本發(fā)明涉及一種利用光倒刺鲃鰭組織建立細(xì)胞系的方法，屬于淡水水生生物細(xì)胞培養(yǎng)和超低溫冷凍保存的技術(shù)領(lǐng)域。

技術(shù)背景

光倒刺鲃(Spinibarbus hollandi)，俗稱青竹鯉、青棍、坑堅(jiān)、光眼魚、黃娟、粗鱗魚，隸屬于鯉科(Cyprinidae)鲃亞科(Barbinae)倒刺鲃屬(Spinibarbus)。歷史上，光倒刺鲃是國內(nèi)幾大水系漁民的主要捕獲對(duì)象，最大個(gè)體達(dá)到25千克以上。主要分布在長江、錢塘江、閩江、九龍江、珠江、元江、臺(tái)灣島及海南島等。根據(jù)近年對(duì)中國境內(nèi)紅河水系的調(diào)查，光倒刺鲃種群衰退十分嚴(yán)重，其種群在紅河流域已經(jīng)偶見。導(dǎo)致光倒刺鲃種群數(shù)量急劇減少原因有：捕撈強(qiáng)度大、梯級(jí)電站開發(fā)和保護(hù)意識(shí)薄弱。經(jīng)過多年研究，中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所已突破光倒刺鲃的人工繁殖，實(shí)現(xiàn)了對(duì)這一經(jīng)濟(jì)魚類個(gè)體水平的保存和恢復(fù)，進(jìn)一步的產(chǎn)業(yè)化將實(shí)現(xiàn)群體水平的保護(hù)，但細(xì)胞水平的研究還未開展，所以發(fā)明人將目光投向了光倒刺鲃的體細(xì)胞培養(yǎng)。

魚類細(xì)胞培養(yǎng)起于20世紀(jì)60年代，發(fā)展至今已建立了280余株細(xì)胞系，中國的魚類細(xì)胞培養(yǎng)歷經(jīng)30多年，只建立了50余株細(xì)胞系，建立細(xì)胞系的物種不足中國魚類總數(shù)的1.5％(中國魚類超過3500種)，由此可見，細(xì)胞系的構(gòu)建速度是非常緩慢的，關(guān)注度不夠、參與的工作者較少可能是其原因之一；其次，相較于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，魚類細(xì)胞培養(yǎng)中更易發(fā)生污染，導(dǎo)致失敗率上升，而現(xiàn)有的專利或文章中大多將這一現(xiàn)象歸結(jié)為技術(shù)不過關(guān)，而鮮少注重魚體本身的質(zhì)量問題，在光倒刺鲃細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)踐中，魚體的生活狀態(tài)也直接影響了細(xì)胞系構(gòu)建的成??；另外，因光倒刺鲃野外生境的局限性，對(duì)其生活習(xí)性的了解較少，這也在一定程度上加大了光倒刺鲃細(xì)胞培養(yǎng)的難度。因此，光倒刺鲃鰭細(xì)胞系的成功構(gòu)建是建立在長期對(duì)光倒刺鲃野生和塘養(yǎng)生態(tài)習(xí)性了解的基礎(chǔ)上。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未見與本發(fā)明的相同報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)以上技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種操作簡便易行的光倒刺鲃鰭細(xì)胞系的構(gòu)建方法，以滿足對(duì)光倒刺鲃快速核型分析、種質(zhì)資源保存和細(xì)胞水平適應(yīng)性研究的需要。

具體地，根據(jù)本發(fā)明提供一種光倒刺鲃鰭細(xì)胞系的構(gòu)建方法，該構(gòu)建方法包括如下步驟：

1)光倒刺鲃鰭的獲?。合扔?0-30mg/L亞甲基藍(lán)浸泡光倒刺鲃魚體消毒20-30分鐘，再用80-120ppm的MS-222麻醉光倒刺鲃魚體；再以75％酒精消毒光倒刺鲃魚體后，取其鰭條，加入HBSS消毒液浸泡取出的光倒刺鲃魚體鰭組織；浸泡15-30分鐘后，將鰭組織用HBSS消毒液清洗3-5次；

