本發(fā)明屬于生物工程基因領(lǐng)域，涉及一種重組N-糖酰胺酶F(PNGase F)及其編碼基因和表達(dá)純化方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

N-糖酰胺酶F(系統(tǒng)命名:Peptide-N(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagineamidaseF,EC3.5.1.52；通常稱PNGaseForglycoamidase，以下簡稱PNGase F)主要存在于革蘭氏陰性菌及一些真核生物的細(xì)胞內(nèi)，能夠?qū)Ｒ恍缘臄嗔烟擎満偷鞍字g的酰胺鍵，生成一個完整的糖鏈和蛋白質(zhì)，并將蛋白質(zhì)上的天冬酰胺轉(zhuǎn)化為天冬氨酸。來自于腦膜炎膿桿菌的(F.meningosepticum)N-糖酰胺酶F基因的閱讀框中含有1062個堿基，編碼一個354個氨基酸的蛋白質(zhì)，前面的40個氨基酸推測為信號肽，剩余的314個氨基酸為一分子量為34.779kD的蛋白。由于PNGase F能夠從糖肽和糖蛋白上面完整切下N連接的寡糖鏈，將蛋白和糖鏈完全分開，這對于進(jìn)行細(xì)胞表面糖鏈結(jié)構(gòu)和功能的分析具有重要意義。且PNGase F對所有類型的N連接的糖蛋白都有作用，可將蛋白質(zhì)的天冬酰胺殘基轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化為天冬氨酸，從而對糖蛋白進(jìn)行脫糖基化，這些特性使它成為糖生物學(xué)研究中廣泛應(yīng)用的工具酶。

PNGase F最初從腦膜炎膿桿菌中提取得到，但這是一項十分耗資和耗時的工作，步驟繁瑣，產(chǎn)率低，每升發(fā)酵液只能獲得0.1～0.5mg，而且腦膜炎膿桿菌為病原菌不適合大規(guī)模發(fā)酵。因此，商品化的PNGase F價格非常昂貴，阻礙了PNGase F的廣泛應(yīng)用以及糖蛋白的結(jié)構(gòu)與功能研究。研究者們?yōu)榱私鉀Q這一難題，應(yīng)用基因工程技術(shù)對PNGase F進(jìn)行了重組表達(dá)。最具代表性的是蘇移山等2005年在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)BL21(DE3)質(zhì)粒中進(jìn)行的表達(dá)，得到的PNGase F蛋白活性為200000U/mg，但用LB培養(yǎng)基表達(dá)形式為包涵體，變復(fù)性條件復(fù)雜，難以控制，產(chǎn)量較低，僅為10mg/L；用M9培養(yǎng)基雖然可實(shí)現(xiàn)部分可溶表達(dá)，然而表達(dá)量不高，周期較長，收率也不高。Hua等2014年(Highly efficient production of peptides：N-glycosidase F for N-glycomics analysis，Protein Expression and Purification 97(2014)17-22)在酵母表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)PNGase F，并進(jìn)行了5L培養(yǎng)基發(fā)酵，產(chǎn)量為800mg/L，活性為172172U/mg，但并未對N-糖酰胺酶F基因在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行優(yōu)化，在一定程度上影響了N-糖酰胺酶F在畢赤酵母中的表達(dá)及最終的活性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服以上缺點(diǎn)，發(fā)明人將PNGase F基因在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行了優(yōu)化，最終得到的密碼子優(yōu)化后的PNGase F,且將優(yōu)化前后PNGase F基因?qū)氲疆叧嘟湍杆拗骶曛?，發(fā)明人驚喜地發(fā)現(xiàn)，由于優(yōu)化后PNGase F具有較高的表達(dá)量，導(dǎo)致重組PNGase工程菌株進(jìn)行分泌表達(dá)時，由于糖基化修飾程度不一致，從而使得優(yōu)化后PNGase F活性與優(yōu)化前相比提高了近50倍，產(chǎn)量提高了4倍。

本發(fā)明的一個目的是提供一種編碼PNGase F蛋白的DNA序列，其堿基序列如SEQ ID NO:1所示。該序列針對畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，其更利于PNGase F在畢赤酵母中表達(dá)。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種PNGase F蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種含有上述編碼優(yōu)化后PNGase F基因的載體，優(yōu)選的，所述的載體為pAO815，pPIC9，pPIC9K，pPIC3.5，pPIC3.5K，pPICZαA、B、C或pGAPZαA、B、C，更優(yōu)選為pPIC3.5K，pPICZαA或pGAPZαA。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種包含上述所述載體的畢赤酵母菌株，優(yōu)選的，所述畢赤酵母菌株為SMD1168、GS115、KM71、X-33或KM71H，更優(yōu)選為KM71或X-33菌株。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種PNGase F蛋白的表達(dá)方法，所述方法包含下述步驟：

