本發(fā)明屬于生物菌肥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鐵皮石斛的復(fù)合菌劑。

背景技術(shù)：

鐵皮石斛是蘭科石斛屬多年生附生植物，在醫(yī)藥領(lǐng)域的研究與開發(fā)方面應(yīng)用廣泛。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，鐵皮石斛具有滋肺清熱、滋陰養(yǎng)胃、清肝明目、抵抗癌癥、降低血糖等藥用功效。作為養(yǎng)生保健的極品，鐵皮石斛被歷代醫(yī)學(xué)家所推崇。

目前由于鐵皮石斛的自然繁殖率低，對環(huán)境條件要求較嚴格，產(chǎn)區(qū)藥農(nóng)長期采挖等因素導(dǎo)致自然資源已瀕臨滅絕。而鐵皮石斛又因為種子微小，沒有胚乳，因此自然條件下不利于獲得大批量鐵皮石斛幼苗。當前，石斛組織培養(yǎng)體系已成功建立，可大量繁殖石斛無性苗，但無性苗移栽成活率低、生長緩慢、生長周期長等問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出了一種鐵皮石斛的復(fù)合菌劑，采用鐵皮石斛菌根真菌與根內(nèi)放線菌協(xié)同作用促進其無性苗生長，即放線菌蘭斯基鏈霉菌（Streptomyces krainskii）與菌根真菌瘤菌根菌屬（Epulorhiza sp.）和膠膜菌屬（Tulasnella sp.）協(xié)同促進鐵皮石斛無性苗生長。

其技術(shù)方案為：

一種鐵皮石斛的復(fù)合菌劑，

（1）根內(nèi)放線菌的分離純化：

A．選取健康新鮮鐵皮石斛營養(yǎng)根系，將根樣用紗布包好經(jīng)流動自來水沖洗干凈；

B．置于75%乙醇中消毒20s，無菌水沖洗2-3次，再用0.1%升汞溶液消毒20s，無菌水沖洗4-5次，使用滅菌濾紙將根樣表面水分吸干；

C．設(shè)置空白對照試驗，即用消毒完的根樣置于高氏一號培養(yǎng)基上滾動數(shù)次；

D．將表面已消毒根樣，置于超凈工作臺中研磨成勻漿，微波處理30S，混勻后分別稀釋成10^-1、10^-2、10^-3根樣稀釋液，分別接種于高氏一號、TWYE、YIM38#三種培養(yǎng)基平板中，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)7-15天；

E．對照培養(yǎng)基若無菌落生成，則表明根樣表面消毒合格，將分離出的放線菌菌落挑出，多次純化，得到放線菌菌株，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>

（2）拮抗放線菌的篩選：

A．采用平板對峙法，將供試鐵皮石斛病原真菌極細鏈格孢菌、磚紅鐮孢菌、層出鐮孢菌、灰葡萄孢菌、齊整小核菌接種于PDA培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)5天，打取直徑5mm的病原菌菌塊接種于高氏一號培養(yǎng)皿中央，在同一水平線上，與病原菌同等距離的位置兩側(cè)，接種同等大小的放線菌菌塊，每個處理重復(fù)3次實驗；

B．以培養(yǎng)皿中央只接種病原真菌，兩側(cè)不接種放線菌為對照，每個處理重復(fù)3次，待對照病原真菌長滿培養(yǎng)皿，測定放線菌對5種病原真菌的抑制率，篩選對病原真菌具有明顯拮抗作用的放線菌菌株；

（3）促生菌根真菌的放線菌篩選：

A．將上述篩選出的促生放線菌分別與兩種供試鐵皮石斛促生菌根真菌瘤菌根菌屬和膠膜菌屬，在高氏一號培養(yǎng)基中進行平板對峙試驗，每個處理重復(fù)3次實驗；

B．以培養(yǎng)皿中央只接種菌根真菌為對照，每個處理同樣重復(fù)3次，待對照菌根真菌長滿培養(yǎng)皿，測定放線菌對菌根真菌抑制率，篩選出對鐵皮石斛菌根真菌具有明顯促生作用的放線菌；

（4）促生放線菌種屬地位確定：

采用分區(qū)劃線法、插片法觀察上述篩選出的放線菌的形態(tài)顯微結(jié)構(gòu)特征，采用16S rDNA PCR擴增分析，鑒定促生放線菌為克蘭斯基鏈霉菌；

（5）優(yōu)化菌根真菌協(xié)同放線菌促進鐵皮石斛無性苗生長的復(fù)合菌劑：

A．選取4個月苗齡的鐵皮石斛無性苗，接種于Harvaris培養(yǎng)基中，培養(yǎng)15天；

B．將促生放線菌克蘭斯基鏈霉菌與供試鐵皮石斛促生菌根真菌瘤菌根菌屬和膠膜菌屬按照1:1:1的比例接種在無污染的健康無性苗中進行共生培養(yǎng)，培養(yǎng)60天。

本發(fā)明利用鐵皮石斛菌根真菌協(xié)同其根內(nèi)放線菌得到的復(fù)合菌劑，能夠刺激鐵皮石斛細胞產(chǎn)生高效的防御能力，增強鐵皮石斛自身修復(fù)、抗病性、抵抗極端環(huán)境及提高其無性苗成活率能力，促進鐵皮石斛無性苗的生長，為規(guī)?；a(chǎn)優(yōu)質(zhì)鐵皮石斛種苗提供技術(shù)支持。

