本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學領域，具體涉及一種與白血病相關的環(huán)狀circRNA-005365基因及其用途。
背景技術：
：骨髓移植(Bonemarrowtransplantation，BMT)目前仍是各種血液系統(tǒng)惡性腫瘤、再生障礙性貧血、重度地中海貧血以及一些先天性免疫缺乏癥或代謝性疾病的根本治療方法。急性移植物抗宿主病(acutegraftversushostdisease，aGVHD)是異基因造血干細胞移植后常見并發(fā)癥。盡管對于移植免疫的認識在不斷進步,但aGVHD仍然是異基因造血干細胞移植后病人死亡的主要原因之一。環(huán)狀RNA(circularRNA，circRNA)是一類在哺乳動物細胞中廣泛存在的、對基因表達具有調控作用的內源性RNA分子。circRNA多定位于細胞質，具有miRNA應答元件(microRNAresponseelement，MRE)，能與miRNA相互作用。circRNA能夠瞬間結合或釋放大量miRNA，從而高效地發(fā)揮其調控作用。circRNA廣泛參與體內各種基因表達的調控，包括移植后排斥反應的調節(jié)。因此，circRNA可能是防治白血病骨髓移植患者aGVHD發(fā)生的新靶點。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種環(huán)狀circRNA-005365基因，該基因及其表達產物可作為預測造血干細胞移植后aGVHD的標記物，作為治療白血病的靶基因和用于制備治療白血病的藥物。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)白血病患者經全身放療后骨髓間充質干細胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)中環(huán)狀circRNA-005365基因表達顯著下調，通過circRNABase預測該基因的應答元件中包括miR-20a。多項研究表明miR-20a可顯著抑制白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)基因的表達。IL-6在造血調節(jié)中發(fā)揮中重要作用，且與急性移植物抗宿主病(aGVHD)的發(fā)生密切相關。綜合文獻和課題組研究結果，我們提出科學假設：circRNA-005365可通過“海綿作用”調節(jié)miR-20a水平，從而影響白血病患者體內IL-6含量，進而參與造血干細胞移植后aGVHD的調控。本發(fā)明第一個方面提供一種環(huán)狀circRNA-005365基因，其cDNA序列如SEQIDNO：1所示。本發(fā)明第二個方面提供環(huán)狀circRNA-005365基因在制備診斷白血病的試劑中的應用。該環(huán)狀RNA基因作為造血干細胞移植療效的標記物。本發(fā)明第三個方面提供環(huán)狀circRNA-005365基因在制備治療白血病藥物中的應用。本發(fā)明第四個方面提供檢測所述環(huán)狀circRNA-005365基因檢測試劑盒，主要由DNA聚合酶、緩沖液、水、擴增引物對組成，所述的擴增引物對核酸序列如SEQIDNO：2，SEQIDNO：3所述。本發(fā)明第五個方面提供擴增環(huán)狀circRNA-005365基因的引物對在制備診斷白血病試劑中的應用，所述的擴增引物對核酸序列如SEQIDNO：2，SEQIDNO：3所述。在本發(fā)明范圍內，本發(fā)明的上述技術特征和下文實施例中具體描述的各技術特征可以互相組合，從而構成新的技術方案，限于篇幅，在此不一一贅述。本發(fā)明首次證實了一個新的環(huán)狀circRNA-005365基因的客觀存在，通過檢測全身輻照患者中該基因表達情況，發(fā)現(xiàn)其表達水平明顯下降，該環(huán)狀circRNA-005365基因及其表達產物可作為預測造血干細胞移植后aGVHD的標記物，為治療白血病提供新的思路。含有該環(huán)狀circRNA-005365基因及其引物對的試劑盒，可以用于aGVHD預測；環(huán)狀circRNA-005365基因也可以作為預防aGVHD的靶基因，在白血病治療中起到重大作用。