本發(fā)明涉及一種用SPF雞制備雞傳染性支氣管炎陽性血清的方法，屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
雞傳染性支氣管炎(Infection bronchitis)是由傳染性支氣管炎病毒(Infection bronchitis virus)引起的雞的一種急性高度接觸性呼吸道傳染病，其臨診特征是呼吸困難、發(fā)出啰音、咳嗽、張口呼吸、打噴嚏。它主要侵害禽類的呼吸道與腎臟，此外有的血清型還能導(dǎo)致腺胃等消化系統(tǒng)器官病變。該病會使肉雞體重增長緩慢，出籠效率降低；使蛋雞產(chǎn)蛋數(shù)量和質(zhì)量下降；使雛雞發(fā)育不良并有較高的致死率。其在全世界都有分布，對禽類養(yǎng)殖業(yè)危害巨大，往往造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
為減少本病對養(yǎng)雞業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失，雞傳染性支氣管炎疫苗的研制與應(yīng)用具有重大的意義。因此為保證該類疫苗產(chǎn)品質(zhì)量，鑒別、效力、外源病毒檢驗(yàn)是動物活疫苗質(zhì)量檢驗(yàn)的重點(diǎn)之一，這就需要特異性血清對樣品進(jìn)行中和處理。目前國內(nèi)制備陽性血清通常采用SPF本動物或異源動物作為免疫受體。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于通過SPF雞對雞傳染性支氣管炎病毒刺激所產(chǎn)生免疫反應(yīng)獲得免疫抗體——陽性血清。
本發(fā)明技術(shù)方案：
1.一種用SPF雞制備雞傳染性支氣管炎陽性血清的方法，其特征在于其制備的方法步驟為：
(1)用雞傳染性支氣管炎抗原對SPF雞進(jìn)行滴鼻第一次免疫，15日后，用雞傳染性支氣管炎活疫苗對SPF雞進(jìn)行免疫，共免疫四次；
(2)每次免疫前，采集的等量血液，制備血清，檢測SPF雞血清中抗體滴度；
(3)當(dāng)SPF雞血血清中抗體滴度達(dá)到210以上時，采集血液，將采集后的血液在37℃恒溫水浴鍋靜置30min，然后離心分出血清，過濾，將過濾后的血清進(jìn)行無菌分裝、保存；
(4)無菌分裝保存的血清，確保純凈，進(jìn)行抗體檢測，確定滴度。
2.如權(quán)利要求1所述的一種用SPF雞制備雞傳染性支氣管炎陽性血清的方法，其特征在于其所述SPF雞免疫的程序具體為：1日齡進(jìn)行第一次免疫，免疫劑量為0.1～0.2ml；15日齡進(jìn)行第二次免疫，免疫劑量為10羽份/只；30日齡進(jìn)行第三次免疫，免疫劑量為10羽份/只；45日齡進(jìn)行第四次免疫，免疫劑量為10羽份/只。
3.如權(quán)利要求1所述一種用SPF雞制備雞傳染性支氣管炎陽性血清的方法，其特征在于所述雞傳染性支氣管炎抗原效價為106.0EID50/ml，每只雞免疫劑量為0.1～0.2ml。
4.如權(quán)利要求1所述一種用SPF雞制備雞傳染性支氣管炎陽性血清的方法，其特征在于其中步驟(3)中給雞采血時間為每次免疫后15天，再次免疫前，最后一次采血時間為免疫后14天。
5.如權(quán)利要求1所述一種用SPF雞制備雞傳染性支氣管炎陽性血清的方法，其特征在于其中步驟(4)中采用3000r/min對靜置后雞血離心10min，然后分離血清并用0.22μm一次性濾器過濾。
6.如權(quán)利要求1所述一種用SPF雞制備雞傳染性支氣管炎陽性血清的方法，其特征在于，所述陽性血清的抗體滴度為210。
本發(fā)明具體實(shí)施方式
1.免疫抗原的制備
制備雞傳染性支氣管炎抗原用的毒株為H120、H52弱毒株；均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。
將傳染性支氣管炎H120株和H52毒株等量混合，做2.5倍的稀釋處理，制備成雞傳染性支氣管炎抗原：
雞傳染性支氣管炎活疫苗(H120株)購自青島易邦生物工程有限公司。
2.雞傳染性支氣管炎病毒陰性血清的制備方法：
選用15日齡SPF雞飼養(yǎng)于負(fù)壓隔離器內(nèi)，采集血液制備雞傳染性支氣管炎陰性血清。對分裝保存的陰性血清進(jìn)行HI試驗(yàn)，檢驗(yàn)外源病毒、支原體和細(xì)菌，確定滴度和純凈性(見表1)。
3.雞傳染性支氣管炎病毒陽性血清的制備方法
初免：對1日齡用雞傳染性支氣管炎抗原免疫，0.1～0.2ml滴鼻；15日齡時，用翅下靜脈采血方式采集2ml血液，分離血清，進(jìn)行HI效價測定，同時進(jìn)行第二次免疫：用雞傳染性支氣管炎活疫苗進(jìn)行免疫，點(diǎn)眼滴鼻；30日齡時，用翅下靜脈采血方式采集2ml血液，分離血清，進(jìn)行HI效價測定，進(jìn)行第三次免疫：用雞傳染性支氣管炎活疫苗進(jìn)行免疫，點(diǎn)眼滴鼻；45日齡時，用翅下靜脈采血方式采集2ml血液，分離血清，進(jìn)行HI效價測定，同時進(jìn)行第四次免疫：用雞傳染性支氣管炎活疫苗進(jìn)行免疫，點(diǎn)眼滴鼻。15天后(60日齡)，用翅下靜脈采血方式采集2ml血液，分離血清，進(jìn)行效HI價測定?？贵w滴度達(dá)到210以上時，即確定為采血時間。
