一種來源于枯草桿菌ZNXH1的細(xì)菌漆酶基因、細(xì)菌漆酶及其應(yīng)用的制作方法

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一種來源于枯草桿菌ZNXH1的細(xì)菌漆酶基因、細(xì)菌漆酶及其應(yīng)用的制作方法與工藝

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種來源于枯草桿菌ZNXH1的細(xì)菌漆酶基因cahh1、由該基因表達(dá)的細(xì)菌漆酶CAHH1以及該細(xì)菌漆酶CAHH1在紡織工業(yè)和環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

漆酶(EC 1.10.3.2)是一種含銅的多酚氧化酶，它可利用活性中心的銅離子催化氧化多種結(jié)構(gòu)的芳香類化合物，同時(shí)將分子氧還原成水。由于漆酶作用的底物范圍十分廣泛、催化效率高，所以在造紙工業(yè)(生物制漿和漂白)、紡織工業(yè)(人工合成染料脫色)、食品工業(yè)(食品風(fēng)味改良)、飼料營養(yǎng)改善、新型藥物開發(fā)、土壤的生物修復(fù)、生物傳感器制造及新型能源開發(fā)等領(lǐng)域具有潛在重要應(yīng)用價(jià)值。

漆酶廣泛存在于高等真菌(特別是擔(dān)子菌)中。近年來，部分真菌漆酶已經(jīng)應(yīng)用于多個(gè)工業(yè)領(lǐng)域，如來自黑曲霉的漆酶DeniliteⅡS等。但是真菌漆酶受環(huán)境影響比較大，在堿性條件下活性較低，這嚴(yán)重影響了它在工業(yè)領(lǐng)域中的應(yīng)用。隨著全基因組測序技術(shù)的迅速發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)，漆酶在細(xì)菌中同樣廣泛存在。細(xì)菌漆酶在堿性環(huán)境和高溫條件下具有良好的催化活性和較高的穩(wěn)定性，并且具有生長快、易于培養(yǎng)的特點(diǎn)。由于工業(yè)染料廢水等一般溫度較高，堿性較強(qiáng)，真菌漆酶在實(shí)際應(yīng)用中表現(xiàn)出穩(wěn)定性較差，而這種環(huán)境卻不影響細(xì)菌漆酶功能的發(fā)揮，因此細(xì)菌漆酶在工業(yè)上具有更好的應(yīng)用前景。雖然目前對(duì)細(xì)菌漆酶資源的發(fā)掘還很有限，但迄今已經(jīng)在地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)等微生物中發(fā)現(xiàn)了漆酶。

隨著印染工業(yè)的迅速發(fā)展，染料的品種和數(shù)量不斷增加，全球每年至少有10％的染料通過廢水排放到自然環(huán)境中，這些廢水中的染料很多是具有毒性或致癌性的，嚴(yán)重危害了水生動(dòng)物以及人類本身。紡織、造紙和塑膠等行業(yè)產(chǎn)生的染料廢水往往不能有效的零污染處理，導(dǎo)致了大量工業(yè)染料廢水的排放。而工業(yè)使用的合成染料絕大多數(shù)是芳香族化合物，使用傳統(tǒng)的方法無法有效去除廢水中的染料，而且非常耗能，但相比之下，應(yīng)用漆酶來處理工業(yè)染料廢水既經(jīng)濟(jì)、有效、又環(huán)境友好，是目前和未來較理想的治理方法。真菌漆酶雖然對(duì)紡織染料的脫色及降解效果明顯，但產(chǎn)漆酶的真菌因較細(xì)菌生長緩慢、發(fā)酵周期長、生長溫度和pH范圍較窄而限制了真菌漆酶的應(yīng)用，而產(chǎn)漆酶的細(xì)菌因具有生長迅速、發(fā)酵周期短、耐溫、在堿性條件下穩(wěn)定等特點(diǎn)而在工業(yè)上具有更好的應(yīng)用前景和實(shí)用價(jià)值。目前關(guān)于細(xì)菌漆酶在染料降解與脫色方面的研究報(bào)道還相對(duì)較少，通過研究細(xì)菌漆酶對(duì)不同合成染料的脫色效果，可以進(jìn)一步推動(dòng)細(xì)菌漆酶的在工業(yè)上的應(yīng)用。