附圖說明圖1正常組骨髓基質細胞中環(huán)狀RNA芯片結果圖；圖2全身輻照處理組骨髓基質細胞環(huán)狀RNA芯片結果圖；圖3正常組和全身輻照處理組骨髓基質細胞中環(huán)狀RNA表達情況的聚類分析圖；圖中左側為正常組骨髓基質細胞中環(huán)狀RNA表達情況的聚類分析圖，右側為全身輻照處理組骨髓基質細胞中環(huán)狀RNA表達情況的聚類分析圖；圖4內參GAPDH基因的實時定量PCR擴增曲線；圖5circRNA-005365基因實時定量PCR擴增曲線；圖6過表達cricRNA-005365基因腺病毒載體的骨髓基質細胞與正常組的IL-6水平比較。具體實施方式下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定，本發(fā)明中所用的方法及其相關的試劑，可以有其他可選擇和替代方案，能夠達到相同技術結果即可。實施例1：擴增環(huán)狀circRNA-005365基因引物對根據環(huán)狀circRNA-005365基因SEQIDNO:1所示的cDNA序列，設計擴增用引物，各引物的具體序列見表1。表1環(huán)狀circRNA-005365基因擴增引物序列引物名稱序列(5’→3’)SEQ.IDFGAGGAGGAAGAACAGCCAAGC2RTGGCCTTCAATGCTCACAGC3上述引物人工合成后，作為擴增環(huán)狀circRNA-005365基因cDNA序列引物對使用。實施例2：樣品中總RNA的制備按照TRIZOL法RNA提取步驟，提取對照組、全身輻照處理組的骨髓基質細胞樣品中的總RNA。簡述如下：1勻漿樣品按照TRIZOL法說明書，根據細胞數量，加入TRIZOL試劑后，勻漿；2兩相分離勻漿后的樣品在15-30℃孵育5分鐘后，按照每1ml的TRIZOL試劑勻漿的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12,000×g離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層核上層的無色的水相。RNA全部被分配于水相中。3RNA沉淀將水相轉移到新離心管中。水相與異丙醇混合以沉淀其中的RNA，加入異丙醇的量為每個樣品勻漿時加入1mlTRIZOL試劑的此時加0.5ml的異丙醇?；靹蚝?5到30℃孵育10分鐘后，于4℃12,000×g離心10分鐘。4RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL試劑勻漿的樣品中加入至少1ml的75％乙醇，清洗RNA沉淀。振蕩后，4℃7,500×g離心5分鐘。5重新溶解RNA沉淀去除乙醇溶液，空氣中干燥RNA沉淀5-10分鐘，切勿真空離心干燥。注意RNA沉淀不要完全干燥，否則將大大降低RNA的可溶性。部分溶解的RNA樣品A260/280比值將小于1.6。溶解RNA時，先加入無RNA酶的水用槍反復吹打幾次，然后55到60℃孵育10分鐘。獲得的RNA溶液保存于-70℃。6總RNA質量檢測提取的總RNA，使用ND-1000測定RNA濃度和純度，測量前先用溶解RNA用的DEPC水調零。提取的總RNA質量、數質量應能滿足后續(xù)試驗的要求。實施例3：總cDNA序列的合成經質量檢測合格的總RNA，按照下面所述的方法進行cDNA的合成。合成所用的試劑及其生產商如下：RNA酶抑制劑(Epicentre)；SuperScriptTMIIIReverseTranscriptase(Invitrogen)；5×RT緩沖液(Invitrogen)；2.5mMdNTP混合液(dATP，dGTP，dCTP和dTTP各2.5mM)(HyTestLtd)；Primer(英駿生物技術有限公司)cDNA合成用熱循環(huán)儀為GeneAmpPCRSystem9700(AppliedBiosystems)。具體的操作方法如下：1配制退火混合物混合液在65℃水浴5分鐘,冰上放置2分鐘。2短暫離心后，在離心管中依次加入RT反應液混合后37℃恒溫1分鐘，然后用移液槍輕輕吸打幾次混合均勻。3、50℃溫育60分鐘。4、70℃溫育15分鐘使酶失活。5、總cDNA置冰浴待用或-20℃保存。實施例4：環(huán)狀circRNA-005365基因cDNA擴增本發(fā)明中，環(huán)狀circRNA-005365基因cDNA擴增體系如下：取實施例3合成的總cDNA樣品，配置PCR反應體系，反應體系如下：輕柔的使溶液混合，5000rpm短暫離心。cDNA的擴增按照以下程序進行：95℃，10min；40個PCR循環(huán)(95℃，10秒；60℃，60秒)。實時熒光定量PCR信號收集在PCR循環(huán)的60℃，60秒階段進行。反應結束PCR產物與100bpDNALadder在2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。