本發(fā)明涉及一株防治苦瓜枯萎病的拮抗真菌及其應(yīng)用，具體涉及一株對(duì)苦瓜枯萎病具有顯著防治效果的產(chǎn)紫青霉菌及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

苦瓜枯萎病(bitter gourd wilt)是由尖鐮孢菌苦瓜專(zhuān)化型Fusarium oxysporum f.sp.momordicae侵染苦瓜引起的一種土壤傳播病害，廣泛分布在世界各苦瓜產(chǎn)區(qū)，其在苦瓜整個(gè)生育期都可發(fā)生，病害流行時(shí)可使瓜田出現(xiàn)大量死藤，減產(chǎn)30％以上，嚴(yán)重影響苦瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)。

目前還沒(méi)有選育出針對(duì)該病害的有效抗病品種，過(guò)去利用溴甲烷等化學(xué)藥劑可有效控制枯萎病的發(fā)生，但對(duì)環(huán)境污染大，易使病菌產(chǎn)生耐藥性，也會(huì)導(dǎo)致農(nóng)藥殘留等問(wèn)題，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)造成嚴(yán)重破壞，威脅到人類(lèi)健康和食品安全，已被世界大多數(shù)國(guó)家禁止使用。輪作和土壤消毒等措施雖對(duì)枯萎病有一定防治效果，但其生產(chǎn)成本較大，難以適應(yīng)中國(guó)集約化農(nóng)業(yè)種植模式的要求。因此，對(duì)于典型土傳病害的防治，人們轉(zhuǎn)向了環(huán)境友好的生物防治技術(shù)研究，篩選對(duì)枯萎病菌有較強(qiáng)拮抗活性的生防菌并用于苦瓜生產(chǎn)，將會(huì)有效解決枯萎病等土傳病害，對(duì)保障苦瓜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

因此，開(kāi)發(fā)新的、有效和安全的微生物殺菌劑控制苦瓜枯萎病的發(fā)生是提高苦瓜抗逆性和生產(chǎn)總量的需求，同時(shí)更是苦瓜產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)、苦瓜食用安全及農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的需要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一株防治苦瓜枯萎病的拮抗真菌及其應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供一株產(chǎn)紫青霉Penicillium purpureogenum菌株Q2，已于2016年10月25日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，菌種保藏號(hào)為CGMCC NO.13165。

該菌株是從山東省泰安市山東農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)基地采集的黃瓜根際土中分離得到，菌株的分生孢子梗發(fā)生于菌絲繩，孢梗莖，壁平滑，頂端不膨大；帚狀枝雙輪生，少量三輪生；?；?-8個(gè)，(8.0-13)μm×(2.3-3.0)μm，披針狀，彼此緊貼近于平衡；瓶梗每輪3-6個(gè)，(10-20)μm×(1.8-3.0)μm，梗頸明顯；分生孢子呈現(xiàn)橢圓形，近乎圓形，大小為(2.5-3.0)μm×(2.0-2.5)μm，壁平滑；分生孢子鏈較疏松，近于圓柱狀。

根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供一種生防制劑，其活性成分為上述產(chǎn)紫青霉Penicillium purpureogenum菌株Q2的發(fā)酵產(chǎn)物。

本發(fā)明還提供上述生防制劑的制備方法，包括如下步驟：發(fā)酵上述的產(chǎn)紫青霉Penicillium purpureogenum菌株Q2，得到發(fā)酵產(chǎn)物。

上述制備方法中，發(fā)酵采用的發(fā)酵培養(yǎng)料的原料組成為：麥粒89％、麥麩10％、石膏1％，均為質(zhì)量百分比。

上述制備方法中，發(fā)酵的條件為：25-30℃，培養(yǎng)10-15d；優(yōu)選為，28℃、培養(yǎng)12d。

進(jìn)一步的，上述制備方法中，還包括：將發(fā)酵產(chǎn)物中的發(fā)酵培養(yǎng)料除去的步驟。

根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供上述產(chǎn)紫青霉Penicillium purpureogenum菌株Q2和/或生防制劑在防治苦瓜枯萎病中的應(yīng)用。