A.構(gòu)建含有上述編碼PNGase F基因的載體；

B.將步驟A的載體線性化后轉(zhuǎn)入畢赤酵母菌株中，并在合適的條件下培養(yǎng)；

C.回收純化蛋白質(zhì)。

上述所述載體優(yōu)選為pPIC3.5K，pPICZαA或pGAPZαA。

上述所述畢赤酵母菌株優(yōu)選為KM71或X33菌株。

更優(yōu)選的，上述所述載體為pPICZαA，并且上述所述畢赤酵母菌株為X33菌株。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種重組PNGase F蛋白純化方法，所述純化方法如下：

A.將PNGase F發(fā)酵液低溫高速離心收集上清，加入咪唑，氯化鈉，磷酸二氫鈉，使其上清中終濃度分別為20mM，300mM，20mM，濾膜過濾。

B.首先用平衡緩沖液平衡柱子，接著運(yùn)用純化系統(tǒng)將步驟A中預(yù)處理獲得的PNGase F發(fā)酵液通過預(yù)裝柱或者分離填料，然后運(yùn)用洗脫緩沖液線性洗脫，收集洗脫峰，即獲得了純化的PNGase F蛋白。所述平衡緩沖液含有20mM磷酸二氫鈉、300mM氯化鈉、20mM咪唑，pH7.5；所述洗脫緩沖液含有20mM磷酸二氫鈉、300mM氯化鈉、500mM咪唑，pH7.5。

上述純化工藝為親和層析方法，預(yù)裝柱和填料優(yōu)選為Histrap crude 5ml FF。

本發(fā)明的另一個目的是提供了一種能充分發(fā)揮PNGaseF活性的反應(yīng)緩沖液配方，優(yōu)選的，包括以下組分：SDS，NP-40，β-ME，磷酸鹽，DTT、EDTA。

優(yōu)選地，上述反應(yīng)緩沖液中各組分的濃度：SDS(v/v)0.1％-1％，β-ME(v/v)0.1％-1％，DTT(v/v)0.1％-10％，NP-40(v/v)0.1-5％，磷酸鹽5-100mM，EDTA1-50mM，pH6.0-8.0。

優(yōu)選地，上述反應(yīng)緩沖液中各組分的濃度：SDS(v/v)0.1％-0.5％，β-ME(v/v)0.5％-1％，DTT(v/v)1％-10％，NP-40(v/v)1-5％，磷酸鹽20-100mM，EDTA5-50mM，pH6.0-8.0。

優(yōu)選地，上述反應(yīng)緩沖液中各組分的濃度：SDS(v/v)0.5％，β-ME(v/v)0.1％，DTT(v/v)1％，NP-40(v/v)1％，磷酸鹽50mM，EDTA50mM，pH8.0。

由于本發(fā)明對PNGase F的基因序列進(jìn)行優(yōu)化，因此性質(zhì)較以往表達(dá)的蛋白有較大改變，與優(yōu)化前相比活性和產(chǎn)量有大幅提高。發(fā)明人同時對其反應(yīng)緩沖液進(jìn)行了優(yōu)化，運(yùn)用DOE軟件對緩沖液中多種成分及配方進(jìn)行了大量的篩選和優(yōu)化，最終優(yōu)化得到了能夠最充分發(fā)揮PNGase F活性的緩沖液組成，使得最終得到的PNGase F活性優(yōu)于目前市場上同類產(chǎn)品，具有巨大的市場價值和廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1表示優(yōu)化前后重組PNGase F基因序列對比圖。

其中優(yōu)化前序列對應(yīng)的為天然PNGase F基因核苷酸序列；優(yōu)化后序列對應(yīng)的為本發(fā)明的重組PNGase F-opt的基因核苷酸序列，即密碼子優(yōu)化后的序列。

圖2-a，2-b為優(yōu)化前后PNGase F基因在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中的CAI指數(shù)。

其中，圖2-a表示天然PNGase F基因核苷酸序列在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中CAI指數(shù)經(jīng)程序計算為0.72；圖2-b表示優(yōu)化后的本發(fā)明的PNGase F-opt密碼子在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中CAI指數(shù)經(jīng)程序計算為0.86。

圖3-a，3-b為密碼子優(yōu)化前后PNGase F基因在畢赤酵母表達(dá)宿主中最優(yōu)密碼子頻率分布區(qū)域圖。

其中圖3-a表示PNGase F天然基因核苷酸序列在畢赤酵母系統(tǒng)中最優(yōu)密碼子頻率分布區(qū)域圖，從圖中可以看出：PNGase F天然基因核苷酸序列的低利用率密碼子出現(xiàn)百分比為11％；圖3-b表示優(yōu)化后的本發(fā)明的PNGase F-opt密碼子在畢赤酵母系統(tǒng)中最優(yōu)密碼子頻率分布區(qū)域圖，優(yōu)化后的本發(fā)明的PNGase F-opt密碼子序列低利用率密碼子出現(xiàn)為0。

圖4-a，4-b為密碼子優(yōu)化前后PNGase F基因在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中平均GC堿基含量分布區(qū)域圖。

其中，圖4-a表示PNGase F天然基因核苷酸序列在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中平均GC堿基含量為：38.74％；圖4-b表示優(yōu)化后的本發(fā)明的PNGase F密碼子在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中平均GC堿基含量為：42.60％。