實施例5：環(huán)狀circRNA-005365基因檢測試劑盒一種環(huán)狀RNA基因檢測試劑盒，包括DNA聚合酶、鎂離子、緩沖液、環(huán)狀RNA基因特異性引物、水。具體體系如下：使用時，加入經反轉錄得到的總cDNA樣品，在下列PCR擴增程序中進行擴增，95℃，10min；40個PCR循環(huán)(95℃，10秒；60℃，60秒)。實施例6：基因芯片法研究全身輻照病人中環(huán)狀circRNA-005365基因表達情況取經全身輻照處理后的患者骨髓基質細胞，按照實施例2中樣品中總RNA的制備，提取的總RNA進行環(huán)狀RNA基因芯片檢測。具體步驟如下：1總RNA的純度和濃度檢測用NanoDropND-1000檢測提取的總RNA的純度和濃度，結果如下所示：表2總RNA的純度和濃度質量檢測2RNA標記質量合格的總RNA，用Rnase富集環(huán)狀RNA。富集后的circRNA經擴增后用Arraystar公司的超級RNA標記探針(Arraystar,Inc)標記。3Array雜交標記后的circRNA與Arraystar公司circRNA芯片(8*15K,Arraystar)在安捷倫分子雜交儀中65℃孵育17小時，進行雜交。4Array掃描充分洗滌后，芯片用安捷倫掃描儀G2505C進行檢測。5用安捷倫數據處理軟件獲取數據；6circRNAs表達分析用R軟件包進行一系列包括均一化的數據處理。7CircRNA的差異表達用倍數變化cutoff值或者火山圖分別分析輻照組和對照組中表達差異有統(tǒng)計學意義的circRNA。8注釋circRNA和microRNA相互作用采用Arraystar’s預測軟件分析circRNA與microRNA的相互作用，所有差異表達的circRNA都詳細注釋了與之相互作用的microRNA。9環(huán)狀RNA基因芯片檢測結果正常組和全身輻照處理組骨髓基質細胞中環(huán)狀RNA基因芯片檢測結果如圖1、2所示，表達情況的聚類分析結果如圖3所示。環(huán)狀circRNA芯片檢測結果原始數據如下表所示表3circRNA-005365基因在環(huán)狀circRNA芯片檢測結果中原始熒光強度組別circRNA-005365熒光強度對照組9.09822125099127TBI處理組7.39410015632848所得熒光強度數據經用安捷倫數據處理軟件處理后，得到全身輻照處理組骨髓基質細胞內circRNA-005365基因比對照組表達下調1.7041211倍。利用cytoscape生物信息學軟件進行ceRNA分析，可以預測出circRNA-005365可以通過海綿吸附作用調節(jié)miR-20a水平，從而參與全身放療后細胞周期阻滯的調控。利用TargetScan和miRanda兩種生物信息軟件預測分析，發(fā)現(xiàn)miR-20a為circRNA-005365的應答元件。實施例7：實時定量PCR驗證全身輻照病人樣品中環(huán)狀circRNA-005365基因和miR-20a基因表達情況樣品總RNA提取，總cDNA合成，實時熒光定量PCR反應體系組成、擴增等參數如實施例1、2、3、4所示，采用實時熒光定量PCR分別檢測對照組和實驗組骨髓基質細胞內circRNA-005365基因和miR-20a基因的表達情況，各樣品的目的基因和管家基因分別進行實時熒光定量PCR反應。根據繪制的梯度稀釋DNA標準曲線，各樣品目的基因和管家基因的濃度結果直接由機器生成。每個樣品的目的基因濃度除以其管家基因的濃度，即為此樣品此基因的校正后的相對含量。內參GAPDH基因的實時定量PCR擴增曲線如圖4所示，circRNA-005365基因的實時定量PCR擴增曲線如圖5所示。其中圖4、圖5實時熒光定量PCR擴增曲線圖中的△Rn含義是Rn扣除基線后得到的標準化結果，Rn(Normalizedreporter)是熒光報告基團的熒光發(fā)射強度與參比染料的熒光發(fā)射強度的比值。對照組和實驗組骨髓基質細胞內circRNA-005365和miR-20a，實時定量PCR結果校正如下：表4全身輻照病人樣品中環(huán)狀circRNA-005365基因和miR-20a基因表達情況實時熒光定量PCR結果進行數據處理后，所得的表達情況如下表所示：表格5全身輻照病人樣品中環(huán)狀circRNA-005365基因和miR-20a基因相對于內參GAPDH基因表達情況數據比較方案circRNA-005365/GAPDHmiR-20a/GAPDH處理組/正常組0.222.02結果顯示，經過全身輻照患者骨髓基質細胞中circRNA-005365表達顯著下調，僅為正常組0.22倍，同時miR-20a水平上升，較正常組高2.02倍。