2)原代培養(yǎng)：將通過步驟1)獲得的鰭組織剪成約100mm3的組織小塊，并將其接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在22-26℃培養(yǎng)箱中倒置過夜，次日再加入原代培養(yǎng)液，在22-26℃培養(yǎng)箱中啟動(dòng)原代培養(yǎng)，每三天半量更換所述原代培養(yǎng)液，第7-10天細(xì)胞開始從組織塊中遷移，20-30天長成細(xì)胞單層，則為原代鰭細(xì)胞；

3)傳代培養(yǎng)：原代鰭細(xì)胞鋪滿瓶底80％后開始傳代，先吸出培養(yǎng)瓶中的原代培養(yǎng)液，以含0.1-0.2％的胰蛋白酶的胰酶消化法懸起細(xì)胞，細(xì)胞變圓后，加入傳代培養(yǎng)液1-2mL以中和胰酶反應(yīng)，首次傳代按1:1傳，此后按1:2進(jìn)行傳代，于22-26℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；每4-6天傳代一次，傳至第8代時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液換成基礎(chǔ)培養(yǎng)液，所述光倒刺鲃鰭細(xì)胞系建立成功。

進(jìn)一步地，所述HBSS消毒液為含有濃度為200-400IU/mL的青霉素、濃度為200-400μg/mL的鏈霉素、濃度為30-60μg/mL的慶大霉素以及濃度為30-60μg/mL的兩性霉素B的Hanks平衡鹽溶液的混合溶液。

進(jìn)一步地，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液為含有占總體積的10-15％的胎牛血清和濃度為6-10ng/L的細(xì)胞生長因子的DMEM/F12或L-15培養(yǎng)液的溶合溶液。

進(jìn)一步地，所述原代培養(yǎng)液為含有占總體積的15-25％的胎牛血清、濃度為8-12ng/L的細(xì)胞生長因子、濃度為200-400IU/mL的青霉素、濃度為200-400μg/mL的鏈霉素、濃度為30-60μg/mL的慶大霉素以及濃度為30-60μg/mL的兩性霉素B的DMEM/F12或L-15培養(yǎng)液的混合溶液。

優(yōu)選地，所述傳代培養(yǎng)液為含有占總體積的10-20％的胎牛血清、濃度為8-10ng/L的細(xì)胞生長因子、濃度為20-40μg/mL的慶大霉素以及濃度為20-40μg/mL的兩性霉素B的DMEM/F12或L-15培養(yǎng)液的混合溶液。

進(jìn)一步地，所述原代培養(yǎng)液、傳代培養(yǎng)液和基礎(chǔ)培養(yǎng)液的pH值都為7.0-7.2，滲透壓為280-320mOsm/L。

進(jìn)一步地，所述構(gòu)建方法還包括如下細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的步驟：

1)配制細(xì)胞凍存液：凍存液包括胎牛血清和DMSO，按9：1的體積比混合，現(xiàn)用現(xiàn)配；

2)細(xì)胞凍存：取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，經(jīng)上述胰酶消化后，細(xì)胞懸液800-1200rpm離心6-10分鐘，棄掉上清液；向細(xì)胞沉淀中加入配制的細(xì)胞凍存液，重懸，使細(xì)胞的濃度約為1×106個(gè)/mL，將1mL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至1.8mL凍存管中，將凍存管置于程序降溫盒中，-80℃放置24-48小時(shí)，然后放入液氮中長期保存；

3)細(xì)胞復(fù)蘇：將上述凍存管從液氮中取出，放入37℃水浴鍋中快速搖晃至融化；然后在無菌操作臺(tái)中，將解凍細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，并加入等量基礎(chǔ)培養(yǎng)液，800-1000rpm離心6-8分鐘，除上清液；用基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，22-26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5-7天細(xì)胞即長成單層。

本發(fā)明的各步驟中所用的百分比為體積百分比。

本發(fā)明的顯著效果在于：

1.本發(fā)明的構(gòu)建方法操作簡便易行，并且構(gòu)建方法重復(fù)性強(qiáng)，構(gòu)建的細(xì)胞系穩(wěn)定性好。

2.相對(duì)于用于核型分析的血液短期培養(yǎng)，采用本發(fā)明的構(gòu)建方法獲得的鰭組織塊中剛遷移出來的細(xì)胞具有活性，且細(xì)胞量大，可用于染色體分析，可以反復(fù)凍融，可應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、病毒學(xué)、毒理學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)和免疫學(xué)等重要研究。