靛藍(lán)類染料、偶氮類染料、蒽醌染料和三苯甲院類染料是目前工業(yè)是上用量最大的四類染料，也是較難降解的染料。目前世界各國都在致力于開發(fā)能有效降解這四類染料的細(xì)菌漆酶，以期實(shí)現(xiàn)有效保護(hù)和修復(fù)生態(tài)環(huán)境，但是前提是要開發(fā)出理想的細(xì)菌漆酶。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供一種來源于枯草桿菌ZNXH1的細(xì)菌漆酶基因cahh1；

本發(fā)明的另一個(gè)目的是利用上述細(xì)菌漆酶基因cahh1制備高效、廣譜的細(xì)菌漆酶CAHH1，即應(yīng)用基因工程技術(shù)利用細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行漆酶的表達(dá)與制備；

本發(fā)明的再一個(gè)目的是通過對(duì)細(xì)菌漆酶CAHH1的理化性質(zhì)的分析，提供細(xì)菌漆酶CAHH1在工業(yè)染料降解和脫色中的用途。

本發(fā)明所述的一種來源于枯草桿菌ZNXH1的細(xì)菌漆酶基因cahh1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明所述的一種來源于枯草桿菌ZNXH1的細(xì)菌漆酶CAHH1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明所述的細(xì)菌漆酶基因cahh1來自枯草桿菌ZNXH1，我們發(fā)現(xiàn)，該菌所分泌的蛋白具有漆酶的活力，經(jīng)進(jìn)一步研究確定該菌的基因組中含有漆酶基因。

將枯草桿菌ZNXH1通過菌體培養(yǎng)、目的基因釣取，得到本發(fā)明所述的細(xì)菌漆酶基因cahh1。我們委托上海生工生物技術(shù)有限公司對(duì)該基因進(jìn)行測序，測序結(jié)果如圖3所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

將本發(fā)明的細(xì)菌漆酶基因cahh1與表達(dá)載體重組，形成重組表達(dá)載體，本發(fā)明不限于特定的表達(dá)載體，優(yōu)選的表達(dá)載體是原核表達(dá)載體[pET-28a、pET-41b等系列的pET表達(dá)載體(通用的大腸桿菌表達(dá)載體，含有T7強(qiáng)啟動(dòng)子、N-或C-末端組氨酸標(biāo)簽以及卡那霉素抗性基因等，Novagen、Invitrogen等公司有售)或pPZW103等表達(dá)載體(枯草桿菌表達(dá)載體，含有P43強(qiáng)啟動(dòng)子以及卡那霉素抗性基因等，參見黃鶴等，“重組青霉素G?；冈诳莶菅挎邨U菌中的表達(dá)條件優(yōu)化”，中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2001，17(2):173-177)]。

上述重組表達(dá)載體按生物學(xué)常規(guī)方法導(dǎo)入適宜的宿主細(xì)胞，適宜的宿主細(xì)胞包括真核表達(dá)細(xì)胞和原核表達(dá)細(xì)胞。本發(fā)明不局限于任何特定的宿主細(xì)胞，優(yōu)選的宿主細(xì)胞是大腸桿菌或枯草桿菌，進(jìn)一步優(yōu)選的大腸桿菌宿主細(xì)胞為E.coli BL21(DE3)或E.coli BL21(DE3)pLysS、E.coli BL21(DE3)pLysE(通用的大腸桿菌表達(dá)宿主細(xì)胞，Novagen、Invitrogen等公司有售)，進(jìn)一步優(yōu)選的枯草桿菌宿主細(xì)胞為WB600(參見黃鶴等，“重組青霉素G?；冈诳莶菅挎邨U菌中的表達(dá)條件優(yōu)化”，中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2001,17(2):173-177)，表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞后得到表達(dá)細(xì)菌漆酶CAHH1的工程菌。

