本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種腫瘤特異性抗原TSP70及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌和乳腺癌等腫瘤是當(dāng)今世界范圍內(nèi)最常見、惡性程度及死亡率高的惡性腫瘤。隨著人口持續(xù)增長和人口老齡化的加劇，加之生活方式、社會、經(jīng)濟(jì)、環(huán)境等變化，惡性腫瘤，尤其是肺癌的發(fā)病率和死亡率呈明顯上升趨勢。每年確診的肺癌病例約161萬，占惡性腫瘤的12.7％，肺癌相關(guān)死亡約138萬例，占癌癥相關(guān)死亡的18.2％。肺癌也是我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在我國大多數(shù)地區(qū)占第一位。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌總數(shù)的80％～85％，包括肺腺癌、肺鱗癌和大細(xì)胞肺癌等。然而，目前尚無理想的非小細(xì)胞肺癌等腫瘤的特異性標(biāo)志物。

單克隆抗體是尋找腫瘤相關(guān)抗原的重要工具。然而，單克隆抗體針對的并非某個(gè)蛋白質(zhì)的全序列，而是蛋白質(zhì)上由數(shù)個(gè)氨基酸或糖基組成抗原表位。抗原表位可以由蛋白質(zhì)上連續(xù)的數(shù)個(gè)氨基酸構(gòu)成，稱之為線性表位；也可以由蛋白質(zhì)序列上彼此不連續(xù)，但形成一定空間構(gòu)象的數(shù)個(gè)氨基酸構(gòu)成，稱之為構(gòu)象表位。最小的抗原表位只含有4～6個(gè)氨基酸殘基或糖基。由于不同的蛋白質(zhì)可以具有相同的抗原表位，因此單克隆抗體通常會對應(yīng)攜帶相同表位的多個(gè)蛋白質(zhì)。所以，從已知單克隆抗體無法直接推斷其所針對蛋白抗原的氨基酸序列。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌和乳腺癌等腫瘤的特異性抗原TSP70。

本發(fā)明的又一目的是提供該抗原的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的可通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種腫瘤特異性抗原TSP70，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述的腫瘤選自非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌和/或乳腺癌。TSP70蛋白是通過免疫親和層析的方法分離得到，測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果顯示其為一種尚未見報(bào)導(dǎo)的新蛋白。

所述的腫瘤抗原TSP70的氨基酸序列在其蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)分析其相應(yīng)配體的設(shè)計(jì)和篩選中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的腫瘤特異性抗原TSP70在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用；所述的腫瘤選自非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌和/或乳腺癌。

本發(fā)明所述的腫瘤特異性抗原TSP70優(yōu)選在制備治療非小細(xì)胞肺癌的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的腫瘤特異性抗原TSP70在制備非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌和乳腺癌等腫瘤診斷試劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的腫瘤特異性抗原TSP70優(yōu)選在制備非小細(xì)胞肺癌診斷試劑中的應(yīng)用。

一種腫瘤診斷試劑，含有本發(fā)明所述的腫瘤特異性抗原TTSP70；所述的腫瘤選自非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌和/或乳腺癌；優(yōu)選非小細(xì)胞肺癌。

一種治療或預(yù)防人腫瘤的藥物組合物，至少含有本發(fā)明所述的腫瘤特異性抗原TSP70；所述的腫瘤選自非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌和/或乳腺癌；優(yōu)選非小細(xì)胞肺癌。本發(fā)明所述的腫瘤特異性抗原TSP70能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，同適量的佐劑一起制備成預(yù)防腫瘤的藥物。

TSP70在腫瘤細(xì)胞中特異性高表達(dá)，并對腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用，因此TSP70在抗腫瘤藥物篩選中具有應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)，TSP70也可以作為抗癌藥物作用靶點(diǎn)。

與本發(fā)明所述的腫瘤抗原TSP70特異性結(jié)合的抗體。

所述的抗體優(yōu)選單克隆抗體或多克隆抗體。

有益效果：

本發(fā)明提供了新的一種非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌和乳腺癌等腫瘤特異性抗原TSP70，該抗原在人非小細(xì)胞肺癌等腫瘤中表達(dá)陽性率高，表達(dá)特異性也高，免疫電鏡證實(shí)TSP70蛋白位于細(xì)胞的胞膜、胞漿和胞核中；流式細(xì)胞分析與Tranwells實(shí)驗(yàn)表明TSP70具有抗細(xì)胞凋亡和促侵襲轉(zhuǎn)移的功能。該抗原既可作為標(biāo)準(zhǔn)品用于制備非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌和乳腺癌等腫瘤診斷試劑，也可用于制備治療或預(yù)防非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌和乳腺癌等腫瘤的藥物。

