本發(fā)明屬于干細(xì)胞生物技術(shù)與骨組織工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及到一種提高人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化效率的方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

骨因創(chuàng)傷、感染、退行性病變、腫瘤切除等原因?qū)е聯(lián)p傷或缺損，是骨科疾病中的常見病、多發(fā)病。僅以骨關(guān)節(jié)炎為例，目前我國患者約有1.5億，WHO推測到2025年全球患者將超過8億，數(shù)量僅次于心血管相關(guān)疾病，已成為嚴(yán)重影響人類健康的重要疾病。目前，骨缺損的修復(fù)與功能重建，傳統(tǒng)的治療方法難以取得理想效果，已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的一大難題。近年來，隨著干細(xì)胞工程技術(shù)體系的快速發(fā)展和完善，以干細(xì)胞移植為核心的再生醫(yī)學(xué)及組織工程學(xué)作為一種新型的治療技術(shù)，使人們看到了徹底攻克這一醫(yī)學(xué)難題的希望。大量的研究表明，人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞具有比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有更強的擴增能力、分化能力、低免疫原性、無致瘤風(fēng)險和倫理學(xué)限制等優(yōu)勢，被認(rèn)為是再生醫(yī)學(xué)的理想種子細(xì)胞，亦是骨組織工程的最佳種子細(xì)胞來源(肖建輝. 人羊膜干細(xì)胞：再生醫(yī)學(xué)的理想種子細(xì)胞資源. 遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報 38(5): 439-449, 2015)。

干細(xì)胞在外界適當(dāng)?shù)囊蜃訔l件干預(yù)下，對其增殖和分化進行調(diào)控，定向發(fā)展。這個調(diào)控過程主要是通過自身細(xì)胞內(nèi)源性和外源性相關(guān)調(diào)控因子的響應(yīng)，來決定干細(xì)胞命運。這是一個極其復(fù)雜的生命過程，直接影響到干細(xì)胞的臨床應(yīng)用，亦是當(dāng)前干細(xì)胞領(lǐng)域研究的重點方向。因此，干細(xì)胞在骨疾病方面的臨床應(yīng)用關(guān)鍵，在于尋找到高效、無毒、無副作用，生物相容性好的促進干細(xì)胞成骨分化的誘導(dǎo)劑或誘導(dǎo)策略。目前，誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞等干細(xì)胞成骨分化的體系中，加入的外界信號物質(zhì)（誘導(dǎo)因子）主要是非人體細(xì)胞存在的一些物質(zhì)，譬如駱駝蓬堿、枸橘苷、葛根素（任艷玲,宋囡,何文智,等. 一種成骨分化誘導(dǎo)劑. 申請?zhí)?201310471912.2）等。然而，目前干細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化存在誘導(dǎo)體系較復(fù)雜、分化效率低等諸多因素影響其臨床應(yīng)用。

Martin MJ等醫(yī)學(xué)界人士發(fā)現(xiàn)，體外擴增的干細(xì)胞極易受到來自培養(yǎng)介質(zhì)中存在的一種人體內(nèi)沒有的物質(zhì)Ｎ-羥乙酰神經(jīng)氨酸污染，而被其污染的干細(xì)胞很容易被人類免疫系統(tǒng)識別和攻擊，這危及到干細(xì)胞的臨床應(yīng)用。透明質(zhì)酸是人體細(xì)胞外基質(zhì)主要結(jié)構(gòu)成分。而細(xì)胞外基質(zhì)決定細(xì)胞的形狀、影響細(xì)胞的活力、遷移、增殖分化，并參與信號傳遞，透明質(zhì)酸在其中扮演重要角色，并在機體正常和病理狀態(tài)下發(fā)揮多重生物學(xué)功能。因此，利用人體細(xì)胞存在的因子(人源性因子)來調(diào)控干細(xì)胞分化可規(guī)避潛在的臨床風(fēng)險。然而，迄今尚未見發(fā)掘人源性因子來調(diào)控干細(xì)胞的分化。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種安全、高效促人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的方法及應(yīng)用。