圖5-a，圖5-b為密碼子優(yōu)化前后PNGase F基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。

其中，圖5-a為優(yōu)化前PNGase F基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。泳道1為500bp DNA Ladder；泳道2為兩端含有XhoI和XbaI酶切位點(diǎn)的重組PNGase F基因PCR產(chǎn)物。

圖5-b為密碼子優(yōu)化后PNGase F-opt基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。泳道1為200bp DNA Ladder；泳道2為兩端含有XhoI和XbaI酶切位點(diǎn)的重組PNGase F-opt基因PCR產(chǎn)物。

圖6-a，6-b為密碼子優(yōu)化前后PNGase F不同表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建過程圖。

圖6-a為PNGase F優(yōu)化前基因表達(dá)質(zhì)粒pPICZ-PNGase F構(gòu)建過程圖；圖6-b為優(yōu)化后PNGase F表達(dá)質(zhì)粒pPICZ-PNGase F-opt構(gòu)建過程圖。

圖7-a，7-b為含有密碼子優(yōu)化前PNGase F基因在宿主工程菌中的表達(dá)鑒定圖。圖中箭頭所指即為PNGase F蛋白。

圖7-a為含有密碼子優(yōu)化前PNGase F基因宿主工程菌株通過甲醇誘導(dǎo)表達(dá)一周后，菌液上清SDS-PAGE凝膠電泳圖。其中泳道2為10-250KD范圍的預(yù)染蛋白上樣Marker；泳道3-10為通過Zeocin篩選出來的含有密碼子優(yōu)化前PNGase F基因各陽性單克隆宿主工程菌株培養(yǎng)菌液上清。

圖7-b為含有密碼子優(yōu)化前PNGase F基因宿主工程菌株通過甲醇誘導(dǎo)表達(dá)一周后，菌液上清蛋白免疫印跡圖。其中泳道1為10-250KD范圍的預(yù)染蛋白上樣Marker；泳道2-9為通過Zeocin篩選出來的含有密碼子優(yōu)化前PNGase F基因各陽性單克隆宿主工程菌株培養(yǎng)菌液上清。

圖8-a，8-b為含有密碼子優(yōu)化后PNGase F-opt基因在宿主工程菌中的表達(dá)鑒定圖。圖中箭頭所指即為PNGaseF蛋白。

圖8-a為含有密碼子優(yōu)化后PNGase F-opt基因宿主工程菌株通過甲醇誘導(dǎo)表達(dá)一周后，菌液上清SDS-PAGE凝膠電泳圖。

圖8-b為含有密碼子優(yōu)化后PNGase F-opt基因宿主工程菌株通過甲醇誘導(dǎo)表達(dá)一周后，菌液上清蛋白免疫印跡圖。其中泳道1為10-250KD范圍的預(yù)染蛋白上樣Marker；泳道2為通過Zeocin篩選出來的含有密碼子優(yōu)化后PNGase F-opt基因宿主工程菌株培養(yǎng)菌液上清。

圖9為密碼子優(yōu)化前PNGase F發(fā)酵液經(jīng)AKTA^TM avant150親和層析純化色譜圖。

圖10為PNGase F蛋白經(jīng)HisTrapcrude FF 5ml預(yù)裝柱純化后SDS-PAGE電泳圖。其中泳道1為10-250KD范圍的預(yù)染蛋白上樣Marker；泳道2-15為經(jīng)各純化分管中PNGase F蛋白。

圖11為密碼子優(yōu)化后PNGase F-opt發(fā)酵液經(jīng)AKTA^TM avant150親和層析純化色譜圖。

圖12為PNGase F-opt蛋白經(jīng)HisTrapcrude FF 5ml預(yù)裝柱純化后SDS-PAGE電泳圖。其中泳道1為10-100KD非預(yù)染蛋白Marker，泳道2為基因優(yōu)化前PNGase F蛋白純化樣品，泳道3為密碼子優(yōu)化后PNGase F-opt蛋白純化樣品，圖中箭頭所指即為PNGase F-opt蛋白。

圖13為PNGaseF-opt在優(yōu)化的各種組成和濃度的反應(yīng)緩沖液中測定對Rnase B底物的活性。

圖13-a為PNGaseF-opt在優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液中酶切Rnase B的活性，其中泳道1為陰性對照(僅有底物Rnase B，不加N-糖酰胺酶F，箭頭所指示的分子量較高蛋白條帶為糖基化修飾的Rnase B，較低為未經(jīng)糖基化修飾,經(jīng)N-糖酰胺酶F酶切后僅有分子量較低未修飾的Rnase B蛋白條帶，分子量較高的糖基化修飾條帶消失)，泳道2為空白對照1(僅有市售N-糖酰胺酶F，未加Rnase B底物)，泳道3為空白對照2(僅有PNGaseF-opt，未加Rnase B底物)，泳道4為陽性對照(用市售的N-糖酰胺酶F對Rnase B進(jìn)行酶切后結(jié)果，底物經(jīng)酶切后僅剩下無糖基化修飾的蛋白條帶)，泳道5為15-100KD非預(yù)染蛋白Marker，泳道6-9對應(yīng)表1中1-4實(shí)驗(yàn)編號。