附圖說明

圖1純化的TSP70抗原的SDS-PAGE電泳結(jié)果

圖2 TSP70蛋白的Western blot結(jié)果

圖3免疫電鏡鑒定TSP70蛋白的亞細(xì)胞定位

圖4 TSP70抗細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞分析結(jié)果

圖5 TSP70促細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的Transwell檢測結(jié)果

A.TSP70處理組；B.對照組

圖6 TSP70作為ELISA標(biāo)準(zhǔn)品檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線

生物材料樣品的保藏信息

雜交瘤細(xì)胞株NM001-1于2011年8月31日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為武漢，武漢大學(xué)，保藏號為CCTCC NO：C201172。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1 TSP70蛋白的分離和純化

1.人肺癌細(xì)胞系SPC-A1細(xì)胞裂解液的制備

1)培養(yǎng)SPC-A1細(xì)胞，棄去SPC-A1細(xì)胞培養(yǎng)液，Hanks液洗2遍，胰酶消化2分鐘后，加培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15mL(或50mL)離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄上清；

2)預(yù)冷的PBS洗1遍細(xì)胞，1000rpm離心5分鐘；將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5mL EP管中，PBS洗，12000pm離心5分鐘；

3)將IP細(xì)胞裂解液提前置于冰上融解。取適量裂解液(50uL/10⁶細(xì)胞)，按1:100的比例加入100mM蛋白酶抑制劑PMSF、PHI和PI；

4)將裂解液加入細(xì)胞團(tuán)中，吹打混勻；

5)冰上孵育30分鐘，每5分鐘渦旋振蕩1次；

6)12000pm，4℃離心5分鐘；

7)將上清轉(zhuǎn)移至新的EP管，即為SCPA1細(xì)胞裂解液；

2.親和層析法純化TSP70蛋白

1)親和層析柱的平衡

以10倍柱體積的pH7.4、0.02mol/LPBS緩沖液緩慢沖洗包被NJ001抗體(制備方法見CN102391992A)的親和層析柱；

2)上樣

將柱中液體排空，夾閉流出管，取樣本SCP-A1細(xì)胞裂解液緩緩加入親和層析柱中，用加樣槍輕輕吹打混勻，放至4℃過夜；

3)洗去未結(jié)合的雜蛋白

以5倍柱體積的pH7.4、0.02mol/L PBS緩沖液沖洗親和層析柱；

以10倍柱體積的pH7.4、0.02mol/L PBS緩沖液(含0.5mol/L NaCl)沖洗親和層析柱；

4)洗脫目的TSP70蛋白

以5倍柱體積的0.01mol/L、pH2.5Gly-HCl Buffer洗脫目的蛋白，收集洗脫峰；

5)洗脫液的中和

將一定體積的0.2mol/L NaOH溶液加入洗脫液中的，使pH中和至7.0。

3.按照本實(shí)施例中步驟1的方法，分別使用胰腺癌細(xì)胞株SW1990、卵巢癌細(xì)胞株SK-OV-3和乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，也可制備胰腺癌、卵巢癌和乳腺癌細(xì)胞的裂解液，并按步驟2的方案通過親和層析的方法分別從胰腺癌、卵巢癌和乳腺癌細(xì)胞的裂解液中純化獲得TSP70蛋白。

實(shí)施例2 TSP70蛋白的SDS-PAGE電泳和Western blot鑒定

1 SDS-PAGE測定蛋白質(zhì)分子量

分離膠濃度為12％，濃縮膠濃度5％，樣品煮沸3min后加樣電泳，同時(shí)加入標(biāo)準(zhǔn)分子量作對照。開始電壓為80V，樣品濃縮成線進(jìn)入分離膠后加大到120V，總共電泳約2.5h，剝膠后考馬斯亮藍(lán)染色。電泳結(jié)果見圖1.電泳后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量和其相對遷移率在半對數(shù)坐標(biāo)紙上作分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)待測蛋白的相對遷移率從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查知其分子量為70Kda，結(jié)果見圖1。