工程菌表達(dá)的漆酶為可溶性漆酶蛋白。針對(duì)不同的宿主細(xì)胞，表達(dá)產(chǎn)物的純化有不同的方法。1、針對(duì)大腸桿菌宿主細(xì)胞表達(dá)的胞內(nèi)漆酶蛋白(胞內(nèi)酶)，通過表達(dá)細(xì)胞超聲破碎和加熱失活大腸桿菌雜蛋白即可分離得到細(xì)胞可溶性漆酶蛋白，再使用Ni²⁺-NTA親和柱純化得到純化的漆酶蛋白；2、針對(duì)枯草桿菌宿主細(xì)胞表達(dá)的胞外漆酶蛋白(胞外酶)，通過表達(dá)體系細(xì)胞的離心分離獲得枯草桿菌表達(dá)細(xì)胞的培養(yǎng)液，再通過加熱失活培養(yǎng)液中的雜蛋白即可分離純化得到表達(dá)細(xì)胞分泌的漆酶蛋白。

表達(dá)的漆酶蛋白經(jīng)活性實(shí)驗(yàn)鑒定，具有漆酶的活性，可催化多種染料等底物的脫色。該種漆酶蛋白即為本發(fā)明所述的細(xì)菌漆酶CAHH1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。與傳統(tǒng)漆酶相比，它具有明顯的應(yīng)用穩(wěn)定性優(yōu)勢和作用廣譜性優(yōu)點(diǎn)，主要包括：(1)本發(fā)明的細(xì)菌漆酶CAHH1在pH＝3-9的范圍內(nèi)具有較好的酸堿穩(wěn)定性，(2)本發(fā)明的細(xì)菌漆酶CAHH1在溫度為30℃-90℃的范圍內(nèi)均具有較好的溫度穩(wěn)定性，(3)本發(fā)明的細(xì)菌漆酶CAHH1對(duì)靛藍(lán)類染料、偶氮類染料和三苯甲烷類染料的脫色作用均強(qiáng)，可用于工業(yè)染料的脫色。

以上技術(shù)方案中所有分子生物學(xué)操作均參照“分子克隆實(shí)驗(yàn)指南”(第三版，科學(xué)出版社，2002年)進(jìn)行。

附圖說明

圖1：細(xì)菌漆酶基因cahh1產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜，其中M：DNA分子Marker；S：細(xì)菌漆酶基因cahh1，在分子量1542bp處有明亮條帶；

圖2：重組表達(dá)載體pET28a-CAHH1構(gòu)建示意圖；

圖3：細(xì)菌漆酶基因cahh1測序譜圖，共測二個(gè)反應(yīng)，進(jìn)一步使用Gene-man軟件組裝得到全長的細(xì)菌漆酶基因(1542bp)；

圖4：純化得到的細(xì)菌漆酶CAHH1的SDS-PAGE電泳圖譜，其中M：蛋白質(zhì)分子Marker；1：純化的細(xì)菌漆酶CAHH1；

圖5：細(xì)菌漆酶CAHH1的pH-活力曲線(A)和pH穩(wěn)定性曲線(B)；

圖6：細(xì)菌漆酶CAHH1的溫度-活力曲線(A)和溫度穩(wěn)定性水平(B)；

圖7：Co²⁺和Mn²⁺對(duì)細(xì)菌漆酶CAHH1酶活力的影響；

圖8：細(xì)菌漆酶CAHH1對(duì)染料活性亮藍(lán)19、剛果紅、靛藍(lán)胭脂紅、甲基紅、結(jié)晶紫的脫色效率曲線。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1:細(xì)菌漆酶CAHH1基因克隆及細(xì)菌漆酶CAHH1的表達(dá)與制備，包括以下步驟：

