例3
本實(shí)施例提供了一種微生物篩選方法，該方法包括如下步驟：
1)、將供試鹽堿地土樣1:1000稀釋后接種于營養(yǎng)肉湯增菌培養(yǎng)基中，在30℃條件下，進(jìn)行有氧恒溫培養(yǎng)搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)3天，得到混合菌液；
所述營養(yǎng)肉湯增菌培養(yǎng)基包括以下組份：蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L、氯化鈉5g/L；溶劑為水；
2)、將所述混合菌液接種到營養(yǎng)肉湯瓊脂平板上劃線培養(yǎng)，從中挑取符合芽孢桿菌形態(tài)的菌落；
芽孢桿菌單菌落的形態(tài)一般為白色，周邊不整齊，中間突出，革蘭氏陽性，顯微鏡觀察會(huì)看到透明的芽孢出現(xiàn)。
所述營養(yǎng)肉湯瓊脂平板中的培養(yǎng)基包括以下組份：蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L、氯化鈉5g/L、瓊脂15g/L、制霉菌素50mg/L；溶劑為水。
3)、重復(fù)步驟2)直至得到形態(tài)單一菌落；30℃恒溫培養(yǎng)，每次培養(yǎng)2～4天；
4)、將所述形態(tài)單一菌落進(jìn)行增菌培養(yǎng)；30℃恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)菌的芽孢率達(dá)到90％以上則終止培養(yǎng)；
所述增菌培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基包括以下組份：蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L、氯化鈉5g/L、酵母粉3g/L、檸檬酸鈉3g/L；溶劑為水；
5)、將步驟4)增菌培養(yǎng)后的菌種劃線于斜面培養(yǎng)基上，28℃～32℃培養(yǎng)2～3天，結(jié)束培養(yǎng)后置于4℃冰箱保存；
所述斜面培養(yǎng)基包括以下組份：蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L、氯化鈉5g/L、瓊脂15g/L；溶劑為水。
6)、將步驟5)分離得到的微生物在含有氯化鈉的抗性篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選培養(yǎng)：
所述含有氯化鈉的抗性篩選培養(yǎng)基包括以下組份：蛋白胨10g/L、牛肉膏3g/L、氯化鈉Xg/L、酵母粉3g/L、檸檬酸鈉3g/L；溶劑為水；
上述抗性篩選培養(yǎng)基中氯化鈉X設(shè)置為不同的濃度梯度，具體的，具體的濃度梯度設(shè)計(jì)為5g/L，10g/L，30g/L，50g/L，70g/L，100g/L，120g/L，200g/L，逐級(jí)篩選耐鹽菌株。選取在10％鹽離子下生長良好的菌株。
吸取增菌培養(yǎng)基中活化好的單菌株菌液0.1ml，涂布在以上不同濃度的鹽培養(yǎng)基上，30度培養(yǎng)3天，選取在100g/L鹽濃度生長良好的菌落，經(jīng)反復(fù)活化后，4度保存在營養(yǎng)肉湯瓊脂斜面上備用。
實(shí)驗(yàn)例4
根據(jù)實(shí)施例1～3的培養(yǎng)以能耐100g/L的鹽濃度為標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出5株耐鹽芽孢桿菌。分別標(biāo)記為b1，b2，b3，b4，b5。其中，b2和b3來自實(shí)施例1，b4來自實(shí)施例2，b1和b5來自實(shí)施例3。
耐鹽程度驗(yàn)證結(jié)果
表1 5株芽孢桿菌的耐鹽程度驗(yàn)證
注：“+”表示代表待測菌株在含鹽平板上能正常生長，“-”表示待測菌株在含鹽平板上不能生長。
不同的“+”表示耐鹽能力的強(qiáng)弱。
4.結(jié)論