圖13-b為PNGaseF-opt在優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液中酶切Rnase B的活性，其中泳道4為15-100KD非預(yù)染蛋白Marker，其余泳道1-10對應(yīng)表1中實(shí)驗(yàn)編號5-13。

圖13-c為PNGaseF-opt在優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液中酶切Rnase B的活性，其中泳道1為15-100KD非預(yù)染蛋白Marker，其余泳道2-8對應(yīng)表1中實(shí)驗(yàn)編號14-20。

圖13-d為PNGaseF-opt在優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液中酶切Rnase B的活性，其中泳道1為15-100KD非預(yù)染蛋白Marker，其余泳道2-6對應(yīng)表1中實(shí)驗(yàn)編號21-25；泳道7為PNGase F在優(yōu)化前的反應(yīng)緩沖液(1％SDS，2％DTT，100mM磷酸鹽，pH7.0)中的活性。

圖14為PNGase F和PNGase F-opt在優(yōu)化后反應(yīng)緩沖液中酶活性測定結(jié)果。

圖14-a為PNGase F酶活性測定結(jié)果，其中泳道1為陽性對照(市售N-糖酰胺酶F+Rnase B底物)，泳道2為陰性對照(僅有Rnase B底物)，泳道3為15-100KD非預(yù)染蛋白Marker，泳道4-7分別為PNGase F，酶量依次為100ng，50ng，25ng，10ng。

圖14-b為PNGase F-opt酶活性測定結(jié)果，其中泳道1為空白對照(僅有PNGase F-opt，未加Rnase B底物)，泳道2為15-100KD非預(yù)染蛋白Marker，泳道3為陰性對照(僅有Rnase B底物，未加PNGase F-opt)，泳道4酶量為20ng，泳道5酶量為10ng，泳道6酶量為5ng，泳道7酶量為2ng，泳道8酶量為1ng。

圖15為畢赤酵母重組表達(dá)的人激肽釋放酶(rhKLK1)經(jīng)PNGase F-opt酶解前后鑒定結(jié)果。其中泳道1為畢赤酵母重組表達(dá)的人激肽釋放酶(中國專利公開號：CN105802989)酶解前，泳道2為10-250KD預(yù)染蛋白marker，泳道3為畢赤酵母重組表達(dá)的人激肽釋放酶酶解后，泳道4為大腸桿菌表達(dá)的rhKLK1(中國專利公開號：CN103710367A)。

圖16為CHO系統(tǒng)重組表達(dá)的人激肽釋放酶(rhKLK1)經(jīng)PNGase F-opt酶解前后鑒定結(jié)果。其中泳道1為10-250KD預(yù)染蛋白marker，泳道2為CHO系統(tǒng)重組表達(dá)的人激肽釋放酶(中國專利公開號：CN103710368)酶解前，泳道3為CHO系統(tǒng)重組表達(dá)的人激肽釋放酶酶解后。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，引用實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1 重組PNGase F密碼子優(yōu)化

發(fā)明人根據(jù)GenBank已公開的PNGase F的DNA序列(GenBank登錄號：AF165910.1)，如SEQ ID No：2所示，對該基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化后得到本發(fā)明的PNGase F-opt基因，核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，氨基酸序列如SEQ ID No：3所示。下面是對PNGase F密碼子優(yōu)化前后各參數(shù)對比如下：

1.密碼子適應(yīng)指數(shù)(CAI)

由圖2-a可知，密碼子沒有優(yōu)化前，PNGase F原始基因在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中密碼子適應(yīng)指數(shù)(CAI)為0.72。由圖2-b可知，通過密碼子優(yōu)化，PNGase F基因在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中CAI指數(shù)為0.86。通常CAI＝1時被認(rèn)為該基因在該表達(dá)系統(tǒng)中是最理想的高效表達(dá)狀態(tài)，CAI指數(shù)越低表明該基因在該宿主中表達(dá)水平越差，因此可以看出經(jīng)過了密碼子優(yōu)化后得到的基因序列可以提高PNGase F基因在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)水平。

2.最優(yōu)密碼子使用頻率(FOP)

由圖3-a可知，基于畢赤酵母表達(dá)載體，密碼子沒有優(yōu)化前，PNGase F基因序列的低利用率密碼子(利用率低于40％的密碼子)出現(xiàn)百分比為11％。這條未進(jìn)行優(yōu)化的基因采用串聯(lián)稀有密碼子，這些密碼子可能降低翻譯效率，甚至能夠解散翻譯裝配物。由圖3-b可知，通過密碼子優(yōu)化后，PNGase F基因在畢赤酵母系統(tǒng)中出現(xiàn)低利用率密碼子的頻率為0。