(1)枯草桿菌ZNXH1的培養(yǎng)及其染色體DNA的提取

將枯草芽孢桿菌BS168(上海北諾科技有限公司、北京天辰澤生物技術(shù)有限公司等有售)菌株接種于0.5mL的LB液體培養(yǎng)基(每100毫升培養(yǎng)基組分如下：0.5g酵母粉，1.0g蛋白胨，1.0g NaCl，其余為水，pH＝7.6)中，37℃，180rpm，震蕩培養(yǎng)2h后，將其倒入空培養(yǎng)皿中，置于紫外燈(20W)30cm處照射20s，間隔20s，共照射3次。然后取100μL菌液，涂布于LB瓊脂培養(yǎng)平板(每100毫升培養(yǎng)基組分如下：0.5g酵母粉，1.0g蛋白胨，1.0g NaCl，0.5g瓊脂粉，其余為水，pH＝7.6)上，37℃培養(yǎng)10h后，挑取單克隆菌株，即為枯草桿菌ZNXH1。將枯草桿菌ZNXH1接種于1mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180rpm震蕩培養(yǎng)8h后，再轉(zhuǎn)至100mL新鮮的LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)8h，8000rpm離心5min收集培養(yǎng)的菌體，-20℃保存菌體備用。

取0.2g上述收集的枯草桿菌ZNXH1菌體，用500μL PBS緩沖液(每1L PBS組分：8g NaCl、0.2g KCl、1.44g KH₂PO₄，其余為水，pH＝7.4)洗滌菌體一次后，離心棄上清液；再用200μL上述緩沖液重懸菌體，加入50μL、50mg/mL溶菌酶，室溫消化5min；加入50μL的SDS溶液{終濃度為2％(g/mL)}、25μg蛋白酶K，55℃恒溫水浴消化3h；加入2μL的1mg/mL RNase A，37℃恒溫水浴再消化30min；加入與上述溶液等體積(300μL)的酚：氯仿：異戊醇(體積比為25：24：1)，顛倒混勻，10000rpm離心10min(4℃)，將上清液轉(zhuǎn)移至另一支離心管中，向上清液中加入2倍體積的無水乙醇，-20℃靜置30min后，10000rpm離心10min(4℃)，收集菌體染色體DNA沉淀；用200μL的70％乙醇(體積比)漂洗沉淀，10000rpm離心10min(4℃)，收集沉淀，吸干，室溫靜置10min以除盡乙醇；最后用100μL的TE溶液(pH＝8.0)重新溶解DNA沉淀，取5μL溶液用0.7％(g/mL)的瓊脂糖凝膠電泳鑒定所得染色體DNA的濃度和大小，只在分子量20Kb附近有一條亮帶，為所制得的染色體DNA，即本發(fā)明所述的細(xì)菌漆酶基因的PCR擴(kuò)增模板，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)細(xì)菌漆酶CAHH1基因的釣取及重組克隆載體的構(gòu)建

本發(fā)明所述的細(xì)菌漆酶CAHH1基因通過PCR方法從步驟(1)所制得的染色體DNA中擴(kuò)增而得到。所需引物依據(jù)枯草桿菌漆酶基因中的保守序列及表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)序列而設(shè)計(jì)，并委托上海生工生物技術(shù)有限公司合成，其序列如下：

上游引物：5’CGGGATCCATGACACTTGAAAAATTTGTG 3’，劃線的GGATCC序列是內(nèi)切酶BamH I識(shí)別位點(diǎn)；

下游引物：5’CCCTCGAGTTATTTATGGGGATCAGTTAT 3’，劃線的CTCGAG 序列是內(nèi)切酶XhoI識(shí)別位點(diǎn)。

上述兩個(gè)引物所設(shè)置的酶切位點(diǎn)與本發(fā)明所用的表達(dá)載體pET-28a(通用的大腸桿菌表達(dá)載體，含有T7強(qiáng)啟動(dòng)子、N-末端組氨酸標(biāo)簽以及卡那霉素抗性基因等，Novagen、Invitrogen等公司有售)的BamH I和XhoI相匹配，適合于在大腸桿菌中高效表達(dá)。

PCR反應(yīng)：100μL反應(yīng)體系中含1μL Ex-Taq DNA聚合酶、10μL Ex-Taq DNA聚合酶緩沖液、1.5μL dNTP混合物(每種核苷酸濃度為25mmol/L)、4μL染色體DNA、1μL上游引物、1μL下游引物、81.5μL超純水。每個(gè)循環(huán)中94℃變性0.5min，58℃退火1min，72℃延伸2min，最后一次循環(huán)延至10min，共30個(gè)循環(huán)。用1.0％(g/mL)的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，分子量約為1542bp，如圖1中S所示。