上述應(yīng)用中，所述苦瓜枯萎病是由尖孢鐮刀菌苦瓜專(zhuān)化型Fusarium oxysporum f.sp.momordicae引起的。

上述應(yīng)用中，所述防治苦瓜枯萎病體現(xiàn)在減輕苦瓜枯萎病的危害癥狀。

根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供上述產(chǎn)紫青霉Penicillium purpureogenum菌株Q2和/或生防制劑在促進(jìn)苦瓜生長(zhǎng)或者促進(jìn)苦瓜增產(chǎn)中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供一種能防治苦瓜枯萎病，同時(shí)促進(jìn)苦瓜生長(zhǎng)和增產(chǎn)的產(chǎn)品，其活性成分為上述的產(chǎn)紫青霉Penicillium purpureogenum菌株Q2或上述的青霉菌Q2生防制劑。

本發(fā)明的有益效果：

(1)迄今國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)利用產(chǎn)紫青霉防治苦瓜枯萎病的研究報(bào)道，本發(fā)明系首次從黃瓜根際土壤分離獲得的產(chǎn)紫青霉菌Q2菌株，該菌株對(duì)植物土傳病害苦瓜枯萎病具有較強(qiáng)拮抗作用，將可能為苦瓜枯萎病及其它園藝作物土傳病害生物防治提供新的生防菌，增加生防制劑的種類(lèi)，解決市場(chǎng)中生防制劑單一的現(xiàn)象。

(2)經(jīng)試驗(yàn)證明，本發(fā)明的菌株Q2及其生防制劑，可以在溫室中使用并對(duì)苦瓜枯萎病有一定程度的防治效果，達(dá)68.19％；由于本發(fā)明的菌株Q2是專(zhuān)門(mén)針對(duì)苦瓜枯萎病篩選開(kāi)發(fā)的生防菌株，因而在防治瓜類(lèi)枯萎病方面與目前其它廣譜生物生防制劑相比，防治效果顯著。

(3)由于本發(fā)明提供的是生物制劑，可減少苦瓜生產(chǎn)過(guò)程中的化肥農(nóng)藥使用量，因而有利于作物的無(wú)公害生產(chǎn)，減少管理開(kāi)支。同時(shí)該生防制劑還有增產(chǎn)功能，可為農(nóng)民增加經(jīng)濟(jì)收入。

附圖說(shuō)明

圖1：菌株Q2與苦瓜枯萎病病原菌對(duì)峙培養(yǎng)及產(chǎn)紫青霉菌株Q2的形態(tài)特征，圖中，A:5d時(shí)對(duì)照組枯萎病菌菌株SG-15菌落；B:5d時(shí)處理組SG-15和Q2菌落；C:20d時(shí)處理組SG-15和Q2菌落；D:對(duì)照組SG-15菌絲；E～G:處理組SG-15菌絲；H和I:青霉菌株Q2的分生孢子梗；J:青霉菌株Q2的分生孢子.a:對(duì)照組SG-15菌絲；b:菌絲內(nèi)部產(chǎn)生球狀物增多；c:菌絲隔膜消融；d:菌絲分支增多；f:菌絲細(xì)胞原生質(zhì)濃縮.處理組菌絲均變粗.g:孢梗莖；h:副枝；i:?；?；j:瓶梗；k:分生孢子。

圖2：培養(yǎng)12d時(shí)菌株Q2在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)圖。

圖3：菌株Q2固體培養(yǎng)物,A，培養(yǎng)時(shí)間為20天，B，培養(yǎng)時(shí)間為10天。

圖4：產(chǎn)紫青霉菌株Q2對(duì)苦瓜枯萎病防治效果(第2批)。

圖5a:菌株Q2基于18S rDNA區(qū)域的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析。

圖5b：菌株Q2基于β-微管蛋白基因區(qū)域的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析。

圖5c：菌株Q2基于鈣調(diào)蛋白基因區(qū)域的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所涉及的儀器、試劑、材料等，若無(wú)特別說(shuō)明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)儀器、試劑、材料等，可通過(guò)正規(guī)商業(yè)途徑獲得。下述實(shí)施例中所涉及的實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)方法等，若無(wú)特別說(shuō)明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)方法等。

實(shí)施例1：菌株的分離和鑒定

1.菌株的分離與篩選：

(1)菌種的分離

將從山東省泰安市山東農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)基地采集的黃瓜根際土采用土壤稀釋涂布平板法進(jìn)行分離，將土樣梯度稀釋后，取100μL稀釋度為10³、10⁴、10⁵、10⁶的稀釋液均勻的涂布在事先準(zhǔn)備好的PDA培養(yǎng)基平板上，置25℃恒溫培養(yǎng)，3d后逐日觀察，待有菌絲長(zhǎng)出時(shí)時(shí)，及時(shí)挑取菌絲塊轉(zhuǎn)移到新的PDA平板上繼續(xù)培養(yǎng)。待產(chǎn)生孢子時(shí)，進(jìn)行單孢分離純化，將純化好的菌株進(jìn)行編號(hào)，斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