3. GC堿基含量(GC curve)

GC含量理想分布區(qū)域?yàn)?0％-70％，在這個區(qū)域外的出現(xiàn)任何峰都會不同程度地影響轉(zhuǎn)錄和翻譯效率。由圖4-a、圖4-b的PNGase F基因的GC堿基平均含量分布區(qū)域圖對比可知，由圖4-a中顯示PNGase F基因GC堿基平均含量為38.74％，由圖4-b中顯示出優(yōu)化后去除在30％-70％區(qū)域外出現(xiàn)的GC含量峰值，最終得到優(yōu)化后PNGase F的GC堿基平均含量為42.60％。

實(shí)施例2：PNGaseF和PNGase F-opt基因的表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

將密碼子優(yōu)化前后的PNGase F在5’端引入XhoI酶切位點(diǎn)序列，在3’端引入組氨酸標(biāo)簽(SEQ ID No：4)和XbaI酶切位點(diǎn)序列，并進(jìn)行全基因合成，將合成的基因片段，構(gòu)建到pUC57質(zhì)粒(由南京金斯瑞科技有限公司提供)中，得到一種長期保存質(zhì)粒，將優(yōu)化前的質(zhì)粒記為pUC57-PNGase F，優(yōu)化后的質(zhì)粒記為pUC57-PNGase F-opt質(zhì)粒。

以pUC57-PNGase F和pUC57-PNGase F-opt質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所用引物序列如下：

上游引物(SEQ ID No：5)：

M13F:CGC CAG GGT TTT CCC AGT CAC GAC

下游引物(SEQ ID No：6)：

M13R:AGC GGA TAA CAA TTT CAC ACA GGA

反應(yīng)總體積50μL，其中濃度為10μmol/L引物各加2.5μL，濃度為10mmol/L的dNTP加1μL，所用DNA聚合酶為Q5(購自New England Biolabs公司)，2U/μL，加0.5μL。反應(yīng)條件為98℃5秒、55℃45秒、72℃30秒，25個循環(huán)后，產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示產(chǎn)物大小與預(yù)期大小(1000bp)一致(結(jié)果如圖5-a和圖5-b所示)。分別用Xba I(R0145S，購自New England Biolabs公司)和Xho I(R0189S，購自New England Biolabs公司)雙酶切后，1％瓊脂糖電泳，得到的基因產(chǎn)物用DNA凝膠回收試劑盒(DP214，北京天根生化科技有限公司)純化。用T4連接酶(M0202S，購自New England Biolabs)連接到pPICZαA質(zhì)粒(V173-20，購自Invitrogen公司)中，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞(CB101，購自北京天根生化科技有限公司)中，在含有博來霉素(購自Invitrogen公司)的LB固體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜。第二天挑取陽性克隆菌測序，比對，與預(yù)期序列完全一致，即得到PNGase F密碼子優(yōu)化前后的表達(dá)質(zhì)粒，分別記為pPICZ-PNGase F和pPICZ-PNGase F-opt(質(zhì)粒構(gòu)建如圖6-a，6-b所示)。

實(shí)施例3：含有重組PNGase F基因不同畢赤酵母宿主工程菌株的構(gòu)建

YPDS固體培養(yǎng)基配制：Invitrogen公司Easy SelectPichia Expression Kit說明書提供。

1.含有密碼子優(yōu)化前后PNGase F宿主工程菌株的構(gòu)建

按照Invitrogen公司Easy SelectPichia Expression Kit說明書的方法制備成電感受態(tài)細(xì)胞。將實(shí)施例2得到的質(zhì)粒pPICZ-PNGase F和pPICZ-PNGase F-opt，用Sac I限制性內(nèi)切酶(R0156S，購自New England Biolabs)酶切線性化，乙醇沉淀后將線性化載體，電轉(zhuǎn)化進(jìn)入到畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于YPDS固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)直到轉(zhuǎn)化子長出后。

實(shí)施例4：含有密碼子優(yōu)化前后PNGase F基因工程菌株誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定

BMGY培養(yǎng)基配制：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，K₂HPO₄3g/L，KH₂PO₄11.8g/L，YNB 13.4g/L，生物素4×10^-4g/L，甘油10g/L。

BMMY培養(yǎng)基配制：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，K₂HPO₄3g/L，KH₂PO₄11.8g/L，YNB13.4g/L，生物素4×10^-4g/L，甲醇5mL/L。

1.密碼子優(yōu)化前PNGase F宿主工程菌株甲醇誘導(dǎo)表達(dá)

挑取實(shí)施例3獲得的宿主單克隆工程菌于5mL BMGY培養(yǎng)基中，于50mL無菌離心管中30℃，220rpm培養(yǎng)，至OD600＝1.0-2.0時，取1mL保存菌種，并將剩余菌液重懸后轉(zhuǎn)移到BMMY中小量誘導(dǎo)表達(dá)，每隔24h補(bǔ)加甲醇至終濃度為1％。一周后，離心收集菌液上清，通過SDS-PAGE凝膠電泳和蛋白免疫印跡分析(一抗為Anti-His，M20001，Abmart；二抗為Anti-Rabbit IgG-Peroxidase antibody produced in goat，A0545-1mL，購于Sigma-Aldrich)，觀察表達(dá)產(chǎn)物條帶亮度，圖7-a，圖7-b為含有PNGase F基因工程菌株誘導(dǎo)表達(dá)鑒定圖。由圖7-a和圖7-b可知，PNGase F蛋白在工程菌株中得到了表達(dá)。