使用DNA純化試劑盒(Bio Basic公司生產(chǎn)的EZ Spin Column DNA Gel Extraction Kit)純化PCR產(chǎn)物，步驟如下：向PCR溶液中加入4倍體積的結(jié)合緩沖液II(Binding Buffer II)，加入EZ-10柱子中，靜止2min，10000rpm離心2min；加入500μL的洗脫緩沖液(Wash Solution)，10000rpm離心1min，重復(fù)1次，將EZ-10柱轉(zhuǎn)移到干凈的1.5mL微量離心管(microfuge tube)中，加入30μL無菌去離子水，室溫放置2min，然后10000rpm離心2min，得到要純化的目的DNA片段。取3μL上述純化的目的DNA片段，加入1μL pUcm-T載體(通用的克隆載體，含有氨芐青霉素抗性基因等，上海生工生物技術(shù)有限公司等有售)、1μL 10×T4DNA連接酶緩沖液，加去離子水定容至10μL，最后加入1單位的的T4DNA連接酶，混勻并瞬間離心以使液滴聚集管底，置16℃水浴過夜或25℃水浴4小時(shí)后，得到連接好的重組克隆載體pUcm-T-CAHH1。

(3)細(xì)菌漆酶CAHH1基因的重組表達(dá)載體的構(gòu)建

重組克隆載體pUcm-T-CAHH1轉(zhuǎn)入E.coli DH5α：取10μl連接好的重組表達(dá)載體pUcm-T-CAHH1加入100μl E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞【E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備方法參照“分子克隆實(shí)驗(yàn)指南”(第二板，科學(xué)出版社)49頁】中，冰浴30分鐘后置入42℃水浴中保溫1分鐘，立即取出并置冰浴中冷卻2分鐘。加入200μl 37℃預(yù)熱的SOC液體培養(yǎng)基(1.0mg酵母粉，4.0mg蛋白胨，0.1mg NaCl，0.19mg MgCl2，0.037mg KCl，0.72mg葡萄糖，其余為水，培養(yǎng)基的pH＝7.0)，37℃、150rpm振搖培養(yǎng)60分鐘后，取出100μl培養(yǎng)液涂布于含氨芐青霉素(Amp)的LB瓊脂培養(yǎng)平板上，37℃培養(yǎng)16小時(shí)后，出現(xiàn)轉(zhuǎn)化菌落。挑取單菌落加入2mL含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37℃，180rpm培養(yǎng)過夜。提取擴(kuò)增的重組克隆載體pUcm-T-CAHH1，經(jīng)BamH I和XhoI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分析切割產(chǎn)物與理論值一致。

分別將1.0μg pUcm-T-CAHH1及pET-28a載體與適量去離子水混勻，使其總體積分別為18μL，各加入2單位限制性內(nèi)切酶BamH I和XhoI及2μl相應(yīng)的10×H緩沖液，混勻，置37℃水浴保溫2小時(shí)后，分別使用DNA純化試劑盒回收約1540bp的目的DNA片段和線性化的pET28a載體，按上述pUcm-T-CAHH1相同的方法連接后轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，經(jīng)BamH I和XhoI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定正確后獲得陽性克隆pET28a-CAHH1。重組表達(dá)載體pET28a-CAHH1的構(gòu)建過程如圖2所示。

(4)細(xì)菌漆酶基因的序列分析

將酶切鑒定正確的重組表達(dá)載體pET28a-CAHH1進(jìn)行核酸序列分析，結(jié)果如圖3(pET28a-CAHH1載體測序譜圖)所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示(1542bp)，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA。其中目的基因cahh1的5’端融合了載體上的編碼6×HIS標(biāo)簽序列(6×HIS標(biāo)簽的核苷酸序列見pET-28a圖譜，網(wǎng)址為http://www.merckbiosciences.co.uk/docs/docs/PROT/TB074.pdf)，它是表達(dá)產(chǎn)物的純化標(biāo)簽。