PDA培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂17g、自來(lái)水1000ml。

(2)拮抗菌的篩選

將上述(1)單孢分離純化的菌株分別與苦瓜枯萎病病原菌Fusarium oxysporum f.sp.momordicae進(jìn)行對(duì)峙試驗(yàn)，采用兩點(diǎn)對(duì)峙同時(shí)接種，以不接Q2菌株為對(duì)照，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。

抑菌率＝(對(duì)照平板菌落直徑－對(duì)峙平板菌落直徑)/對(duì)照平板菌落直徑×100％。

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 菌株Q2對(duì)不同病原菌的抑菌率

選擇對(duì)苦瓜枯萎病病原菌具有較強(qiáng)拮抗活性的真菌菌株，編號(hào)為Q2，在4℃斜面保存。

2.菌株Q2的形態(tài)及生物學(xué)特性測(cè)定

(1)菌株Q2顯微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果

青霉菌株Q2的分生孢子梗發(fā)生于菌絲繩，孢梗莖，壁平滑，頂端不膨大；帚狀枝雙輪生，少量三輪生；梗基3-8個(gè)，8.0-13μm×2.3-3.0μm，披針狀，彼此緊貼近于平衡；瓶梗每輪3-6個(gè)，10-20μm×1.8-3.0μm，梗頸明顯；分生孢子呈現(xiàn)橢圓形，近乎圓形，大小為2.5-3.0μm×2.0-2.5μm，壁平滑；分生孢子鏈較疏松，近于圓柱狀，結(jié)果如圖1所示。

(2)生物學(xué)特性測(cè)定

不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響，試驗(yàn)設(shè)定9個(gè)培養(yǎng)基：(1)查氏培養(yǎng)基(Czapek agar,CA)：硝酸鈉3g、磷酸氫二鉀1g、硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.5g、氯化鉀0.5g、硫酸亞鐵0.01g、蔗糖30g、瓊脂20g、蒸餾水加至1000mL；(2)查氏酵母膏瓊脂培養(yǎng)基(Czapek yeast extract agar,CYA)：磷酸氫二鉀1g、查氏濃縮液10ml、酵母抽提物5g、蔗糖30g、瓊脂15g、蒸餾水加至1000ml；(3)燕麥瓊脂培養(yǎng)基(Oat meal agar,OA)：商品燕麥片20g、瓊脂20g、蒸餾水加至1000ml；(4)馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)；(5)玉米粉瓊脂培養(yǎng)基(Corn meat agar,CMA)：玉米粉200g、瓊脂20g、蒸餾水加至1000mL；(6)馬丁培養(yǎng)基(Martin media,MM)：蛋白胨5g、葡萄糖10g、磷酸二氫鉀1g、硫酸鎂0.5g、瓊脂20g、三萬(wàn)分之一的孟加拉紅水溶液100ml、蒸餾水加至1000ml；(7)薩氏蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(Sabouraud sucrose agar,SSA)：蔗糖5g、蛋白胨5g、磷酸氫二鉀5g、瓊脂20g、蒸餾水加至1000ml；(8)薩氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Sabouraud dextrose agar,SDA)：葡萄糖5g、蛋白胨5g、磷酸氫二鉀5g、瓊脂20g、蒸餾水加至1000ml；(9)薩氏麥芽糖瓊脂培養(yǎng)基(Sabouraud maltose agar,SMA)：麥芽糖5g、蛋白胨5g、磷酸氫二鉀5g、瓊脂20g、蒸餾水加至1000ml。取供試菌株Q2菌落邊緣直徑5mm的菌餅移植到培養(yǎng)基平板中央，每個(gè)處理重復(fù)5次，25℃條件下培養(yǎng)，觀察不同培養(yǎng)基對(duì)培養(yǎng)性狀的影響。

以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以相同含碳量的淀粉、乳糖、麥芽糖、蔗糖、D-果糖替換葡萄糖，配制成含有不同碳源的培養(yǎng)基；以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入牛肉膏、尿素、蛋白胨、氯化銨、硫酸銨、硝酸銨，配制成不同氮源的培養(yǎng)基。接入5mm直徑菌餅，每個(gè)處理重復(fù)5次。置于25℃恒溫黑暗培養(yǎng)，觀察不同碳源和氮源對(duì)培養(yǎng)性狀的影響。