2.密碼子優(yōu)化后PNGase F-opt工程菌株甲醇誘導(dǎo)表達(dá)

挑取實(shí)施例3獲得的宿主單克隆工程菌于5mL BMGY培養(yǎng)基中，于50mL無菌離心管中30℃，220rpm培養(yǎng)，至OD600＝1.0-2.0時，取1mL保存菌種，并將剩余菌液重懸后轉(zhuǎn)移到BMMY中小量誘導(dǎo)表達(dá)，每隔24h補(bǔ)加甲醇至終濃度為1％。一周后，離心收集菌液上清，通過SDS-PAGE凝膠電泳和蛋白免疫印跡分析，觀察表達(dá)產(chǎn)物條帶亮度，圖8-a，圖8-b為含有PNGase F-opt基因工程菌株誘導(dǎo)表達(dá)鑒定圖。由圖8-a和圖8-b可知，PNGase F-opt蛋白在工程菌株中得到了顯著表達(dá)。

實(shí)施例5：PNGase F和PNGase F-opt重組蛋白的純化

本專利構(gòu)建的PNGase F和PNGase F-opt帶有6×His-Tag，主要采用親和層析純化PNGaseF和PNGase F-opt蛋白。預(yù)裝柱子選擇為HisTrapcrude 5ml FF，具體步驟如下：

1.發(fā)酵液的除雜預(yù)處理

按實(shí)施例4得到PNGase F或PNGase F-opt宿主工程菌株發(fā)酵液，12000rpm，15min低溫離心收集上清，加入磷酸二氫鈉，氯化鈉和咪唑，使其在上清中終濃度分別為20mM，300mM，20mM，0.22μm濾膜過濾。

2. Ni親和層析純化

運(yùn)用全自動智能蛋白純化系統(tǒng)(AKTA avant150，GE healthcare)UNICORN6.1操作軟件對預(yù)處理獲得的PNGase F和PNGase F-opt發(fā)酵液進(jìn)行純化工藝優(yōu)化，最終確定為平衡緩沖液為20mM磷酸鈉，300mM氯化鈉，20mM咪唑，pH7.5，洗脫緩沖液為20mM磷酸鈉，300mM氯化鈉，500mM咪唑，pH7.5。線性洗脫，收集洗脫峰，PNGase F純化色譜圖及SDS-PAGE純度鑒定見圖9和圖10，圖10中PNGF為三條蛋白條帶，上面兩條帶為糖基化修飾后的蛋白，分子量較低的條帶無糖基化修飾，產(chǎn)量為5mg/L；PNGase F-opt純化色譜圖及SDS-PAGE純度鑒定圖見圖11和圖12。圖10、12顯示基因優(yōu)化后PNGase F蛋白以糖基化修飾程度較高的兩條帶為主，優(yōu)化后PNGase F-opt蛋白以糖基化修飾程度較低的條帶為主，且產(chǎn)量明顯高于優(yōu)化前，最高可達(dá)20mg/L。通過SDS-PAGE電泳確定純度后合并符合要求的收集管，過濾除菌，即得到符合要求的PNGase F蛋白，進(jìn)行下一步活性測定試驗(yàn)。

實(shí)施例6：PNGase F-opt反應(yīng)緩沖液的優(yōu)化

反應(yīng)緩沖液中對PNGase F-opt酶活性影響因素較多：如變性劑，表面活性劑，還原劑，去垢劑，緩沖液種類，pH值，濃度等等；利用DOE試驗(yàn)設(shè)計方法，對上述影響因素進(jìn)行優(yōu)化，表1所示為進(jìn)行優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液各種配方及濃度，及對應(yīng)的PNGase F-opt在各緩沖體系下酶活。與優(yōu)化前體系比較結(jié)果，圖13所示PNGase F-opt蛋白活性得到了大幅提高，當(dāng)變性劑濃度較低，緩沖體系濃度適中時酶活力得到最大提升，與緩沖液優(yōu)化前相比活性提高了220％。

表1：DOE優(yōu)化反應(yīng)緩沖液中各組分及其濃度

實(shí)施例7：PNGaseF和PNGaseF-opt蛋白酶活性的測定

1.將純化得到的PNGase F和PNGase F-opt用緩沖液(50mM NaCl，20mM Tris-HCl，5mM EDTA，50％Glycerol，pH7.5)透析，Pierce BCA蛋白濃度測定試劑盒(Cat No:23225)測定蛋白濃度，將PNGase F和PNGase F-opt稀釋到1mg/ml；