(5)細(xì)菌漆酶CAHH1的表達(dá)與制備

重組表達(dá)載體pET28a-CAHH1可轉(zhuǎn)化到E.coli BL21(DE3)系列細(xì)胞中，如E.coli BL21(DE3)、E.coli BL21(DE3)pLysS、E.coli BL21(DE3)pLysE細(xì)胞等，獲得高表達(dá)的細(xì)菌漆酶CAHH1。

在本實(shí)施例中使用E.coli BL21(DE3)為宿主細(xì)胞，并使用卡那霉素篩選出能高效穩(wěn)定表達(dá)的單細(xì)胞株。具體操作：將1.0μg表達(dá)載體pET28a-CAHH1加入到100μL E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30分鐘，42℃水浴保溫90秒，冰浴冷卻2分鐘，加入800μL 37℃預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基，37℃150rpm振搖培養(yǎng)60分鐘。取200μL培養(yǎng)液涂布于含卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)平板上，37℃培養(yǎng)16小時(shí)后，獲得轉(zhuǎn)化的單菌落。

挑取轉(zhuǎn)化的單菌落，接種于2mL LB培養(yǎng)基中，37℃振搖培養(yǎng)過夜。以1:100(體積比)的比例接種10mL LB培養(yǎng)基(含30μg/mL Kan)，37℃180rpm振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.4-0.6(約2-3小時(shí))，加異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度0.2mM，加CuSO₄·5H₂O至終濃度0.25mM。25℃、160rpm振蕩誘導(dǎo)12小時(shí)后，4℃、5000rpm離心5分鐘收集菌體。

用1/10培養(yǎng)液體積的1×PBS(pH＝7.8)重懸菌體，置冰浴中超聲波處理破碎菌體。破碎菌體4℃，5000rpm離心15分鐘,獲得上清液。然后使用Ni²⁺-NTA親和柱純化得到本發(fā)明的細(xì)菌漆酶CAHH1：將上清液緩慢流過Ni²⁺-NTA柱，然后分別用5倍柱體積的BindingII buffer(20mM磷酸鈉緩沖液，500mM氯化鈉，20mM咪唑，pH調(diào)節(jié)至7.8)和WashingI buffer(20mM磷酸鈉緩沖液，500mM氯化鈉，20mM咪唑，pH調(diào)節(jié)至6.0)洗柱，最后用WashingII buffer(20mM磷酸鈉緩沖液，500mM氯化鈉，250mM咪唑，pH調(diào)節(jié)至6.0)洗脫本發(fā)明的細(xì)菌漆酶CAHH1。應(yīng)用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測所得到的細(xì)菌漆酶CAHH1的純度和分子量，結(jié)果如圖4所示，可見只在約62kDa處有一蛋白帶，說明純化得到的細(xì)菌漆酶CAHH1的分子量約為62kDa，與理論值相符。

本發(fā)明從野生型產(chǎn)酶菌株枯草桿菌ZNXH1中釣取并克隆細(xì)菌漆酶CAHH1的基因，使用該基因表達(dá)出細(xì)菌漆酶CAHH1。所述的細(xì)菌漆酶CAHH1以可溶性蛋白形式表達(dá)，使用Ni²⁺-NTA親和層析法純化制備了本發(fā)明的細(xì)菌漆酶CAHH1。

實(shí)施例2:細(xì)菌漆酶CAHH1的特性

(1)最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性

pH值是影響酶催化活力的一個(gè)重要因素。通常酶在一定的pH值下表現(xiàn)出最大的催化活力，而偏離此pH值越遠(yuǎn)，酶的催化活力越低，對(duì)本發(fā)明所述細(xì)菌漆酶CAHH1的催化活力檢測的最大pH范圍為2.0-9.0。

以ABTS為底物，測定細(xì)菌漆酶CAHH1在不同pH值的緩沖液中(2.0-9.0)的活力，以最高酶活力為100％，計(jì)算其它pH條件下的相對(duì)酶活。以酶的相對(duì)活力對(duì)pH值作圖(圖5A)，結(jié)果表明：細(xì)菌漆酶CAHH1催化ABTS的最適pH值為4.6。