以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在無(wú)菌條件下，將PDA培養(yǎng)基用NaOH溶液和HCl溶液分別調(diào)pH值至4、5、6、7、8、9、10。接入直徑為5mm的菌餅，每個(gè)處理重復(fù)5次，25℃下恒溫培養(yǎng)，觀察不同pH條件下的培養(yǎng)性狀。

不同溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響，將直徑為5mm菌餅接種到PDA培養(yǎng)基平板上，分別置于15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃等8個(gè)不同溫度梯度下培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)5次，觀察不同溫度條件下的培養(yǎng)性狀。

試驗(yàn)結(jié)果(如圖2所示)表明：產(chǎn)紫青霉菌株Q2在CA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)12d，直徑45-55mm；菌落平坦，有2道不明顯的同心環(huán)紋，質(zhì)地繩狀兼絮狀；分生孢子結(jié)構(gòu)在菌落面大量產(chǎn)生，分布均勻，分生孢子面灰綠色；菌絲體幼齡時(shí)白色，成熟時(shí)呈現(xiàn)淡黃色；反面紫紅色，使用甲醇提取可溶性色素呈現(xiàn)紫紅色。菌落在CYA培養(yǎng)基上25℃培養(yǎng)12d，直徑75-80mm，菌落平坦，有多道明顯的同心環(huán)紋，質(zhì)地繩狀兼絮狀；分生孢子結(jié)構(gòu)在菌落面大量產(chǎn)生，分布均勻，分生孢子面藍(lán)綠色；菌絲體淡黃色；反面黃色。產(chǎn)紫青霉菌株Q2，在OA培養(yǎng)基上菌落有少量放射狀皺紋，分生孢子結(jié)構(gòu)分布不均勻；在PDA、CMA、OA培養(yǎng)基上菌絲體幼時(shí)白色，成熟時(shí)橘黃色；在SSA、SDA、SMA培養(yǎng)基上培養(yǎng)12d后不產(chǎn)孢，培養(yǎng)30d后在菌落面大量產(chǎn)孢，分生孢子分布均勻，分生孢子面暗橄欖綠色。在CYA和OA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速率最快，12d時(shí)菌落直徑可達(dá)76.68mm和76.22mm，與其他培養(yǎng)基的差異性顯著。

該菌株在以淀粉、乳糖、麥芽糖、蔗糖、D-果糖和葡萄糖為碳源，以牛肉膏、尿素、蛋白胨、氯化銨、硫酸銨和硝酸銨為氮源的培養(yǎng)基中都能夠生長(zhǎng)；其中最適合其生長(zhǎng)的碳氮源分別為葡萄糖和牛肉膏，15d時(shí)菌落直徑為67.03mm和64.73mm，與其它處理差異性顯著。在初始pH值4-10的范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，但在不同pH值下的菌落生長(zhǎng)差異顯著；pH值為7時(shí)菌落生長(zhǎng)最快，15d時(shí)菌落直徑為70.85mm，隨pH值的升高或降低，菌落生長(zhǎng)逐漸減小。在15-50℃的溫度范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)。但在不同的溫度條件下，菌落生長(zhǎng)速率明顯不同。35℃時(shí)菌落生長(zhǎng)最快，培養(yǎng)15d時(shí)菌落直徑可達(dá)77.21mm，與其它溫度下的菌落生長(zhǎng)差異顯著，25-30℃時(shí)菌落生長(zhǎng)次之，培養(yǎng)15d時(shí)菌落直徑可達(dá)67.29-69.04mm，20℃以下和45℃以上菌絲生長(zhǎng)較差，在高溫50℃時(shí)菌絲仍能生長(zhǎng)，說(shuō)明菌株Q2為一株耐高溫菌株。

3.菌株Q2的分子生物學(xué)鑒定

將菌株Q2接于PDA培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)7d，用無(wú)菌手術(shù)刀，刮下0.5g菌絲，研磨，用DNA試劑盒法提取真菌的基因組DNA。采用rDNA-ITS擴(kuò)增引物序列為：正向引物ITS1：(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)，反向引物ITS4：(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)；Beta-tubulin蛋白擴(kuò)增引物序列(Glass&Donaldson,1995)為：正向引物Bt2a：(5’-GGTAACCAAATCGGTG CTGCTTT C-3’)反向引物Bt2b：(5’-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3’)鈣調(diào)蛋白基因擴(kuò)增引物序列(Wang Bo&Wang Long,2013)為：正向引物cmdAD1：(5’-GCCGACTCTTTGACTGAAGAGC-3’)，反向引物cmdQ1：(5’-GCATCATGAGCTGGACGAACTC-3’)。PCR擴(kuò)增條件為：95℃4min；94℃1min，50℃1min，72℃2min，34個(gè)循環(huán)；72℃10min。將18S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后測(cè)序。