2. 20μgRnase B中加入1μL糖蛋白變性緩沖液(1％SDS，1％β-ME)，100℃加熱10min；

3.待溶液冷卻至室溫后加入2μL 10％NP-40，2μl 10×Glycobuffer2(20mM磷酸鹽，10mM EDTA，pH7.0)，加入1μL稀釋過的PNGase F，37℃準(zhǔn)確反應(yīng)1h；

4.反應(yīng)液70℃加熱10min終止反應(yīng)，SDS-PAGE鑒定活性；1h能將95％的Rnase B底物切除的PNGase F單位定義為1個活性單位，圖14所示為PNGase F和和PNGase F-opt活性鑒定結(jié)果，計算得到PNGase F-opt酶比活力為500000U/mg，PNGase F酶比活力為10000U/mg，優(yōu)化后酶比活力提高了50倍。

實(shí)施例8：PNGaseF-opt在畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)的蛋白結(jié)構(gòu)分析分析中的應(yīng)用

抗體和重組蛋白在真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)時極易被糖基化修飾，其中N-糖型修飾為蛋白最常見的修飾類型，此類藥物在進(jìn)行肽圖分析前需要先去除糖基化修飾，常用的去除糖基化修飾的方法為酶解法，用N-糖酰胺酶F去除糖基化修飾；在本實(shí)施例中，發(fā)明人用PNGase F-opt對畢赤酵母系統(tǒng)重組表達(dá)的重組人激肽釋放酶(rhKLK1)(中國專利公開號：CN105802989)進(jìn)行N糖基化處理，具體酶解過程參照實(shí)施例7中詳細(xì)步驟；圖15所示經(jīng)N-糖酰胺酶F酶解后rhKLK1為單一的蛋白條帶，分子量比酶解前相比明顯降低，與大腸桿菌表達(dá)的無糖基化修飾的rhKLK1(中國專利公開號：CN103710367A)相比分子量接近，說明rhKLK1的糖蛋白已被完全去除，經(jīng)酶解后激肽原酶蛋白氨基酸覆蓋率完全符合要求，說明本專利中的PNGase F酶可應(yīng)用于結(jié)構(gòu)分析分析。

實(shí)施例9：PNGaseF-opt在CHO系統(tǒng)表達(dá)蛋白結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用

含有糖基化修飾位點(diǎn)的蛋白在CHO表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)時會發(fā)生N糖基化修飾，分子量遠(yuǎn)大于理論分子量，且可能會使目的條帶在電泳時呈現(xiàn)彌散狀態(tài)，不利于蛋白分子表征及結(jié)構(gòu)分析。本發(fā)明中的PNGase F酶可應(yīng)用于糖蛋白結(jié)構(gòu)的分析和性質(zhì)的鑒定，圖16所示酶解前CHO系統(tǒng)重組表達(dá)的人激肽釋放酶(中國專利公開號：CN103710368)分子量非常彌散，且明顯高于酶解后，經(jīng)PNGase F酶解后CHO系統(tǒng)重組表達(dá)的人激肽釋放酶(中國專利公開號：CN103710368)為均一的蛋白條帶，分子量明顯低于酶解前，說明此蛋白彌散是完全是由于糖基化修飾引起的。酶解后的CHO系統(tǒng)重組表達(dá)的人激肽釋放酶(中國專利公開號：CN103710368)因沒有糖基化的影響，更加有利于開展質(zhì)量分析研究以及肽圖分析研究等蛋白結(jié)構(gòu)研究。

SEQUENCE LISTING

<110> 江蘇眾紅生物工程創(chuàng)藥研究院有限公司

<120> 一種重組N-糖酰胺酶F及其編碼基因和應(yīng)用

<130> 一種重組N-糖酰胺酶F及其編碼基因和應(yīng)用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 948