一種提高人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化效率的方法，其具體步驟為：

（1）人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)：將健康足月剖宮產(chǎn)新鮮胎盤鈍性機械剝離羊膜，用含1%雙抗的D-Hank’s液反復(fù)沖洗羊膜，除去殘留血漬和表面粘液后。將羊膜剪成1～3 cm²大小，分裝于50 mL離心管內(nèi)，加入約羊膜組織2倍體積的含0.02% EDTA-2Na 的0.05% 胰蛋白酶消化液，于35～37℃恒溫水浴箱中，150～185rpm旋轉(zhuǎn)消化約30 min，經(jīng)300目不銹鋼濾網(wǎng)過濾后，棄去含有羊膜上皮細(xì)胞的消化液，重新加入新鮮的含0.02% EDTA-2Na 的0.05% 胰蛋白酶消化液，重復(fù)消化一次，再次經(jīng)300目不銹鋼濾網(wǎng)過濾后，棄去消化液。經(jīng)上述胰蛋白酶消化后剩余的羊膜組織用含1% 雙抗的D-Hank’s液清洗一次，除去殘留的胰蛋白酶消化液，加入含0.05 mg/mL DNase I的 0.5 mg/mL II型膠原酶消化液，于35～37 ℃恒溫水浴箱中，150～185rpm旋轉(zhuǎn)消化1～2 h，直至剩余的羊膜組織碎片完全消化成絮狀，經(jīng)300目不銹鋼網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞濾液，1500 rpm，4℃離心10 min，棄上清，細(xì)胞沉淀即為人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞；用含10%胎牛血清的低糖DMEM重懸細(xì)胞，種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，在35～37℃，含1℃的10% CO₂及85℃的100%空氣飽和濕度恒溫培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)80%以上進行傳代培養(yǎng)；

（2）人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化誘導(dǎo)組合物的制備：在1L高糖DMEM完全培養(yǎng)基中，加入0.1～2 g/L透明質(zhì)酸、0～200mg/L 前列腺素E2受體選擇性激動、1～100 nmol/L地塞米松、0～10mmol/L β-甘油磷酸鈉和1～100mg/L抗壞血酸的誘導(dǎo)劑，即得提高人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化效率的誘導(dǎo)組合物；

（3）、誘導(dǎo)組合物促人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的方法：取2代對數(shù)生長期人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞，按2×10⁵ cells/孔的細(xì)胞量，接種于6孔板內(nèi)，0～48小時后加入誘導(dǎo)組合物，每2～3天換一次應(yīng)用基質(zhì)和誘導(dǎo)組合物，在35～37℃，含1～10% CO₂及85～100%空氣飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14～21天，誘導(dǎo)分化終止。

所述用于誘導(dǎo)分化的人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞為2～5代。

所述用于誘導(dǎo)分化的人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞初始種子密度，按5×10⁵ -5×10⁶個/瓶的細(xì)胞接種密度種于25cm²培養(yǎng)瓶。

所述誘導(dǎo)組合物中透明質(zhì)酸的分子量為20～2200KD。

本發(fā)明所述方案調(diào)控人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化，可應(yīng)用于骨相關(guān)疾病細(xì)胞移植和骨組織工程種子細(xì)胞。

本發(fā)明所述方案調(diào)控人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化，可作為種子細(xì)胞替代成骨細(xì)胞，避免體外獲取成骨細(xì)胞難和細(xì)胞移植后高免疫原性問題。

本發(fā)明所述誘導(dǎo)組合物可制備治療骨疾病藥物，聯(lián)合人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療相關(guān)骨疾病。

本發(fā)明相比常規(guī)誘導(dǎo)方法，可顯著提高人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化效率，促進堿性磷酸酶的表達(dá)及活性，增強RunX2、Osx、BSP、Ocn、ALP和Col1α1等成骨相關(guān)基因的表達(dá)，以及礦化鈣結(jié)節(jié)的形成。本發(fā)明可在人間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化中應(yīng)用，以及在骨缺損、骨創(chuàng)傷等骨病中應(yīng)用。

附圖說明

圖1為人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化21天后的形態(tài)特征圖（×100），（a）為對照組，（b）為陽性對照組，（c）為加誘導(dǎo)組合物的實驗組；

圖2為人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化14天后堿性磷酸酶ALP的BCIP/NBT染色及酶活力檢測結(jié)果（×100），（a）為對照組，（b）為陽性對照組，（c）為加誘導(dǎo)組合物的實驗組；

圖3為人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化21天后礦化鈣結(jié)節(jié)的茜素紅S染色結(jié)果（×200），（a）為對照組，（b）為陽性對照組，（c）為加誘導(dǎo)組合物的實驗組；

圖4為人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化7天、14天后的成骨相關(guān)基因的表達(dá)情況。

具體實施方式

本發(fā)明通過如下實施例和附圖作進一步說明，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

實施例1：提高人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化效率的方法及應(yīng)用

1、人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)