Q2的18S rDNA中的ITS區(qū)域核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

Q2的Beta-tubulin區(qū)域核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

Q2的CaM區(qū)域核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示。

將測(cè)序所得序列通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，菌株Q2與產(chǎn)紫青霉(Penicillium purpureogenum)相似度為99％。通過(guò)MEGA 6.06軟件對(duì)Q2菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析(圖5)。最終鑒定結(jié)果菌株Q2為青霉屬的產(chǎn)紫青霉(Penicillium purpureogenum)。

防治苦瓜枯萎病的菌株Q2，為青霉屬產(chǎn)紫青霉(Penicillium purpureogenum)，分類(lèi)命名為產(chǎn)紫青霉(Penicillium purpureogenum)；于2016年10月25日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC，地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，菌種保藏號(hào)為CGMCC NO.13165。

實(shí)施例2：菌株Q2生防制劑的制備

具體制備方法如下：

1.種子液的制備

將4℃下保存在試管斜面上的實(shí)施例1分離保藏的產(chǎn)紫青霉菌(Penicillium purpureogenum)Q2菌株(CGMCC No.13165)的菌種，轉(zhuǎn)移到新鮮的PDA培養(yǎng)基平板上活化，于25℃培養(yǎng)5d長(zhǎng)出新鮮菌絲后，再轉(zhuǎn)移到大批新鮮的PDA平板上，于25℃培養(yǎng)10d。待產(chǎn)生孢后，無(wú)菌條件下刮取下來(lái)，用無(wú)菌水制備成濃度為1×10⁸cfu/ml的孢子懸浮液即為菌株Q2種子液。

PDA培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000ml。

2.生防制劑及抑菌活性物質(zhì)的制備

將5mL Q2種子液接種到滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)料中，發(fā)酵培養(yǎng)料的配方為：麥粒89％、麥麩10％、石膏1％(均為質(zhì)量百分比)，28℃、培養(yǎng)12d。使用325目的篩網(wǎng)收集孢子與麥麩等復(fù)混，即為Q2固體生防制劑。

實(shí)施例3：產(chǎn)紫青霉菌株Q2在防治苦瓜枯萎病中的應(yīng)用

1.試驗(yàn)方法：

試驗(yàn)設(shè)兩個(gè)處理，分別為：

(1)處理組(Q2)：在33℃、200r/min的搖床中，將苦瓜種子放置在孢子懸浮液中浸種17h，擦干種子表面水分后，放在滅菌的紗布中，33℃恒溫催芽48-64h，用菌株Q2的孢子懸浮液保濕。

(2)對(duì)照組(CK)：苦瓜種子處理方法和條件與處理組相同，浸種和保濕用無(wú)菌水代替孢子懸液。

催芽后，將露白的種子播種于裝有無(wú)菌土的育苗盤(pán)中，育苗在光照培養(yǎng)箱中(光照16h,28℃,黑暗8h,22℃)進(jìn)行，常規(guī)水分管理。

防病試驗(yàn)在溫室中進(jìn)行，選取生長(zhǎng)良好，3-4葉期的苦瓜苗移栽，并參照陳振東等(2014)的傷根接種法接種病原菌，從育苗盤(pán)挖出苦瓜幼苗，剪掉幼苗部分須根，接種20ml配制好的1×10⁶cfu/mL的Fom孢子懸浮液，每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)30株幼苗。接種病原菌后，處理組(Q2)每株再澆灌25mL菌株Q2菌懸液，對(duì)照組(CK)每株澆灌25mL滅菌水。15d后調(diào)查苦瓜苗發(fā)病情況與病情指數(shù)，計(jì)算防治效果。試驗(yàn)重復(fù)4次。

病情指數(shù)＝Σ(各級(jí)代表值×各級(jí)病株數(shù))/(最高級(jí)代表值×總株數(shù))×100

防治效果(％)＝(對(duì)照組病情指數(shù)－處理組病情指數(shù))/對(duì)照組病情指數(shù)×100

接種15d后調(diào)查苦瓜枯萎病發(fā)病情況。病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，無(wú)病癥；1級(jí)，子葉發(fā)黃；3級(jí)，子葉變黃且邊緣皺縮，真葉正常；5級(jí)，子葉皺縮枯死，部分真葉發(fā)黃；7級(jí)，真葉發(fā)黃，部分葉片黃化或停止生長(zhǎng)；9級(jí)，全株葉片黃化萎蔫或枯死。