分別將細(xì)菌漆酶CAHH1置于不同pH值(2.0-9.0)的緩沖液中孵育1h后，以ABTS為底物在pH4.6條件下測定CAHH1活力，結(jié)果如圖5B所示，表明細(xì)菌漆酶CAHH1在pH值3.0-9.0范圍內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定，放置1h后依然維持60％以上的活性，而當(dāng)pH值超出此范圍時(shí)，活力下降明顯。這說明細(xì)菌漆酶CAHH1在pH值3.0-9.0范圍內(nèi)具有較好的pH穩(wěn)定性。

(2)最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性

溫度是影響酶催化活力的另一個(gè)重要因素。通常酶在高溫下的反應(yīng)活力遠(yuǎn)高于低溫。對(duì)本發(fā)明所述細(xì)菌漆酶CAHH1的催化活力檢測的溫度范圍為30-90℃。

以ABTS為底物，在30-90℃的溫度范圍內(nèi)分別測定細(xì)菌漆酶CAHH1的活力，以最高酶活力為100％，計(jì)算其它溫度條件下的相對(duì)酶活。以酶的相對(duì)活力對(duì)溫度作圖，如圖6A所示，表明細(xì)菌漆酶CAHH1的活力在約55-70℃范圍內(nèi)活力較好，超過或低于這個(gè)范圍，活力則下降，最適溫度為60℃。

分別將細(xì)菌漆酶CAHH1置于不同溫度(30℃-90℃)下孵育1h后，以ABTS為底物，在60℃條件下測定CAHH1活力，結(jié)果如圖6B所示，表明細(xì)菌漆酶CAHH1在40℃-70℃范圍內(nèi)，放置1h后依然能維持70％以上的活性。這說明細(xì)菌漆酶CAHH1具有非常好的溫度穩(wěn)定性。

實(shí)施例3：Co²⁺與Mn²⁺對(duì)細(xì)菌漆酶CAHH1催化活性的影響

以ABTS為底物，陽離子Co²⁺和Mn²⁺(10mM)對(duì)細(xì)菌漆酶的催化活性影響如圖 7所示，以對(duì)照組酶活力為100％，計(jì)算其它條件下的相對(duì)酶活。結(jié)果證明：Co²⁺和Mn²⁺均有增強(qiáng)細(xì)菌漆酶CAHH1的催化活性的效果。

實(shí)施例4：細(xì)菌漆酶CAHH1催化染料脫色的效力分析

以ABTS為介體底物，分析細(xì)菌漆酶CAHH1對(duì)五種染料(40mg/L)：活性藍(lán)19(Remazol Brilliant Blue R，RBBR)、剛果紅(Congo red)、靛藍(lán)胭脂紅(Indigo carmine)、甲基紅(MethyI red)和結(jié)晶紫(Crystal violet)的脫色效力，脫色率通過下述公式計(jì)算：

脫色率％＝(初始吸光值－催化后吸光值)/初始吸光值×100％

結(jié)果如圖8所示。在以ABTS為介體底物時(shí)，細(xì)菌漆酶CAHH1能使剛果紅、靛藍(lán)胭脂紅和結(jié)晶紫有效脫色，脫色率達(dá)80％以上，這顯示出該漆酶在染料的脫色和處理中具有廣闊的應(yīng)用前景。相比之下，該酶對(duì)甲基紅和活性亮藍(lán)19等染料的脫色效力略低。

本發(fā)明所公開的內(nèi)容，相信本領(lǐng)域技術(shù)人員可最大限度地應(yīng)用本發(fā)明。因此前面的具體實(shí)施方案應(yīng)被理解為僅是舉例說明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

<110> 吉林大學(xué)

<120> 一種來源于枯草桿菌ZNXH1的細(xì)菌漆酶基因、細(xì)菌漆酶及其應(yīng)用

<160> 2

<210> 1

<211> 1542

<212> DNA

<213> 枯草桿菌ZNXH1

<220>

<221> CDS

<222> (1)...(1542)

