本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域中對鏈核盤菌具有抑制活性的重組山岡單胞菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

由鏈核盤菌(Monilinia spp.)引起的褐腐病是桃生產(chǎn)中最重要的病害之一，也是世界范圍內(nèi)核果類最重要的采后病害。此病在采前、采后及貯藏運輸期均可造成大量減產(chǎn)，采后尤為嚴(yán)重，在歐美損失高達(dá)59-90％。我國桃產(chǎn)量在1000萬噸以上，為僅次于蘋果的第二大水果。調(diào)查表明，北京地區(qū)此病能夠造成貯藏庫果實年損失近1/4，出庫后爛果率高達(dá)84.6-100％。迄今為止，化學(xué)防治是控制桃褐腐病的主要手段，今年桃褐腐病生產(chǎn)上常用的桃褐腐化學(xué)殺蟲劑產(chǎn)生了抗藥性，使得此病的防治受到了極大的威脅；此外，由于化學(xué)藥劑所造成的環(huán)境污染、食品安全和人類健康問題，綠色防控已經(jīng)逐漸成為熱點。微生物制劑具有靶標(biāo)特異性強(qiáng)、對人畜安全、環(huán)境兼容等優(yōu)點，是非常理想的化學(xué)藥劑代替品。

草甸山崗(岡)單胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004是從西藏林芝色季拉山海拔4530m高山草甸土壤中分離得到的對桃褐腐病菌具有特異的抑菌作用的天然菌株(CN 104004680B)，為了進(jìn)一步提高該菌株的生防活性，開發(fā)防效更好的桃褐腐生防制劑，需要研發(fā)抗菌活性更高的新菌株。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的一個技術(shù)問題是如何構(gòu)建對植物褐腐病具有更高抑菌活性的菌株。

為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了重組山岡(崗)單胞菌。

本發(fā)明所提供的重組山岡(崗)單胞菌，通過賦予受體山岡(崗)單胞菌血紅蛋白活性來制備；所述受體山岡(崗)單胞菌和所述重組山岡(崗)單胞菌對鏈核盤菌具有抑制活性，在抑制鏈核盤菌的活性上，所述重組山岡(崗)單胞菌高于所述受體山岡(崗)單胞菌。

上述重組山岡單胞菌中，所述受體山岡單胞菌可為不具有血紅蛋白活性的山岡(崗)單胞菌。

上述重組山岡單胞菌中，所述賦予受體山岡單胞菌血紅蛋白活性通過將血紅蛋白的編碼基因?qū)胨鍪荏w山岡單胞菌中實現(xiàn)。

上述重組山岡單胞菌中，所述血紅蛋白可為如下A1)或A2)的蛋白質(zhì)：

A1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.1的蛋白質(zhì)；

A2)將序列表中SEQ ID No.1中的一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有血紅蛋白活性的由A1)衍生的蛋白質(zhì)。

其中，SEQ ID No.1由146個氨基酸殘基組成。

上述重組山岡單胞菌中，所述受體山岡單胞菌可為草甸山崗(岡)單胞菌(Collimonas pratensis),其菌株號為JZB120004，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC No.9193。

上述重組山岡單胞菌中，所述血紅蛋白的編碼基因可為下述A11)-A13)中的任一種DNA分子：

A11)編碼序列為序列表中SEQ ID No.2的cDNA分子或基因組DNA；

A12)在嚴(yán)格條件下與A11)限定的DNA分子雜交且編碼所述血紅蛋白的cDNA分子或基因組DNA；

A13)與A11)或A12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且編碼所述血紅蛋白的cDNA分子或基因組DNA。

其中，SEQ ID No.2由441個核苷酸組成。

上述重組山岡單胞菌中，所述鏈核盤菌可為植物褐腐病菌。所述植物的果實為核果，如桃。植物褐腐病菌具體可為美澳型核果鏈核盤菌(Monilinia fructicola)。

上述重組山岡單胞菌中，所述重組山岡(崗)單胞菌可為草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)，其菌株號為ZV261，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC No.13015。

為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了含有所述重組山岡(崗)單胞菌或/和所述重組山岡(崗)單胞菌的代謝物的菌劑，所述菌劑對鏈核盤菌具有抑制活性。。

上述菌劑的活性成分可為所述重組山岡(崗)單胞菌或/和所述重組山岡(崗)單胞菌的代謝物，上述菌劑的活性成分還可含有其他生物成分或非生物成分，上述菌劑的其他活性成分本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)對鏈核盤菌的抑制效果確定。