<212> DNA

<213> Pichia pastoris

<400> 1

gccccagctg ataacaccgt taacatcaag acattcgata aggtcaaaaa cgccttcggt 60

gacggattgt ctcaatccgc agaaggtact tttactttcc cagccgacgt tactgcagtc 120

aagaccatta aaatgtttat caagaacgaa tgtcctaaca agacttgcga tgagtgggac 180

agatacgcta acgtttatgt taagaacaag actaccggtg aatggtacga gattggaaga 240

ttcattactc catattgggt tggtactgaa aagttgccta gaggacttga gattgatgtt 300

accgacttca aatcattgct tagtggtaac acagaattga agatctacac tgagacctgg 360

cttgctaaag gtagagagta ctccgttgat ttcgacattg tctatggaac tccagattac 420

aagtattcag ctgttgtccc tgttgtccaa tacaataagt cttccatcga cggtgttcca 480

tacggtaaag ctcatacttt ggccttgaag aagaacattc agttgcctac aaatactgaa 540

aaggcttact tgagaacaac tatctcaggt tggggacacg caaaaccata cgatgctggt 600

agtagaggat gtgctgagtg gtgctttaga acccatacaa ttgccatcaa caactctaac 660

actttccaac accagttggg tgcccttgga tgttctgcaa accctattaa caatcaatcc 720

ccaggaaatt ggaccccaga tagagctggt tggtgcccag gaatggccgt tcctactaga 780

attgacgtct tgaacaattc ccttatcgga tctacctttt cctacgaata taagttccag 840

aactggacaa acaatggtac taatggagat gcattctacg ctatttcaag tttcgttatc 900

gcaaaatcaa acacaccaat tagtgctcct gttgtcacta attaatag 948

<210> 2

<211> 948

<212> DNA

<213> Chryseobacterium meningosepticum

<400> 2

gctccggcag ataatacggt aaatattaaa acattcgaca aagtaaaaaa tgcctttggt 60

gacggattgt cccaaagtgc ggaaggaacc tttacatttc cggccgatgt aacagccgta 120

aaaacgatta agatgttcat taaaaatgaa tgtcctaata aaacttgtga tgaatgggat 180

cgttatgcca atgtttatgt aaaaaataaa acaacaggtg agtggtacga aataggacgc 240

tttattactc catattgggt gggaacggaa aaattacctc gtggactgga aattgatgtt 300

acagatttca aatctttact atccggaaat acagaactta aaatttatac ggagacatgg 360

ctggccaaag gaagagaata cagtgtagat ttcgatattg tatacgggac accggattat 420

aaatattcgg ctgtagtacc tgtagttcag tataacaaat catctattga cggagtccct 480

tatggtaaag cacatacatt ggctttgaaa aagaatatcc agttaccaac aaacacagaa 540

aaagcttatc ttagaactac tatttccgga tggggacatg ctaagccata tgatgcggga 600

agcagaggtt gtgcagaatg gtgcttcaga acacacacta tagcaataaa taattcgaat 660

actttccagc atcagctggg tgctttagga tgttcagcaa accctatcaa taatcagagt 720

ccgggaaatt ggactcccga cagagccggt tggtgcccgg gaatggcagt tccaacacgt 780

atagatgtac tgaataattc tttaataggc agtactttta gttatgaata taaattccag 840

aactggacaa ataacggaac caatggagat gctttttatg caatttccag ttttgtgatt 900

gcaaaaagta atacacctat tagtgctccg gtagttacaa actagtaa 948

<210> 3

<211> 314

<212> PRT

<213> Chryseobacterium meningosepticum

<400> 3

Ala Pro Ala Asp Asn Thr Val Asn Ile Lys Thr Phe Asp Lys Val Lys

1 5 10 15

Asn Ala Phe Gly Asp Gly Leu Ser Gln Ser Ala Glu Gly Thr Phe Thr

20 25 30

Phe Pro Ala Asp Val Thr Ala Val Lys Thr Ile Lys Met Phe Ile Lys

35 40 45

Asn Glu Cys Pro Asn Lys Thr Cys Asp Glu Trp Asp Arg Tyr Ala Asn

50 55 60

Val Tyr Val Lys Asn Lys Thr Thr Gly Glu Trp Tyr Glu Ile Gly Arg

65 70 75 80

Phe Ile Thr Pro Tyr Trp Val Gly Thr Glu Lys Leu Pro Arg Gly Leu

85 90 95

Glu Ile Asp Val Thr Asp Phe Lys Ser Leu Leu Ser Gly Asn Thr Glu

100 105 110

Leu Lys Ile Tyr Thr Glu Thr Trp Leu Ala Lys Gly Arg Glu Tyr Ser

115 120 125

Val Asp Phe Asp Ile Val Tyr Gly Thr Pro Asp Tyr Lys Tyr Ser Ala

130 135 140

Val Val Pro Val Val Gln Tyr Asn Lys Ser Ser Ile Asp Gly Val Pro

145 150 155 160

Tyr Gly Lys Ala His Thr Leu Ala Leu Lys Lys Asn Ile Gln Leu Pro

165 170 175

Thr Asn Thr Glu Lys Ala Tyr Leu Arg Thr Thr Ile Ser Gly Trp Gly

180 185 190

His Ala Lys Pro Tyr Asp Ala Gly Ser Arg Gly Cys Ala Glu Trp Cys

195 200 205

Phe Arg Thr His Thr Ile Ala Ile Asn Asn Ser Asn Thr Phe Gln His

210 215 220

Gln Leu Gly Ala Leu Gly Cys Ser Ala Asn Pro Ile Asn Asn Gln Ser

225 230 235 240

Pro Gly Asn Trp Thr Pro Asp Arg Ala Gly Trp Cys Pro Gly Met Ala

245 250 255

Val Pro Thr Arg Ile Asp Val Leu Asn Asn Ser Leu Ile Gly Ser Thr

260 265 270

Phe Ser Tyr Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Trp Thr Asn Asn Gly Thr Asn

275 280 285

Gly Asp Ala Phe Tyr Ala Ile Ser Ser Phe Val Ile Ala Lys Ser Asn

290 295 300

Thr Pro Ile Ser Ala Pro Val Val Thr Asn

305 310

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> Pichia pastoris

<400> 4

catcaccatc accatcac 18

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> Pichia pastoris

<400> 5

cgccagggtt ttcccagtca cgac 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> Pichia pastoris

<400> 6

agcggataac aatttcacac agga 24