篩選出來的5株耐鹽芽孢桿菌在100g/L氯化鈉濃度下都能生長，其中只有b1和b5能在120g/L濃度下生長，且b1生長比b5良好；以上5株菌在濃度200g/L濃度均不能生長；以上5株菌b2/b3的最適生長鹽濃度為1％～5％，b1，b5的最適生長鹽濃度為1％，在5％～10％之間沒有明顯的生長差異。綜合來看，b1是本次試驗(yàn)選重的耐鹽能力最強(qiáng)的菌株，經(jīng)過生理生化鑒定，鑒定為地衣芽孢桿菌。
應(yīng)用例1
根據(jù)實(shí)施例1～3的培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)出含有不同濃度氯化鈉的抗性篩選培養(yǎng)基中微生物的存活率，見表2。
存活率的統(tǒng)計(jì)方法為斜面菌種接種到不同鹽離子濃度的100ml的液體培養(yǎng)基中，30℃，200rpm恒溫培養(yǎng)48h，每4小時(shí)取一次菌液，通過檢測菌液吸光度和平板計(jì)數(shù)，確定菌株的存活數(shù)，跟0小時(shí)初始的菌量進(jìn)行比較，得出存活率；
48h后將存活的菌株接種到下一鹽離子濃度的培養(yǎng)基中，重復(fù)上述操作。
表2 5株芽孢桿菌的存活率驗(yàn)證
從上表可知實(shí)施例3中耐鹽菌的含量最高，因而其對(duì)應(yīng)土樣的鹽堿化程度最高(主要看10g/L的耐鹽能力)。
應(yīng)用例2
將實(shí)施例4中篩選得到的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)制成菌劑。
1)、菌種活化
將低溫保存的解淀粉芽孢桿菌菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，30℃下震蕩培養(yǎng)20h～24h，得到的發(fā)酵液作為接種液；
2)、種子液的制備
按照體積百分比2％～5％的比例向LB液體培養(yǎng)基中接入步驟1)制備的接種液，在30℃下震蕩培養(yǎng)12h～16h，得種子液。
3)、發(fā)酵培養(yǎng)
將步驟2)所得種子液與發(fā)酵培養(yǎng)基按照體積百分比1％～2％比例接入含有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，得到解淀粉芽孢桿菌的液體菌劑。
其中：所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成分及其質(zhì)量百分比為葡萄糖0.5％，玉米粉2％，黃豆餅粉0.5％，硫酸鎂0.01％，磷酸二氫鉀0.15％，碳酸鈣0.15％，硫酸錳0.0001％，余者為水；
所述發(fā)酵罐發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度為28℃～32℃，通氣量為1:(0.5～1.6)，攪拌速度為200rpm～400rpm，培養(yǎng)時(shí)間為24h～36h；
上述制得的菌劑為液體菌劑，離心后添加適量的基質(zhì)混合即得固體粉劑。所述微生物菌劑中解淀粉芽孢桿菌的芽孢數(shù)為1×109～10CFU/ml，通常在2×109CFU/ml左右。
一種土壤調(diào)理劑及其制備方法，該土壤調(diào)理劑包括以下成分：
礦物質(zhì)材料、活化劑A、活化劑B、上述微生物菌劑；
所述礦物質(zhì)材料包括100～200目的凹凸棒土、海泡石、沸石；所述凹凸棒土、海泡石、沸石的質(zhì)量比為1:0.5:1；
所述活化劑A的成份為質(zhì)量比為1：0.02的檸檬酸和氨基乙腈硫酸氫鹽的混合物；
所述活化劑B包括酵母浸提液、蛋白胨和氨基酸；所述酵母浸提液、蛋白胨和氨基酸的質(zhì)量比為1:2:1；
該土壤調(diào)理劑制備方法包括以下步驟：
1)、將礦物質(zhì)材料與活化劑A按1：0.02的質(zhì)量比混勻，180℃在反應(yīng)釜中反應(yīng)3h，得到第一反應(yīng)物；
2)、將微生物菌劑與活化劑B按1：1.5的質(zhì)量比混勻，于30℃在發(fā)酵罐中培養(yǎng)12h得到第二反應(yīng)物；