所述菌劑中，除所述活性成分外，還含有載體。所述載體可為農(nóng)藥領(lǐng)域常用的且在生物學(xué)上是惰性的載體。所述載體可為固體載體或液體載體；所述固體載體可為礦物材料、植物材料或高分子化合物；所述礦物材料可為粘土、滑石、高嶺土、蒙脫石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一種；所述植物材料可為玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一種；所述高分子化合物可為聚乙烯醇或/和聚二醇；所述液體載體可為有機(jī)溶劑、植物油、礦物油或水；所述有機(jī)溶劑可為癸烷或/和十二烷。

所述菌劑的劑型可為多種劑型，如液劑、乳劑、懸浮劑、粉劑、顆粒劑、可濕性粉劑或水分散粒劑。

根據(jù)需要，所述菌劑中還可添加表面活性劑(如吐溫20、吐溫80等)、粘合劑、穩(wěn)定劑(如抗氧化劑)、pH調(diào)節(jié)劑等。

上文中，所述重組山岡(崗)單胞菌的代謝物可從所述重組山岡(崗)單胞菌的發(fā)酵液中獲得。所述重組山岡(崗)單胞菌的代謝物具體可按照如下方法制備：在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述重組山岡(崗)單胞菌，除去液體培養(yǎng)物(發(fā)酵液)中的所述重組山岡(崗)單胞菌即得到所述重組山岡(崗)單胞菌的代謝物。

本發(fā)明還提供了構(gòu)建上述重組山岡單胞菌的方法。

本發(fā)明所提供的構(gòu)建重組山岡單胞菌的方法，包括將血紅蛋白的編碼基因?qū)胧荏w山岡單胞菌中，得到抑制鏈核盤菌的活性高于所述受體山岡單胞菌的重組山岡單胞菌。

上述方法中，所述血紅蛋白可為如下A1)或A2)的蛋白質(zhì)：

A1)氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.1的蛋白質(zhì)；

A2)將序列表中SEQ ID No.1中的一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有血紅蛋白活性的由A1)衍生的蛋白質(zhì)。

上述方法中，所述受體山岡單胞菌可為草甸山崗(岡)單胞菌(Collimonas pratensis),其菌株號為JZB120004，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC No.9193。

上述方法中，所述血紅蛋白的編碼基因為下述A11)-A13)中的任一種DNA分子：

A11)編碼序列為序列表中SEQ ID No.2的cDNA分子或基因組DNA；

A12)在嚴(yán)格條件下與A11)限定的DNA分子雜交且編碼所述血紅蛋白的cDNA分子或基因組DNA；

A13)與A11)或A12)限定的DNA分子具有75％以上的同一性且編碼所述血紅蛋白的cDNA分子或基因組DNA。

上述方法中，所述鏈核盤菌可為植物褐腐病菌。所述植物的果實為核果，如桃。植物褐腐病菌具體可為美澳型核果鏈核盤菌(Monilinia fructicola)。

上述方法中，所述重組山岡(崗)單胞菌可為草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)，其菌株號為ZV261，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC No.13015。在下文中簡稱草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)ZV261。

上述重組山岡(崗)單胞菌或上述菌劑的下述任一應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：

A)上述重組山岡(崗)單胞菌或上述菌劑在制備植物褐腐病菌抑制劑中的應(yīng)用；

B)上述重組山岡(崗)單胞菌或上述菌劑在抑制植物褐腐病菌中的應(yīng)用；

C)上述重組山岡(崗)單胞菌或上述菌劑在制備植物褐腐病抑制劑中的應(yīng)用；

D)上述重組山岡(崗)單胞菌或上述菌劑在抑制植物褐腐病中的應(yīng)用。

上述應(yīng)用中，所述植物的果實為核果，如桃。所述植物褐腐病菌具體可為美澳型核果鏈核盤菌(Monilinia fructicola)。

實驗證明，重組山岡(崗)單胞菌(草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)ZV261)具有比野生型山岡單胞菌(草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004)更高的抗菌活性，重組山岡(崗)單胞菌對桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)的抑菌活性是野生型山岡單胞菌的2.3倍。本發(fā)明的重組山岡單胞菌抑菌能力顯著提高，可以應(yīng)用于桃褐腐病生防制劑開發(fā)中。