3.本發(fā)明構(gòu)建的光倒刺鲃鰭細(xì)胞系形態(tài)為成纖維樣，能夠連續(xù)傳代并直接應(yīng)用于生物學(xué)特性研究，滿足了對(duì)光倒刺鲃種質(zhì)資源保存和理論研究及應(yīng)用的需要。

4.細(xì)胞培養(yǎng)不是獨(dú)立事件，需要結(jié)合魚本身的生物學(xué)特點(diǎn)，用本發(fā)明的構(gòu)建方法獲得的光倒刺鲃鰭細(xì)胞是光倒刺鲃首個(gè)細(xì)胞系，為其在免疫學(xué)和毒理學(xué)方面的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1是顯示光倒刺鲃原代培養(yǎng)中鰭組織遷移出細(xì)胞的過程的圖。

圖2是顯示光倒刺鲃原代培養(yǎng)中鰭細(xì)胞單層的圖。

圖3是顯示不同消毒方式對(duì)光倒刺鲃鰭組織塊細(xì)胞遷移的影響圖。

圖4是顯示不同培養(yǎng)液對(duì)光倒刺鲃鰭細(xì)胞生長的影響圖。

具體實(shí)施方式

從下文的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的上述方面和本發(fā)明的其他方面將是明顯的。

實(shí)施例1

1.制備HBSS消毒液和細(xì)胞培養(yǎng)液

HBSS消毒液：向HBSS中加入抗生素，使青霉素的濃度為300IU/mL，鏈霉素濃度為300μg/mL，慶大霉素的濃度為40μg/mL，兩性霉素B濃度為40μg/mL。

基礎(chǔ)培養(yǎng)液：向DMEM/F12培養(yǎng)液中加入細(xì)胞生長因子和胎牛血清，使細(xì)胞生長因子的濃度為8ng/L，胎牛血清占總體積的15％。

原代培養(yǎng)液：向DMEM/F12培養(yǎng)液中加入細(xì)胞生長因子、胎牛血清和抗生素，使細(xì)胞生長因子的濃度為12ng/L，胎牛血清占總體積的20％，青霉素的濃度為300IU/mL，鏈霉素濃度為300μg/mL，慶大霉素的濃度為50μg/mL，兩性霉素B濃度為50μg/mL。

傳代培養(yǎng)液：向DMEM/F12培養(yǎng)液中加入細(xì)胞生長因子+胎牛血清+抗生素，使細(xì)胞生長因子的濃度為8ng/L，胎牛血清占總體積的20％，慶大霉素的濃度為20μg/mL，兩性霉素B濃度為20μg/mL。

調(diào)節(jié)上述培養(yǎng)液的pH值為7.2，滲透壓為300mOsm/L，放置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.原代培養(yǎng)

先用20mg/l亞甲基藍(lán)浸泡消毒30分鐘，再用100ppm的MS-222麻醉光倒刺鲃；再以75％酒精消毒魚體后，置于超凈工作臺(tái)中，用無菌解剖器械取其鰭，置于12孔板中，加入HBSS消毒液浸泡鰭組織。浸泡30分鐘后，將鰭組織用HBSS消毒液清洗3次，剪成組織小塊，并將其接種于25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在26℃培養(yǎng)箱中倒置過夜，次日再加入原代培養(yǎng)液4mL，在26℃培養(yǎng)箱中啟動(dòng)原代培養(yǎng)，每三天半量更換培養(yǎng)液，第8天細(xì)胞開始從組織塊中遷移(圖1)，25天長成細(xì)胞單層(圖2)。

3.傳代培養(yǎng)

原代鰭細(xì)胞鋪滿瓶底80％后開始傳代。傳代培養(yǎng)具體方法如下：先吸出培養(yǎng)瓶中的原代培養(yǎng)液，加入0.1％的胰蛋白酶-EDTA溶液1.5mL，消化2分鐘，細(xì)胞變圓后，加入傳代培養(yǎng)液2mL以中和胰酶反應(yīng)，輕輕吹打瓶底，使貼壁細(xì)胞脫落，首次傳代按1:1傳，此后按1:2進(jìn)行傳代，于26℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；每5天傳代一次，傳至第8代時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液換成基礎(chǔ)培養(yǎng)液，此時(shí)，細(xì)胞系建立成功。目前，細(xì)胞傳代已傳至20代。