2 Western blot鑒定

樣品經(jīng)SDS-PAGE后，將凝膠上蛋白條帶在80V下轉(zhuǎn)印2h，至硝酸纖維膜上。用1％BSA室溫封閉1h，加1.5mL PBST稀釋的NJ001單克隆抗體(1:1000)，室溫振蕩孵育2h，PBST洗滌后加入1.5mL酶標(biāo)二抗羊抗鼠IgG-HRP(1:2000)，室溫振蕩孵育2h。洗滌后加入1.5mL底物液反應(yīng)，化學(xué)發(fā)光顯影。結(jié)果如圖2所示，在70Kda處見一特異條帶。

實(shí)施例3 TSP70蛋白的氨基酸序列測定

1.用8mol/L尿素處理，拆分多肽鏈。

2.通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關(guān)系，確定多肽鏈的數(shù)目。

3.在8mol/L尿素存在下，用過量的β-巰基乙醇處理，使二硫鍵斷裂還原為巰基。

4.測定每條多肽鏈的氨基酸組成，并計(jì)算出氨基酸成分的分子比。

5.分析多肽鏈的N-末端和C-末端。

6.多肽鏈斷裂成多個(gè)肽段，并將其分離開來。

7.測定每個(gè)肽段的氨基酸順序。

8.確定肽段在多肽鏈中的次序，利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯(cuò)重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。

9.采用胃蛋白酶處理沒有斷開二硫鍵的多肽鏈，再利用雙向電泳技術(shù)分離出各個(gè)肽段，用過甲酸處理后，將可能含有二硫鍵的肽段進(jìn)行組成及順序分析，然后同其它方法分析的肽段進(jìn)行比較，確定二硫鍵的位置。

10.獲得TSP70蛋白質(zhì)序列，如SEQ ID NO.1所示。測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果顯示其為一種尚未見報(bào)導(dǎo)的新蛋白。且從胰腺癌、卵巢癌和乳腺癌中純化獲得的蛋白質(zhì)測序結(jié)果完全一致。

實(shí)施例4免疫電鏡鑒定TSP70蛋白的亞細(xì)胞定位

1.收集SPC-A1細(xì)胞，制作50～70nm超薄切片，切片載于鎳網(wǎng)或金網(wǎng)上；

2.將1％H₂O₂滴于蠟板上。鎳網(wǎng)的載切片面向下輕輕浮于液滴表面，室溫10分鐘。

3.PBS漂洗3次，每次5分鐘；

4.以1％BSA封閉，室溫孵育30分鐘；

5.滴加單抗NJ001，先置4℃，12小時(shí)；然后室溫1小時(shí)，使抗體充分滲透并結(jié)合。

6.PBS漂洗3次，每次5分鐘；

7.將載網(wǎng)置含1％BSA的PBS(pH 8.2)中：

8.滴加膠體金標(biāo)記的羊抗小鼠二抗，室溫孵育20―30分鐘；

9.雙蒸水洗3次，每次5分鐘；

10.電鏡觀察。結(jié)果見圖3，免疫電鏡證實(shí)TSP70蛋白位于細(xì)胞的胞膜、胞漿和胞核中。

實(shí)施例5 TSP70抗細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞分析

1.將終濃度為20ng/mL的TSP70蛋白加入SPC-A1細(xì)胞培養(yǎng)液中，作為實(shí)驗(yàn)組；取未加TSP70蛋白的SPC-A1細(xì)胞為對照。同時(shí)加入終濃度為10ng/mL的TNF-α試劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

2.24h后用0.25％胰酶消化細(xì)胞，收集1×10⁶細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)入流式管中1500rpm離心5min，棄上清。

3.用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，加入500μL Binding Buffer重懸細(xì)胞，再加入Annexin V-FITC和PI各5μL，輕輕混勻。

4.室溫避光反應(yīng)15min，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。激發(fā)波長Ex＝488nm，發(fā)射波長Em＝530nm，Annexin V-FITC的綠色熒光通過FITC通道(FL1)檢測，PI紅色熒光通過PI通道(FL3)檢測。結(jié)果如圖4所示，經(jīng)TSP70處理的SPC-A1細(xì)胞的凋亡率，在12h和48h(1.1％，1.8％)均顯著低于未處理組(6.2％，28.7％)，提示TSP70有抗細(xì)胞凋亡的功能。

實(shí)施例6 TSP70促細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的Transwell檢測

1.基底膜的包被：將Transwell小室放入無菌24孔板中，將基質(zhì)膠與不含抗生素及血清的培養(yǎng)液按1:9稀釋，取70μl混合液輕輕加至Transwell小室的上室面，避免出現(xiàn)氣泡，加好后放入37℃培養(yǎng)箱3h-4h待膠凝固。