生物材料保藏說明

分類命名：草甸山崗單胞菌(Collimonas pratensis)

菌株編號：ZV261

保藏機(jī)構(gòu)：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心

保藏機(jī)構(gòu)簡稱：CGMCC

地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼：100101

保藏日期：2016年9月19日

保藏中心登記入冊編號：CGMCC No.13015

附圖說明

圖1為血紅蛋白基因表達(dá)載體pRK415-vhb的HindIII和BamHI酶切結(jié)果。

其中，泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為pRK415-vhb。

圖2為CO差光譜法分析山岡單胞菌(Collimonas pratensis)ZV261，山岡單胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004CGMCC No.9193血紅蛋白活性。

其中，位于下方的曲線是草甸山崗(岡)單胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004CGMCC No.9193，位于上方的曲線是草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)ZV261。

圖3為草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)ZV261和草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004的抑菌活性比較。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中的廣宿主表達(dá)載體pRK415(NTS Keen，SD Tamaki，D Kobayashi，D Trollinger.Improved broad-host-range vectors for DNA cloning in Gram-negative bacteria.《Gene》,1988,70(1):191-7.)公眾可從北京市農(nóng)林科學(xué)院獲得，以重復(fù)本申請實驗。

下述實施例中的大腸桿菌S17-1(E.coli S17-1)(Simon R,Priefer U,Puhler A(1983)A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering:transposon mutagenesis in gram negative bacteria.Bio-Technology 1:784–791.)公眾可從北京市農(nóng)林科學(xué)院獲得，以重復(fù)本申請實驗。

下述實施例中的病原菌桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)(劉霆，陶萬強(qiáng)，王合，花玉鵬，劉偉成。拮抗菌A02代謝產(chǎn)物對幾種果樹病害的活性.北方園藝,2011,17：13-16)公眾可從北京市農(nóng)林科學(xué)院獲得，以重復(fù)本申請實驗。

下述實施例中的草甸山崗(岡)單胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004已于2014年5月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其登記入冊編號為CGMCC No.9193，為CN 104004680B中已授權(quán)的生物材料。

下述實施例中的pRK404-vhb(文瑩，李季倫.透明顫菌血紅蛋白基因在阿維鏈霉菌中的表達(dá).微生物學(xué)報.40卷1期.2000年2月)公眾可從北京市農(nóng)林科學(xué)院獲得，以重復(fù)本申請實驗。

實施例1、構(gòu)建抗鏈核盤菌的重組山岡單胞菌

1、血紅蛋白基因表達(dá)載體pRK415-vhb的構(gòu)建

本實施例構(gòu)建的血紅蛋白基因表達(dá)載體名稱為pRK415-vhb，該載體中含有血紅蛋白基因及自身啟動子約1.4kb的序列。

pRK415-vhb的具體構(gòu)建方法如下：

用HindIII和BamHI酶切pRK404-vhb,得到含vhb基因及其自身啟動子的1.4kb片段，將它連接到經(jīng)同樣酶切的pRK415上，得到含有血紅蛋白基因(SEQ ID No.2)及自身啟動子的重組載體，將該重組載體命名為pRK415-vhb。pRK415-vhb表達(dá)SEQ IDNo.1所示的血紅蛋白(名稱為vhb)。

pRK415-vhb轉(zhuǎn)化大腸桿菌S17-1，以四環(huán)素抗性篩選從而獲得攜帶血紅蛋白基因的轉(zhuǎn)化子，該轉(zhuǎn)化子以p1(5'-ATGTTAGACCAGCAAACCA-3)和p2(5'-TTATTCAACCGCTTGAGCGT-3')為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到441bp的血紅蛋白ORF片段，用HindIII和BamHI酶切pRK415-vhb得到10.5kb的pRK415質(zhì)粒片段及1.4kb的血紅蛋白基因及自身啟動子片段(圖1)，從而確定血紅蛋白基因片段正確連接到pRK415載體中。

2、利用pRK415-vhb將血紅蛋白基因?qū)氩莸樯綄鶈伟?Collimonas pratensis)JZB120004得到具有血紅蛋白活性的重組山岡單胞菌

將pRK415-vhb載體轉(zhuǎn)化E.coli S17-1，通過兩親接合的方法，轉(zhuǎn)化山岡單胞菌JZB120004，通過四環(huán)素抗性篩選得到陽性轉(zhuǎn)化子，PCR驗證得到正確的轉(zhuǎn)化子。具體轉(zhuǎn)化方法如下：