4.細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

(a)配制細(xì)胞凍存保護(hù)液：凍存液包括胎牛血清和DMSO，按:9：1的體積比混合，現(xiàn)用現(xiàn)配。

(b)細(xì)胞凍存：取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，經(jīng)上述胰酶消化后，細(xì)胞懸液1000rpm離心8分鐘，棄掉上清液。向細(xì)胞沉淀中加入配制的細(xì)胞凍存液，重懸，使細(xì)胞的濃度約為1×10⁶個(gè)/mL，將1mL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至1.8mL凍存管中，將凍存管置于程序降溫盒中，-80℃放置24小時(shí)，然后放入液氮中長期保存。

(c)細(xì)胞復(fù)蘇：將上述凍存管從液氮中取出，放入37℃水浴鍋中快速搖晃至融化。然后在無菌操作臺(tái)中，將解凍細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，并加入等量基礎(chǔ)培養(yǎng)液，800rpm離心8分鐘，除上清液。用基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，7天細(xì)胞即長成單層。

實(shí)施例2

1.制備HBSS消毒液和細(xì)胞培養(yǎng)液

HBSS消毒液：向HBSS中加入抗生素，使青霉素的濃度為400IU/mL，鏈霉素濃度為400μg/mL，慶大霉素的濃度為30μg/mL，兩性霉素B濃度為30μg/mL。

基礎(chǔ)培養(yǎng)液：向L-15培養(yǎng)液中加入細(xì)胞生長因子和胎牛血清，使細(xì)胞生長因子的濃度為10ng/L，胎牛血清占總體積的15％。

原代培養(yǎng)液：向L-15培養(yǎng)液中加入細(xì)胞生長因子、胎牛血清和抗生素，使細(xì)胞生長因子的濃度為10ng/L，胎牛血清占總體積的20％，青霉素的濃度為300IU/mL，鏈霉素濃度為300μg/mL，慶大霉素的濃度為40μg/mL，兩性霉素B濃度為40μg/mL。

傳代培養(yǎng)液：向L-15培養(yǎng)液中加入細(xì)胞生長因子、胎牛血清和抗生素，使細(xì)胞生長因子的濃度為10ng/L，胎牛血清占總體積的20％，慶大霉素的濃度為30μg/mL，兩性霉素B濃度為30μg/mL。

調(diào)節(jié)上述培養(yǎng)液的pH值為7.0，滲透壓為320mOsm/L，放置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.原代培養(yǎng)

先用30mg/L亞甲基藍(lán)浸泡消毒20分鐘，再用80ppm的MS-222麻醉光倒刺鲃；再以75％酒精消毒魚體后，置于超凈工作臺(tái)中，用無菌解剖器械取其鰭，置于12孔板中，加入HBSS消毒液浸泡鰭組織。浸泡15分鐘后，將鰭組織用HBSS消毒液清洗5次，剪成組織小塊，并將其接種于25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在24℃培養(yǎng)箱中倒置過夜，次日再加入原代培養(yǎng)液5mL，在24℃培養(yǎng)箱中啟動(dòng)原代培養(yǎng)，每三天半量更換培養(yǎng)液，第7天細(xì)胞開始從組織塊中遷移，30天長成細(xì)胞單層。

3.傳代培養(yǎng)

原代鰭細(xì)胞鋪滿瓶底80％后開始傳代。傳代培養(yǎng)具體方法如下：先吸出培養(yǎng)瓶中的原代培養(yǎng)液，加入0.2％的胰蛋白酶-EDTA溶液1mL，消化2分鐘，細(xì)胞變圓后，加入傳代培養(yǎng)液2mL以中和胰酶反應(yīng)，輕輕吹打瓶底，使貼壁細(xì)胞脫落，首次傳代按1:1傳，此后按1:2進(jìn)行傳代，于24℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；每5天傳代一次，傳至第8代時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液換成基礎(chǔ)培養(yǎng)液，此時(shí)，細(xì)胞系建立成功。目前，細(xì)胞傳代已傳至20代。