實施例8：環(huán)狀circRNA-005365基因過表達與IL-6的相關性經實施例6、7中全身輻照病人樣品中環(huán)狀circRNA-005365基因表達情況的數據，利用cytoscape生物信息學軟件進行ceRNA分析，可以預測出circRNA-005365通過海綿吸附作用調節(jié)miR-20a水平，從而IL-6表達調控，影響aGVHD的發(fā)生。為驗證該預測，將轉染了過表達circRNA-005365基因腺病毒載體的骨髓基質細胞與轉染空載體的對照骨髓基質細胞相比，發(fā)現(xiàn)circRNA-005365轉染細胞株IL-6水平下降，具體如下：1circRNA-005365基因擴增根據實施例1設計環(huán)狀circRNA-005365擴增引物；按照實施例2制備環(huán)狀circRNA-005365基因擴增用樣品；按照實施例3進行總RNA基因cDNA序列的合成；然后按照實施例4進行環(huán)狀circRNA-005365基因cDNA擴增，并回收擴增的circRNA-005365基因的cDNA。2pcDNA3-circRNA-005365重組質粒和腺病毒的制備用taq酶將擴增后環(huán)狀circRNA-005365基因cDNA鏈接到pcDNA3載體上，并包被到rAD-EGFP腺病毒中，命名為rAD-4-circRNA005365腺病毒。3細胞轉染轉染前24h將1×105骨髓基質細胞接種6孔板培養(yǎng)皿，當細胞長至70％-80％融合的時轉染。轉染當日棄去舊培養(yǎng)基，用PBS洗2次，加入無血清、無雙抗的純DMEN1ml，本實驗對照組用1×105的rAD-EGFP腺病毒，實驗組用1×105的rAD-4-circRNA005365腺病毒感染骨髓基質細胞，轉染后將6孔板置于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h，棄去培養(yǎng)基，換成2ml含10％血清的DMEN培養(yǎng)基，培養(yǎng)至48h，收集細胞進行后續(xù)檢測。4IL-6檢測使用ELISA對實驗組與對照組分別進行IL-6檢測，結果如圖6所示，實驗組IL-6水平顯著高于對照組。在本發(fā)明中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)白血病患者經TBI后BMSCs中circRNA-005365表達，通過circRNABase預測circRNA-005365的應答元件為miR-20a，實驗結果顯示TBI處理后circRNA-005365通過“海綿作用”調節(jié)miR-20a水平，從而參與IL-6的表達調控，影響造血干細胞移植后aGVHD的發(fā)生。以上具體實施方式僅為本創(chuàng)作的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神及原則之內所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。序列表<110>中南大學湘雅三醫(yī)院<120>一種白血病相關的環(huán)狀circRNA-005365基因及其用途<130>無<160>3<170>PatentInversion3.3<210>1<211>325<212>DNA<213>circRNA-005365基因的cDNA序列<400>1ctttctcagccagctgtgagcattgaaggccaggtctcaaaccctccatctactagtagc60accgaagtgaattctcagaccattcctgagaagcagccttcacaggaagtgaaaatggag120tctaaaatggaggtggataagccagaaccagcagatgctcaacctgaggatacaaaggag180gctaaaggtgaggatgttaaagtagaacctacagaaatggaggagagaggccctgagtta240aaaactgatgggaaagaggaggaagaacagccaagcacctctgctacccagtcctcccca300gctcctggacagtcaaagaagaaga325<210>2<211>21<212>DNA<213>circRNA-005365基因的擴增引物F<400>2gaggaggaagaacagccaagc21<210>3<211>20<212>DNA<213>circRNA-005365基因的擴增引物R<400>3tggccttacctgctcacagc20當前第1頁1 2 3