1)將pRK415-vhb載體轉(zhuǎn)化去甲基化E.coli S17-1

通過熱激法將pRK415-vhb載體導(dǎo)入E.coliS17-1并經(jīng)過12.5μg/ml四環(huán)素抗性篩選得到轉(zhuǎn)入pRK415-vhb載體的重組菌E.coliS17-1/pRK415-vhb。

2)兩親接合構(gòu)建抗桃褐腐病的重組山岡單胞菌

參考文獻(xiàn)(Bierman M et al.1992)進(jìn)行兩親接合，具體方法如下：

(1)將重組菌E.coliS17-1/pRK415-vhb接種到含有四環(huán)素抗性的LB液體培養(yǎng)基，37℃，200rpm，培養(yǎng)過夜，次日早晨按1％的接種量接到新鮮LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.4-0.6，收集菌液，4℃，4000rpm，離心2min，棄上清，用20mL冰冷的純的LB培養(yǎng)液重懸沉淀，4℃，4000rpm，離心2min，棄上清，目的是洗去抗生素。用2mL冰冷的純的LB培養(yǎng)液重懸沉淀。(2)將PDA斜面生長3天的草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004接種到改良King’B(改良KB培養(yǎng)基)(Atlas R.M.1995.Handbook of media for environmental microbiology.Boca Raton FL:CRC)培養(yǎng)基上，25℃，200rpm，培養(yǎng)過夜，次日早晨按1％的接種量接到新鮮改良KB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.8-1.0，收集菌液，4℃，4000rpm，離心2min，棄上清，用20mL無菌水反復(fù)清洗菌體，目的是洗去細(xì)菌表面粘液。(3)將步驟(1)和(2)的菌體混合均勻，點到固體改良KB培養(yǎng)基上4-6小時，稀釋涂布在含有四環(huán)素抗性的固體改良KB培養(yǎng)基上。1天后挑取單菌落到新的加入上述抗生素溶液的改良KB平板上。挑取在該改良KB平板上的菌落用上述p1和p2進(jìn)行PCR，將其中一株可以得到0.44kb的擴(kuò)增產(chǎn)物的重組菌命名為草甸山岡(崗)單胞菌(Collimonas pratensis)ZV261。草甸山岡(崗)單胞菌(Collimonas pratensis)ZV261已于2016年9月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏中心登記入冊編號：CGMCC No.13015，下文簡稱草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)ZV261。

3)草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)ZV261的血紅蛋白活性

將野生型菌株-草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004和重組菌株-草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)ZV261分別接種到改良KB固體培養(yǎng)基2天后轉(zhuǎn)接于改良KB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天，進(jìn)行CO差光譜法分析血紅蛋白活性。

具體方法如下：

培養(yǎng)3天的細(xì)胞培養(yǎng)液,以4 000-6 000r/min離心10min,收集細(xì)胞。將離心后的細(xì)胞重懸于磷酸鹽緩沖液(100mmol/L,pH 7.5)中,超聲波破碎3min后，分別加入Na₂S₂O₄或NADH進(jìn)行還原處理,然后將CO鼓泡入試樣端一定時間,在分光光度計上掃描400～470nm的差光譜。實驗結(jié)果表明在菌株ZV261中表達(dá)出的VHb蛋白在420nm處有明顯吸收峰,草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)ZV261具有血紅蛋白活性，而野生型菌株-草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004的蛋白粗提物中沒有出現(xiàn)特征性吸收峰，野生型菌株-草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004不具有血紅蛋白活性(圖2)。

本實施例構(gòu)建的草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)ZV261具有血紅蛋白活性，為抗鏈核盤菌的重組山岡單胞菌。

實施例2、草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)ZV261(重組山岡單胞菌)的抑菌活性高于草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004(野生型山岡單胞菌)

1、植物褐腐病抑制劑的制備

1.1草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)ZV261發(fā)酵液的制備

取一環(huán)草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)ZV261，接種到裝有5mL改良KB液體培養(yǎng)基的試管中，在26℃培養(yǎng)至OD_600nm為0.6(以未接菌的改良KB液體培養(yǎng)基為空白對照)，作為種子液，按照2％(體積比)接種量接入裝有200mL改良KB液體培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，在改良KB液體培養(yǎng)基中在26℃培養(yǎng)3天，得到草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)ZV261發(fā)酵液。