具體實施方式

1、根內(nèi)放線菌的分離純化

（1）選取健康新鮮鐵皮石斛營養(yǎng)根系，將根樣用紗布包好經(jīng)流動自來水沖洗干凈。

（2）置于75%乙醇中消毒20s，無菌水沖洗2-3次,再用0.1%升汞溶液消毒20s，無菌水沖洗4-5次，使用滅菌濾紙將根樣表面水分吸干。

（3）設(shè)置空白對照試驗，即用消毒完的根樣置于高氏一號培養(yǎng)基上滾動數(shù)次。

（4）將表面已消毒根樣，置于超凈工作臺中研磨成勻漿，微波處理30S。因為分離的是內(nèi)生放線菌，而根系放線菌比較難分離，所以必須充分研磨，以增加內(nèi)生放線菌的分離種類；適度微波處理可能會促進放線菌孢子的萌發(fā)，使部分難分離放線菌的孢子在接受了一定量的微波輻射后萌發(fā)，轉(zhuǎn)化為可培養(yǎng)的放線菌，增加可培養(yǎng)放線菌的種類和數(shù)量。

（5）混勻后分別稀釋成10^-1、10^-2、10^-3根樣稀釋液，分別接種于高氏一號、TWYE、YIM38#三種培養(yǎng)基平板中。梯度稀釋就是為了減少濃度，減少分離難度。三種培養(yǎng)基一般都是分離放線菌用的，而每種培養(yǎng)基針對的放線菌菌群又稍有不同，因此三種培養(yǎng)基的結(jié)合使用就是為了增加分離放線菌的種類。

（6）置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)7-15天，對照培養(yǎng)基若無菌落生成，則表明根樣表面消毒合格。

（7）將分離出的放線菌菌落挑出，經(jīng)過多次純化后，共分離得到12株放線菌菌株，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2、拮抗放線菌的篩選

（1）采用平板對峙法，將供試鐵皮石斛病原真菌黑斑病的極細鏈格孢Alternaria tenuissima、莖腐病的磚紅鐮孢菌Fusarium incarnatum及層出鐮孢菌Fusarium proliferatum、灰霉病的灰葡萄孢菌Botrytis cinerea及白絹病的齊整小核菌sclerotium rolfsii接種于PDA培養(yǎng)基中，28℃恒溫培養(yǎng)5d，打取直徑5mm的病原菌菌塊接種于高氏一號培養(yǎng)皿中央，在同一水平線上，在距離病原菌同等距離的位置兩側(cè)，接種同等大小的放線菌菌塊，每個處理重復(fù)三次實驗。

（2）以培養(yǎng)皿中央只接種病原真菌，兩側(cè)不接種放線菌為對照，每個處理重復(fù)3次，待對照病原真菌長滿培養(yǎng)皿，測定12株放線菌對5種病原真菌的抑制率，從而篩選對病原真菌具有明顯拮抗作用的4株放線菌菌株。

選取的這些病原真菌，全是鐵皮石斛常見病原真菌。 極細鏈格孢Alternaria tenuissima鐵皮石斛黑斑病的病原真菌，磚紅鐮孢菌Fusarium incarnatum及層出鐮孢菌Fusarium proliferatum是鐵皮石斛莖腐病的病原真菌，灰葡萄孢菌Botrytis cinerea是鐵皮石斛灰霉病的病原真菌，齊整小核菌sclerotium rolfsii是鐵皮石斛白絹病的病原真菌。選取這些鐵皮石斛常見病原真菌目的是為了篩選抵抗鐵皮石斛病原真菌的放線菌。

3、促生菌根真菌的放線菌篩選

將上述篩選出的4株促生放線菌分別與兩種命名為S1、S2的供試鐵皮石斛促生菌根真菌瘤菌根菌屬（Epulorhiza sp.）和膠膜菌屬（Tulasnella sp.），在高氏一號培養(yǎng)基中進行平板對峙試驗，每個處理重復(fù)3次實驗。以培養(yǎng)皿中央只接種菌根真菌為對照，每個處理同樣重復(fù)3次，待對照菌根真菌長滿培養(yǎng)皿，測定放線菌對菌根真菌抑制率。從而篩選出對鐵皮石斛菌根真菌具有明顯促生作用的放線菌1株，命名為X。

4、促生放線菌種屬地位確定

（1）對上述篩選出的對菌根真菌具有促生作用的1株放線菌進行種屬地位鑒定。

（2）采用分區(qū)劃線法、插片法觀察放線菌的形態(tài)顯微結(jié)構(gòu)特征。同樣采用16S rDNA PCR擴增分析，鑒定促生放線菌X為克蘭斯基鏈霉菌（Streptomyces krainskii）。

5、優(yōu)化菌根真菌協(xié)同放線菌促進鐵皮石斛無性苗生長的復(fù)合菌劑

（1）選取4個月苗齡的鐵皮石斛無性苗，接種于Harvaris培養(yǎng)基中，培養(yǎng)15天。

（2）將促生放線菌克蘭斯基鏈霉菌（Streptomyces krainskii）與供試促生菌根真菌S1、S2按照下表配比接種在無污染的健康無性苗中進行共生培養(yǎng)，對照接入無菌同等大小瓊脂塊。共培養(yǎng)60天后，通過測定無性苗鮮重、干重、株高、莖粗、分蘗、生根數(shù)等生長指標，優(yōu)化出最佳菌種配比。

（3）結(jié)果研究出放線菌克蘭斯基鏈霉菌（Streptomyces krainskii）與菌根真菌瘤菌根菌屬（Epulorhiza sp.）、膠膜菌屬（Tulasnella sp.）共同接種于無性苗根系，與對照試驗相比，對鐵皮石斛無性苗的促生作用最顯著。