采集后的血液放入37后恒溫水浴鍋靜置30min，然后3000r/min離心10min，分離血清，再用0.22μm濾膜過濾，將過濾后的血清進(jìn)行無菌分裝、保存，0.5ml/瓶。
對分裝保存的血清抽樣進(jìn)行HI試驗(yàn)，檢驗(yàn)外源病毒、支原體和細(xì)菌，確定滴度和純凈性。
本發(fā)明涉及的生物材料資源信息
雞傳染性支氣管炎病毒(Infection bronchitis virus)H120株、H52株：均從中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心所購買(請見中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心編著，中國獸醫(yī)菌種目錄，第二版，2002年，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，p136)，本公司實(shí)驗(yàn)室保存；雞傳染性支氣管炎活疫苗(H120株)：從青島易邦生物工程有限公司購買，本公司實(shí)驗(yàn)室保存。
本發(fā)明的積極意義
本發(fā)明公開了一種用SPF雞制備雞傳染性支氣管炎陽性血清的方法。其包括免疫動物選擇、免疫接種方式、時間間隔、免疫次數(shù)、雞血采集、血清制備及檢驗(yàn)。本發(fā)明通過雞傳染性支氣管炎抗原和活疫苗免疫SPF雞制備陽性血清，該陽性血清是雞傳染性支氣管炎準(zhǔn)確診斷、免疫監(jiān)測及對其疫苗免疫效果進(jìn)行準(zhǔn)確評價的基本保障，提高雞傳染性支氣管炎病的防控水平。為雞傳染性支氣管炎病的監(jiān)測和相關(guān)獸用生物制品的質(zhì)量評價提供有力的技術(shù)支撐，具有很好的應(yīng)用前景。
實(shí)施例
以下實(shí)施例為進(jìn)一步說明本發(fā)明，不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1
——免疫抗原的制備
用無菌生理鹽水分別將雞傳染性支氣管炎病毒H120株和H52株毒種稀釋10～100倍，以0.1ml接種10～11日齡的SPF雞胚尿囊腔，37℃孵化30～36小時，棄死胚，置2～8℃冰箱6～8小時后，收獲雞胚液，將收獲的傳染性支氣管炎H120株和H52株病毒液按(V/V)等量混合，做2.5倍的稀釋處理后進(jìn)行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)合格后即為雞傳染性支氣管炎抗原作為免疫抗原(檢驗(yàn)結(jié)果見表1)。
表1免疫抗原檢測結(jié)果
實(shí)施例2
——雞傳染性支氣管炎病毒陰性血清的制備方法：
選用15日齡SPF雞飼養(yǎng)于負(fù)壓隔離器內(nèi)，無菌采集血液并采集血清后進(jìn)行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)合格后成雞傳染性支氣管炎陰性血清，檢驗(yàn)結(jié)果見表2。
實(shí)施例3
——雞傳染性支氣管炎病毒陽性血清的制備
(1)初免：雞傳染性支氣管炎抗原免疫，每只雞0.1～0.2ml滴鼻。
(2)15天后，用翅下靜脈采血方式采集2ml血液，分離血清，進(jìn)行HI效價測定，檢測抗體為22。
(3)第二次免疫：用雞傳染性支氣管炎活疫苗進(jìn)行免疫，點(diǎn)眼滴鼻。
(4)15天后，用翅下靜脈采血方式采集2ml血液，分離血清，進(jìn)行HI效價測定，檢測抗體為27。
(5)第三次免疫：用雞傳染性支氣管炎活疫苗進(jìn)行免疫，點(diǎn)眼滴鼻。
(6)15天后，用翅下靜脈采血方式采集2ml血液，分離血清，進(jìn)行HI效價測定，檢測抗體為29。
(7)第四次免疫：用雞傳染性支氣管炎活疫苗進(jìn)行免疫，點(diǎn)眼滴鼻。
(8)15天后，用翅下靜脈采血方式采集2ml血液，分離血清，進(jìn)行效HI價測定，檢測抗體為210。
(9)抗體滴度達(dá)到210以上時，即確定為采血時間。
(10)采集后的血液放入37℃恒溫水浴鍋靜置30min，然后3000r/min離心10min，分離血清，再用0.22μm濾膜過濾，將過濾后的血清進(jìn)行無菌分裝、保存，0.5ml/瓶。
(11)無菌條件下，對分裝保存的血清進(jìn)行HI試驗(yàn)，檢驗(yàn)外源病毒、支原體和細(xì)菌，確定滴度和純凈性，檢測結(jié)果見表2。
表2雞傳染性支氣管炎病毒陰性和陽性血清的檢驗(yàn)結(jié)果