<400> 1

atg aca ctt gaa aaa ttt gtg gat gct ctc cca atc cca gat aca cta

Met Thr Leu Glu Lys Phe Val Asp Ala Leu Pro Ile Pro Asp Thr Leu

1 5 10 15

aag cca gta cag caa tca aaa gaa aaa aca tac tac gaa gtc acc atg

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2025 30

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Glu Glu Cys Thr His Gln Leu His Arg Asp Leu Pro Pro Thr Arg Leu

35 40 45

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Trp Gly Tyr Asn Gly Leu Phe Pro Gly Leu Thr Ile Glu Val Lys Arg

50 55 60

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Asn Glu Asn Val Tyr Val Lys Trp Met Asn Asn Leu Pro Ser Thr His

65 70 75 80

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85 90 95

gag ccc gag gta aag act gtt gtt cat tta cac ggc ggc gtc acg cca

Glu Pro Glu Val Lys Thr Val Val His Leu His Gly Gly Val Thr Pro

100 105 110

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Asp Asp Ser Asp Gly Tyr Pro Glu Ala Trp Phe Ser Lys Asp Phe Glu

115 120 125

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Gln Thr Gly Pro Tyr Phe Lys Arg Glu Val Phe His Tyr Pro Asn Gln

130 135 140

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Gln Arg Gly Ala Ile Leu Trp Tyr His Asp His Ala His Thr Leu Thr

145 150 155 160

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Arg Leu Asn Val Tyr Ala Gly Leu Val Gly Ala Tyr Ile Ile His Asp

165 170 175

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Pro Lys Glu Lys Arg Leu Lys Leu Pro Ser Asp Glu Tyr Asp Val Pro

180 185 190

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Leu Leu Ile Thr Asp Arg Thr Thr Asn Glu Asp Gly Ser Leu Phe Tyr

195 200 205

ccg agc gca ccg gaa aac cct tct ccg tca ctg cct aat cct tca atc

Pro Ser Ala Pro Glu Asn Pro Ser Pro Ser Leu Pro Asn Pro Ser Ile

210 215 220

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Val Pro Ala Phe Cys Gly Glu Thr Ile Leu Val Asn Gly Lys Val Trp

225 230 235 240

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Pro Tyr Leu Glu Val Glu Pro Arg Lys Tyr Arg Phe Arg Val Ile Asn

245 250 255

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Ala Ser Asn Thr Arg Thr Tyr Asn Leu Ser Leu Asp Asn Gly Gly Asp

260 265 270

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Phe Ile Gln Ile Gly Ser Asp Gly Gly Leu Leu Pro Arg Ser Val Lys

275 280 285

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Leu Asn Ser Phe Ser Leu Ala Pro Ala Glu Arg Tyr Asp Ile Ile Ile

290 295 300

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Asp Phe Thr Ala Tyr Glu Gly Glu Ser Ile Ile Leu Ala Asn Ser Ala

305 310 315 320

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Gly Cys Gly Gly Asp Val Asn Pro Glu Thr Asp Ala Asn Ile Met Gln

325 330 335

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Phe Arg Val Thr Lys Pro Leu Ala Gln Lys Asp Glu Ser Arg Lys Pro

340 345 350

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Lys Tyr Leu Ala Ser Tyr Pro Ser Val Gln His Glu Arg Ile Gln Asn

355 360 365

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Ile Arg Thr Leu Lys Leu Ala Gly Thr Gln Asp Glu Tyr Gly Arg Pro

370 375 380

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Val Leu Leu Leu Asn Asn Lys Arg Trp His Asp Pro Val Thr Glu Thr

385 390 395 400

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405 410 415

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420 425 430

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435 440 445

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450 455 460

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Asp Thr Ile Gln Ala His Ala Gly Glu Val Leu Arg Ile Ala Ala Thr

465 470 475 480

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Phe Gly Pro Tyr Ser Gly Arg Tyr Val Trp His Cys His Ile Leu Glu

485 490 495

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500 505 510

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<210> 2

<211> 513

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