2.細(xì)胞懸液的制備：將終濃度為20ng/mL的TSP70蛋白加入SPC-A1細(xì)胞培養(yǎng)液中，作為實(shí)驗(yàn)組；取未加TSP70蛋白的SPC-A1細(xì)胞為對照。48h后，用0.25％胰酶消化細(xì)胞，重懸后，調(diào)至6.0×10⁵個(gè)/mL。

3.細(xì)胞接種：在Transwell小室的上室加入100μl細(xì)胞懸液。下室中加入500μL含10％FBS的培養(yǎng)液。注意去除氣泡。

4.細(xì)胞培養(yǎng)：將細(xì)胞培養(yǎng)板放入37℃，5％CO 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

5.染色計(jì)數(shù)：用棉棒輕柔地將上室的基質(zhì)膠和未穿過膠的細(xì)胞擦掉，用PBS輕輕沖洗兩遍，將膜晾干；棄去下室培養(yǎng)液，用PBS洗去殘留培養(yǎng)液，隨即加入500μL 0.1％結(jié)晶紫溶液，將Transwell小室放入孔中，室溫下染色15-20min，染色完畢后，晾干。用PBS輕輕沖洗，將無細(xì)胞處結(jié)晶紫洗去。光學(xué)顯微鏡下觀察穿透基質(zhì)膠的細(xì)胞，并拍照計(jì)數(shù)。結(jié)果如圖5所示，經(jīng)TSP70處理的SPC-A1細(xì)胞的穿膜數(shù)顯著高于未處理組，提示TSP70能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

實(shí)施例7 TSP70作為ELISA標(biāo)準(zhǔn)品的檢測

將實(shí)施例1純化的蛋白TSP70采用Lowry法測定蛋白的濃度，根據(jù)蛋白定量的結(jié)果，將純化的TSP70蛋白投入含添加劑的PBS中，制成不同濃度的TSP70標(biāo)準(zhǔn)品，分別為3.75ng/mL、7.5ng/mL、15ng/mL和30ng/mL。

用兔抗TSP70多克隆抗體包被酶標(biāo)板(5μg/mL,100μL/孔，4℃過夜)，用1％BSA 4℃封閉過夜。加TSP70標(biāo)準(zhǔn)品100μL/孔，37℃溫育60分鐘，PBST洗滌4次。每孔內(nèi)加入100μL PBST稀釋的NJ001單克隆抗體(1:3000)，37℃溫育30分鐘，PBST洗滌4次。每孔內(nèi)加入100μLPBST稀釋的兔抗鼠IgG-HRP(1:2000)，37℃溫育30分鐘，PBST洗滌5次。每孔內(nèi)加入100μLTMB顯色液，室溫避光15分鐘，每孔內(nèi)再加入50μL終止液。用酶標(biāo)儀在450nm波長測量各孔的OD值，將每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的光密度值與其相對應(yīng)的濃度值進(jìn)行線性回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果如圖6所示，線性相關(guān)系數(shù)r＞0.9900。

本發(fā)明中所述的NJ001單克隆抗體為發(fā)明人前期制備的非小細(xì)胞肺癌單克隆抗體，為TSP70的一個(gè)單克隆抗體，由雜交瘤細(xì)胞株NM001-1(CCTCC NO：C201172)分泌。NJ001單克隆抗體的制備方法見CN102391992A實(shí)施例2。

<110>南京麥科林生物科技有限公司

<120>一種腫瘤特異性抗原TSP70及其應(yīng)用

<160> 1

<210> 1

<211> 648

<212>PRT

<213> 人

<220>

<223>腫瘤特異性抗原TSP70氨基酸序列

<400> 1

Ala Leu Ala Leu Glu Glu Asn Ala Thr Ser Gln Lys Val Leu Asp

1 5 10 15

Ile Phe Glu Gln Arg Leu Glu Gln Val Glu Ser Gly Leu His Arg

20 25 30

Ala Leu Arg Leu Gln Arg Phe Phe Gln Gln Ala His Glu Trp Val

35 40 45

Asp Glu Gly Phe Ala Arg Leu Ala Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu

50 55 60

Ala Val Leu Ala Ala Leu Ala Leu Arg Arg Ala Pro Glu Pro Ser

65 70 75

Ala Gly Thr Phe Gln Glu Met Arg Ala Leu Ala Leu Asp Leu Gly

80 85 90

Ser Pro Ala Ala Leu Arg Glu Trp Gly Arg Cys Gln Ala Arg Cys

95 100 105

Gln Glu Leu Glu Arg Arg Ile Gln Gln His Leu Gly Glu Glu Ala

110 115 120

Ser Pro Arg Gly Tyr Arg Arg Arg Arg Ala Asp Gly Ala Trp Met

125 130 135

His Gln Lys Gly Leu Gly Pro Arg Ser Pro Ser Pro Ser Leu Ser

140 145 150

Ser Leu Leu Leu Pro Ser Ser Pro Gly Pro Arg Pro Ala Pro Ser

155 160 165

His Cys Ser Leu Ala Pro Cys Gly Glu Asp Tyr Glu Glu Ala Leu

170 175 180

Thr Met Leu Ala Glu Ala Pro Glu Gly Arg Pro Pro Arg Ala Val

185 190 195

Leu Ile Arg Gly Leu Glu Val Thr Ser Thr Glu Val Val Asp Arg

200 205 210

Thr Cys Ser Pro Arg Glu His Val Leu Leu Gly Arg Ala Arg Gly

215 220 225

Pro Asp Gly Pro Trp Gly Val Gly Thr Pro Arg Met Glu Arg Lys

230 235 240

Arg Ser Ile Ser Ala Gln Gln Arg Leu Val Ser Glu Leu Ile Ala

245 250 255

Cys Glu Gln Asp Tyr Val Ala Thr Leu Ser Glu Pro Val Pro Pro

260 265 270

Pro Gly Pro Glu Leu Thr Pro Glu Leu Arg Gly Thr Trp Ala Ala

275 280 285

Ala Leu Ser Ala Arg Glu Arg Leu Arg Ser Phe His Arg Thr His

290 295 300

Phe Leu Arg Glu Leu Gln Gly Cys Ala Thr His Pro Leu Arg Ile

305 310 315

Gly Ala Cys Phe Leu Arg His Gly Asp Gln Phe Ser Leu Tyr Ala

320 325 330

Gln Tyr Val Lys His Arg His Lys Leu Glu Asn Gly Leu Ala Ala

335 340 345

Leu Ser Pro Ser Ser Lys Gly Ser Met Glu Ala Gly Pro Tyr Leu

350 355 360

Pro Arg Ala Leu Gln Gln Pro Leu Glu Gln Leu Thr Arg Tyr Gly

365 370 375

Arg Leu Leu Glu Glu Leu Gln Ser Glu Asp Leu Pro Glu Leu Ser

380 385 390

Ser Glu Cys Arg Ala Leu Gly Ala Ala Val Gln Leu Leu Arg Glu

395 400 405

Gln Glu Ala Arg Gly Arg Ala Leu Leu Asn Val Ser Ile Ser Arg

410 415 420

Glu Gly Lys Ile Asp Leu Lys Glu Gln Gly Gln Leu Leu His Arg

425 430 435

Asp Pro Phe Thr Val Ile Cys Gly Arg Lys Lys Cys Leu Arg His

440 445 450

Val Phe Leu Phe Glu His Leu Leu Leu Phe Ser Lys Leu Lys Gly

455 460 465

Pro Glu Gly Gly Ser Glu Met Phe Val Tyr Lys Gln Ala Phe Lys

470 475 480

Thr Ala Asp Met Gly Leu Ala Met Asn Ile Gly Cys Met Glu Leu

485 490 495

Cys Phe Glu Leu Trp Phe Arg Arg Arg Arg Ala Arg Glu Ala Tyr

500 505 510

Thr Leu Gln Ala Thr Ser Pro Glu Ile Lys Leu Lys Trp Thr Ser

515 520 525

Ser Ile Ala Gln Leu Leu Trp Arg Gln Ala Ala His Asn Lys Glu

530 535 540

Leu Arg Val Gln Gln Met Val Ser Met Gly Ile Gly Asn Lys Pro

545 550 555

Phe Leu Asp Ile Lys Ala Leu Gly Glu Arg Thr Leu Ser Ala Leu

560 565 570

Leu Thr Gly Arg Gly Glu Gly Gln Gly Ala Gly Gly Trp Pro Pro

575 580 585

Gly Val Lys Thr Leu Thr Met Arg Ile Gln Arg Gly Gly Met Val

590 595 600

Glu Ser Gln Glu Arg His Leu Val Pro Lys Ser Val Gly Leu Ala

605 610 615

Gly Arg Pro Ser Val Arg Leu Arg Val Ile Pro Gly Ser Gln Glu

620 625 630

Gly Phe Pro Thr Pro Ala Pro His Pro Pro Leu Pro Thr Leu Cys

635 640 645

Ser Arg Pro