1.2草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004發(fā)酵液的制備

與1.1的區(qū)別僅在于將草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)ZV261替換為草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004，具體方法如下：

取一環(huán)草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004，接種到裝有5mL改良KB液體培養(yǎng)基的試管中，在26℃培養(yǎng)至OD_600nm為0.6(以未接菌的改良KB液體培養(yǎng)基為空白對照)，作為種子液，按照2％(體積比)接種量接入裝有200mL改良KB液體培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，在改良KB液體培養(yǎng)基中在26℃培養(yǎng)3天，得到草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004發(fā)酵液。

1.3植物褐腐病抑制劑的制備

將1.1的草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)ZV261發(fā)酵液和1.2的草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004發(fā)酵液均分別5000rpm/min離心10－15min，上清液用0.45μm的無菌微孔濾膜過濾，收集濾液(該濾液中無菌體)，分別得到草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)ZV261無菌濾液和草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004無菌濾液，這兩種無菌濾液即為植物褐腐病抑制劑。

2、抑菌活性試驗

供試靶標(biāo)病原菌為桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)。

刮取PDA平板上培養(yǎng)產(chǎn)生的桃褐腐病菌(M.fructicola)的分生孢子，用無菌水制成菌懸液，均勻地涂于新制備的PDA平板上，置超凈工作臺內(nèi)吹干；用直徑7mm的無菌打孔器在平板四周對稱位置打孔，然后每孔中注入1.3的草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)ZV261無菌濾液100μl或1.3的草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004無菌濾液100μl,28℃下培養(yǎng)3天，十字交叉法測量抑菌圈直徑。每處理十個重復(fù)。

實驗結(jié)果表明草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)ZV261無菌濾液和草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004無菌濾液在PDA平板上對桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)均產(chǎn)生明顯的抑菌圈，草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)ZV261無菌濾液對桃褐腐病菌(M.fructicola)抑菌圈直徑為1.8cm±0.08cm，草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004無菌濾液對桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)抑菌圈直徑為0.8cm±0.06cm(圖3)。說明草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)ZV261無菌濾液對桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)的抑菌圈直徑是草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004無菌濾液對桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)的抑菌圈直徑的2.3倍；重組山岡(崗)單胞菌(草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)ZV261)具有比野生型山岡單胞菌(草甸山岡單胞菌(Collimonas pratensis)JZB120004更高的抗菌活性，重組山岡(崗)單胞菌對桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)的抑菌活性是野生型山岡單胞菌的2.3倍。

<110> 北京市農(nóng)林科學(xué)院

<120> 對鏈核盤菌具有抑制活性的重組山岡單胞菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 146

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

Met Leu Asp Gln Gln Thr Ile Asn Ile Ile Lys Ala Thr Val Pro Val

1 5 10 15

Leu Lys Glu His Gly Val Thr Ile Thr Thr Thr Phe Tyr Lys Asn Leu

20 25 30

Phe Ala Lys His Pro Glu Val Arg Pro Leu Phe Asp Met Gly Arg Gln

35 40 45

Glu Ser Leu Glu Gln Pro Lys Ala Leu Ala Met Thr Val Leu Ala Ala

50 55 60

Ala Gln Asn Ile Glu Asn Leu Pro Ala Ile Leu Pro Ala Val Lys Lys

65 70 75 80

Ile Ala Val Lys His Cys Gln Ala Gly Val Ala Ala Ala His Tyr Pro

85 90 95

Ile Val Gly Gln Glu Leu Leu Gly Ala Ile Lys Glu Val Leu Gly Asp

100 105 110

Ala Ala Thr Asp Asp Ile Leu Asp Ala Trp Gly Lys Ala Tyr Gly Val

115 120 125

Ile Ala Asp Val Phe Ile Gln Val Glu Ala Asp Leu Tyr Ala Gln Ala

130 135 140

Val Glu

145

<210> 2

<211> 441

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

atgttagacc agcaaaccat taacatcatc aaagccactg ttcctgtatt gaaggagcat 60

ggcgttacca ttaccacgac tttttataaa aacttgtttg ccaaacaccc tgaagtacgt 120

cctttgtttg atatgggtcg ccaagaatct ttggagcagc ctaaggcttt ggcgatgacg 180

gtattggcgg cagcgcaaaa cattgaaaat ttgccagcta ttttgcctgc ggtcaaaaaa 240

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