4.細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

(a)配制細(xì)胞凍存保護(hù)液：凍存液包括胎牛血清和DMSO，按9：1的體積比混合，現(xiàn)用現(xiàn)配。

(b)細(xì)胞凍存：取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，經(jīng)上述胰酶消化后，細(xì)胞懸液800rpm離心10分鐘，棄掉上清液。向細(xì)胞沉淀中加入配制的細(xì)胞凍存液，重懸，使細(xì)胞的濃度約為1×10⁶個(gè)/mL，將1mL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至1.8mL凍存管中，將凍存管置于程序降溫盒中，-80℃放置24小時(shí)，然后放入液氮中長期保存。

(c)細(xì)胞復(fù)蘇：將上述凍存管從液氮中取出，放入37℃水浴鍋中快速搖晃至融化。然后在無菌操作臺(tái)中，將解凍細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，并加入等量基礎(chǔ)培養(yǎng)液，800rpm離心8分鐘，除上清液。用基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，24℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，9天細(xì)胞即長成單層。

實(shí)施例3

1.制備HBSS消毒液和細(xì)胞培養(yǎng)液

HBSS消毒液：向HBSS中加入抗生素，使青霉素的濃度為200IU/mL，鏈霉素濃度為200μg/mL，慶大霉素的濃度為60μg/mL，兩性霉素B濃度為60μg/mL。

基礎(chǔ)培養(yǎng)液：向DMEM/F12培養(yǎng)液中加入細(xì)胞生長因子和胎牛血清，使細(xì)胞生長因子的濃度為10ng/L，胎牛血清占總體積的10％。

原代培養(yǎng)液：向DMEM/F12培養(yǎng)液中加入細(xì)胞生長因子、胎牛血清和抗生素，使細(xì)胞生長因子的濃度為12ng/L，胎牛血清占總體積的15％，青霉素的濃度為200IU/mL，鏈霉素濃度為200μg/mL，慶大霉素的濃度為30μg/mL，兩性霉素B濃度為30μg/mL。

傳代培養(yǎng)液：向DMEM/F12培養(yǎng)液中加入細(xì)胞生長因子、胎牛血清和抗生素，使細(xì)胞生長因子的濃度為10ng/L，胎牛血清占總體積的15％，慶大霉素的濃度為20μg/mL，兩性霉素B濃度為20μg/mL。

調(diào)節(jié)上述培養(yǎng)液的pH值為7.2，滲透壓為300mOsm/L，放置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.原代培養(yǎng)

先用25mg/l亞甲基藍(lán)浸泡消毒25分鐘，再用120ppm的MS-222麻醉光倒刺鲃；再以75％酒精消毒魚體后，置于超凈工作臺(tái)中，用無菌解剖器械取其鰭，置于12孔板中，加入HBSS消毒液浸泡鰭組織。浸泡20分鐘后，將鰭組織用HBSS消毒液清洗4次，剪成組織小塊，并將其接種于25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在22℃培養(yǎng)箱中倒置過夜，次日再加入原代培養(yǎng)液5mL，在22℃培養(yǎng)箱中啟動(dòng)原代培養(yǎng)，每三天半量更換培養(yǎng)液，第10天細(xì)胞開始從組織塊中遷移，30天長成細(xì)胞單層。

3.傳代培養(yǎng)

原代鰭細(xì)胞鋪滿瓶底80％后開始傳代。傳代培養(yǎng)具體方法如下：先吸出培養(yǎng)瓶中的原代培養(yǎng)液，加入0.2％的胰蛋白酶-EDTA溶液1mL，消化2分鐘，細(xì)胞變圓后，加入傳代培養(yǎng)液2mL以中和胰酶反應(yīng)，輕輕吹打瓶底，使貼壁細(xì)胞脫落，首次傳代按1:1傳，此后按1:2進(jìn)行傳代，于22℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；每7天傳代一次，傳至第8代時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)液換成基礎(chǔ)培養(yǎng)液，此時(shí)，細(xì)胞系建立成功。目前，細(xì)胞傳代已傳至20代。

4.細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

(a)配制細(xì)胞凍存保護(hù)液：凍存液包括DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清和DMSO，按4.5：4.5：1的體積比混合，現(xiàn)用現(xiàn)配。