2.試驗(yàn)結(jié)果：

溫室盆栽防病試驗(yàn)結(jié)果表明，產(chǎn)紫青霉菌株Q2對(duì)苦瓜枯萎病的防治效果明顯(結(jié)果見(jiàn)表2和圖4)。經(jīng)Q2孢子懸浮液處理后的苦瓜幼苗，再接種Fom孢子懸浮液，可明顯降低苦瓜枯萎病的發(fā)病率與病情指數(shù)，防治效果可達(dá)到52.41-68.19％，且苦瓜幼苗發(fā)病時(shí)間比對(duì)照組植株較晚。說(shuō)明經(jīng)Q2孢子懸浮液處理后的苦瓜幼苗，可增強(qiáng)苦瓜幼苗對(duì)枯萎病的抗病能力。

表2 菌株Q2對(duì)苦瓜枯萎病的防治效果

實(shí)施例4：菌株Q2對(duì)苦瓜苗的促生作用

1.試驗(yàn)方法：

試驗(yàn)分為兩個(gè)處理：處理組(Q2)與對(duì)照組(CK)，選取生長(zhǎng)均一的2-3葉期的苦瓜幼苗，每一重復(fù)5株，處理組穴施1×10⁷cfu/g的菌株Q2生防制劑(實(shí)施例2制備)2g，對(duì)照組添加2g麥麩，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，40d后觀察植株的生長(zhǎng)狀況，并測(cè)量株高和鮮重、干重和促生效應(yīng)。

促生效應(yīng)(％)＝(處理組干重－對(duì)照組干重)/對(duì)照組干重×100

2.試驗(yàn)結(jié)果：

菌株Q2對(duì)苦瓜苗的促生作用結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 菌株Q2生防制劑對(duì)苦瓜的促生效果

實(shí)施例5：菌株Q2發(fā)酵粗提物對(duì)苦瓜枯萎病病原菌的抑菌活性

1.試驗(yàn)方法：

將菌株Q2菌絲餅接種于PDB培養(yǎng)液中，28℃振蕩培養(yǎng)15d后，過(guò)濾菌絲，得發(fā)酵過(guò)濾液和菌絲體備用。濾液和菌絲體分別用乙酸乙酯和甲醇萃取2次，萃取液分別用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸餾，得Q2發(fā)酵粗產(chǎn)物。將粗產(chǎn)物稀釋與PDA培養(yǎng)基混合，分別配制成含粗產(chǎn)物為10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、80μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的平板，以不含粗產(chǎn)物的為對(duì)照(CK)，在平板中心接種病原菌菌絲餅，待對(duì)照長(zhǎng)滿皿后，分別測(cè)量病原菌的菌落直徑，計(jì)算抑菌率。

抑菌率(％)＝(對(duì)照組菌落直徑－處理組菌落直徑)/對(duì)照組菌落直徑×100

2.試驗(yàn)結(jié)果：

菌株Q2發(fā)酵粗提物對(duì)苦瓜枯萎病病原菌的抑菌結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 Q2發(fā)酵粗產(chǎn)物對(duì)病原菌抑制效果

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)的技術(shù)人員在本發(fā)明批露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 一株防治苦瓜枯萎病的拮抗真菌及其應(yīng)用

<130> 2016

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 585

<212> DNA

<213> 產(chǎn)紫青霉 (Penicillium purpureogenum)

<400> 1

cttccgtagg gtgaacctgc ggaaggatca ttaccgagtg agggcccctc gcggcccaac 60

ctcccaccct tgtctccaac acctgttgct tcggcgggcc caccggggcc acccggtcgc 120

cgggggacat ccgtccccgg gcccgcgccc gccgaggcgc tctgtgaacc ctgatgaaga 180

tgggctgtct gagtgatatg aaaattgtca aaactttcaa caatggatct cttggttccg 240

gcatcgatga agaacgcagc gaaatgcgat aagtaatgtg aattgcagaa ttccgtgaat 300

catcgaatct ttgaacgcac attgcgcccc ctggcattcc ggggggcatg cctgtccgag 360

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<212> DNA

<213> 產(chǎn)紫青霉 (Penicillium purpureogenum)

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taccctccag gtgagtgacc cttggcccag ttgttaccag caccggactg accgaaaaca 60

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<212> DNA

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