將健康足月剖宮產(chǎn)新鮮胎盤鈍性機械剝離羊膜，用含1%雙抗的D-Hank’s液（終濃度為青霉素：100 IU/mL，鏈霉素:100 IU/mL，臨用前新鮮配制）反復(fù)沖洗羊膜，除去殘留血漬和表面粘液后。將羊膜剪成1～3 cm²大小，分裝于50 mL離心管內(nèi)，加入約羊膜組織2倍體積的含0.02% EDTA-2Na 的0.05% 胰蛋白酶消化液，于35～37 ℃恒溫水浴箱中，150～185rpm旋轉(zhuǎn)消化約30 min，經(jīng)300目不銹鋼濾網(wǎng)過濾后，棄去含有羊膜上皮細(xì)胞的消化液，重新加入新鮮的含0.02% EDTA-2Na 的0.05% 胰蛋白酶消化液，重復(fù)消化一次，再次經(jīng)300目不銹鋼濾網(wǎng)過濾后，棄去消化液。經(jīng)上述胰蛋白酶消化后剩余的羊膜組織用含1% 雙抗的D-Hank’s液清洗一次，除去殘留的胰蛋白酶消化液，加入含0.05 mg/mL DNase I的 0.5 mg/mL II型膠原酶消化液，于35～37 ℃恒溫水浴箱中，150～185rpm旋轉(zhuǎn)消化1～2 h，直至剩余的羊膜組織碎片完全消化成絮狀，經(jīng)300目不銹鋼網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞濾液（即消化液），1500 rpm，4℃離心10 min，棄上清，細(xì)胞沉淀即為人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞。用含10%胎牛血清的低糖DMEM重懸細(xì)胞，種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，在35～37℃，含1～10% CO₂及85～100%空氣飽和濕度恒溫培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)80%以上進行傳代培養(yǎng)，第2～5代用于以下實驗。

2、誘導(dǎo)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化誘導(dǎo)組合物的制備

在1L高糖DMEM完全培養(yǎng)基中，加入0.1～2 g/L 20～2200KD透明質(zhì)酸、0～200mg/L ONO-4819、1～100 nmol/L地塞米松、0～10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉和1～100mg/L抗壞血酸的誘導(dǎo)劑，即獲得提高間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化效率的誘導(dǎo)組合物。

3、誘導(dǎo)組合物促人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的方法

取2代對數(shù)生長期人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞，按2×10⁵ cells/孔的細(xì)胞量，接種于6孔板內(nèi)，24小時后加入誘導(dǎo)組合物，每2天換一次應(yīng)用基質(zhì)和誘導(dǎo)組合物。連續(xù)培養(yǎng)7～21天。

細(xì)胞水平分析實驗：光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化；反應(yīng)成骨分化水平指標(biāo)包括堿性磷酸酶(ALP)和礦化鈣結(jié)節(jié)（鈣鹽沉積）。采用BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒的方法染色測定堿性磷酸酶ALP，采用堿性磷酸酶檢測試劑盒，在405nm測定OD值，計算出ALP酶活力，采用茜素紅S染色法測定礦化鈣結(jié)節(jié)。在培養(yǎng)到21天時，與對照組相比，陽性對照組（陽性組）及加誘導(dǎo)組合物的實驗組（實驗組）誘導(dǎo)的細(xì)胞均從長梭形變成鋪路石狀，部分細(xì)胞重疊生長呈不透光的結(jié)節(jié)，且實驗組誘導(dǎo)的不透光結(jié)節(jié)數(shù)量明顯多于陽性組（圖1）；在培養(yǎng)到14天時，ALP染色，與對照組相比，陽性組和實驗組均有呈淺藍(lán)紫色的陽性細(xì)胞，即ALP呈陽性，而且實驗組陽性細(xì)胞數(shù)量顯著多于陽性組，而且兩者ALP酶活力的結(jié)果均顯著高于對照組，但兩者差異不明顯（圖2）；在培養(yǎng)到21天時，陽性組合實驗組茜素紅S染色呈強陽性，能觀察到大量的紅色礦化鈣結(jié)節(jié)，尤其是實驗組結(jié)節(jié)數(shù)量明顯多于陽性組（圖3）。

分子水平檢測結(jié)果：分別采用RT-qPCR法定量測定了RunX2、Osx、BSP、Ocn、ALP和Col1α1等成骨相關(guān)基因的表達(dá)情況，用β-actin作為內(nèi)參。在培養(yǎng)到7天時，陽性組和實驗組所檢測的基因轉(zhuǎn)錄水平均明顯高于對照組，而實驗組的表達(dá)量又明顯高于陽性組，但到14天時，這些成骨相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平均表達(dá)下調(diào)，實驗組的RunX2、ALP基因的相對表達(dá)量明顯高于陽性組，除Ocn基因外，其它幾個基因的表達(dá)量低于陽性組。而且，對照組的Col1α1基因轉(zhuǎn)錄水平高于實驗組和陽性組，三者的Ocn基因轉(zhuǎn)錄水平相當(dāng)（圖4）。

實施例2. 促進人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞成骨在其它方面的用途

人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞在體外用本發(fā)明誘導(dǎo)組合物誘導(dǎo)向成骨分化，可作為骨組織工程和細(xì)胞移植的種子細(xì)胞的用途。對骨折及骨代謝性疾病均有一定的防治作用。用本發(fā)明誘導(dǎo)組合物誘導(dǎo)分化人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞替代成骨細(xì)胞，可避免成骨細(xì)胞體外較難獲取和高免疫原性的問題。