(b)細(xì)胞凍存：取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，經(jīng)上述胰酶消化后，細(xì)胞懸液1200rpm離心6分鐘，棄掉上清液。向細(xì)胞沉淀中加入配制的細(xì)胞凍存液，重懸，使細(xì)胞的濃度約為1×10⁶個(gè)/mL，將1mL細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至1.8mL凍存管中，將凍存管置于程序降溫盒中，-80℃放置48小時(shí)，然后放入液氮中長期保存。

(c)細(xì)胞復(fù)蘇：將上述凍存管從液氮中取出，放入37℃水浴鍋中快速搖晃至融化。然后在無菌操作臺(tái)中，將解凍細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，并加入等量基礎(chǔ)培養(yǎng)液，1000rpm離心6分鐘，除上清液。用基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，22℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，9天細(xì)胞即長成單層。

實(shí)施例4

對(duì)實(shí)施例1的光倒刺鲃的魚體采用不同消毒方法進(jìn)行比較。

將實(shí)施例1中的光倒刺鲃分別采用最常見的高錳酸鉀浸泡消毒、亞甲基藍(lán)浸泡消毒、酒精消毒、高錳酸鉀+酒精聯(lián)合消毒和亞甲基藍(lán)+酒精聯(lián)合消毒，其他步驟與實(shí)施例1中的步驟相同。結(jié)果顯示(參見圖2)，在整個(gè)原代培養(yǎng)過程中，高錳酸鉀消毒和高猛酸鉀+酒精聯(lián)合消毒表現(xiàn)出較低的組織塊細(xì)胞遷移率，且隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，某些遷移出細(xì)胞的組織塊會(huì)脫落而不會(huì)再重新貼壁遷移出細(xì)胞；在不發(fā)生污染的情況下，亞甲基藍(lán)+酒精聯(lián)合消毒可獲得較高的組織塊細(xì)胞遷移率，且隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，鰭組織塊基本都能遷移出細(xì)胞，且脫落的組織塊較少。

因光倒刺鲃生活于流水環(huán)境，細(xì)胞更易受污染，聯(lián)合消毒的效果更好一些，但對(duì)于光倒刺鲃而言，高猛酸鉀的毒性較大，在降低污染率的同時(shí)也影響了組織塊細(xì)胞的遷出，因此，亞甲基藍(lán)+酒精聯(lián)合消毒是更為合適的消毒方式。

實(shí)施例5

對(duì)實(shí)施例1的細(xì)胞培養(yǎng)液的基液采用不同的培養(yǎng)液進(jìn)行比較。

將實(shí)施例1中的培養(yǎng)液替換成魚類細(xì)胞培養(yǎng)常用的幾種培養(yǎng)液DMEM、DMEM(高糖)、DMEM/F12、L-15、M199、M1640，對(duì)比這些不同培養(yǎng)液對(duì)光倒刺鲃鰭細(xì)胞生長的影響(參見圖3)。結(jié)果顯示，不同培養(yǎng)液條件下，細(xì)胞的生長速率不同，貼壁率也不同。細(xì)胞培養(yǎng)一天后，DMEM/F12和L-15的貼壁細(xì)胞較多，其次是DMEM和DMEM(高糖)，而M199和M1640培養(yǎng)液貼壁的細(xì)胞最少；隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，各種培養(yǎng)液條件下，細(xì)胞數(shù)量都有不同程度的增加，其中，DMEM/F12和L-15培養(yǎng)液細(xì)胞的生長速率最快，DMEM和DMEM(高糖)次之，而M199和M1640的細(xì)胞生長速率最慢，細(xì)胞數(shù)量無明顯增加，DMEM/F12和L-15培養(yǎng)液下的細(xì)胞數(shù)量約為DMEM和DMEM(高糖)細(xì)胞數(shù)量的兩倍。因此，對(duì)于光倒刺鲃鰭細(xì)胞而言，DMEM/F12和L-15的效果最好，其他四種培養(yǎng)液并不適合細(xì)胞生長。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，盡管為了舉例說明的目的，本文描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但可以對(duì)其進(jìn)行各種修改而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。因此，本發(fā)明的具體實(shí)施方式和實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)視為限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明僅受所附權(quán)利要求的限制。本申請(qǐng)中引用的所有文獻(xiàn)均完整地并入本文作為參考。