3)、將所述第一反應(yīng)物與所述第二反應(yīng)物按1：0.03的質(zhì)量比混勻、造粒，即得所述土壤調(diào)理劑。
驗(yàn)證本發(fā)明提供的土壤調(diào)理劑對(duì)河套地區(qū)鹽堿土的改良效果。
試驗(yàn)材料和方法
試驗(yàn)地點(diǎn)：試驗(yàn)于2015年5月至2015年10月在內(nèi)蒙古巴彥淖爾市進(jìn)行。
試驗(yàn)材料：
氮磷鉀三元復(fù)合肥，土壤調(diào)理劑(凹凸棒土、海泡石、沸石、抗鹽堿菌劑、活化劑)；向日葵種子(品種590)。
試驗(yàn)設(shè)計(jì)：
試驗(yàn)地面積一畝，共設(shè)置四個(gè)處理，分別是：
處理一：常規(guī)施氮磷鉀肥(NPK組)；
處理二：NPK+施用凹凸棒土、海泡石、沸石，三者配比同本應(yīng)用例提供的土壤調(diào)理劑的配比(BN1組)；
處理三：NPK+通過本應(yīng)用例方法制備的土壤調(diào)理劑(BN2組)；
試驗(yàn)步驟：
試驗(yàn)共設(shè)四個(gè)處理，將一畝地平均劃分為四個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)按試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行施肥，氮磷鉀肥三元復(fù)合肥作為基肥一次性施入，每畝60～80公斤。處理二、三、四分別在苗期和蕾期進(jìn)行調(diào)理劑追施，苗期每畝追施30公斤，蕾期每畝追施20公斤(可采用葉面噴施)。
試驗(yàn)收獲時(shí)，每小區(qū)單打單收，進(jìn)行向日葵百粒重和產(chǎn)量檢測，每小區(qū)收獲后進(jìn)行土壤PH、有機(jī)質(zhì)、電導(dǎo)率、交換性鈉、堿化度數(shù)據(jù)監(jiān)測。
三、試驗(yàn)結(jié)果及分析
調(diào)理劑對(duì)向日葵產(chǎn)量的影響：
通過對(duì)比分析各處理的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，將各組與本應(yīng)用例提供的土壤調(diào)理劑(BN2組)進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示：BN2處理的作物百粒重比NPK、BN1處理分別提高了21.15％、17.96％；BN2處理的向日葵產(chǎn)量比NPK、BN1、BN2處理分別提高了22.93％、18.36％。
調(diào)理劑對(duì)土壤理化性狀的影響：
向日葵收獲后，對(duì)土壤五項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測，檢測數(shù)據(jù)顯示：BN2處理的土壤PH比NPK、BN1處理分別降低了15.94％、11.44％；BN2處理的土壤全鹽比NPK、BN1處理分別降低了27.6％、23.0％；BN2處理的土壤交換性鈉與NPK、BN1處理相比分別下降了57.6％、33.6％；NPK、BN1、BN2、三個(gè)處理的土壤堿化度分別是25.46％、20.32％、8.87％，BN2處理的土壤陽離子交換量與NPK、BN1處理相比分別增加了32.5％、25.3％。
表3 調(diào)理劑對(duì)土壤理化性狀的影響
四、試驗(yàn)結(jié)論
在常規(guī)施肥基礎(chǔ)上追施土壤調(diào)理劑產(chǎn)品最高能使向日葵增產(chǎn)15.85％，其中凹凸棒土、海泡石、沸石、抗鹽堿菌劑和活化劑聯(lián)合作用的效果最好，由此可見本農(nóng)河套地區(qū)土壤調(diào)理劑可以顯著改良鹽堿地土壤，培肥地力，增產(chǎn)創(chuàng)收。
盡管已用具體實(shí)施例來說明和描述了本發(fā)明，然而應(yīng)意識(shí)到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。