本發(fā)明涉及二羥基青蒿素、其制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：青蒿素(Qinghaosu，Artemisinin，見(jiàn)式(A))是從中草藥黃花蒿里提取出的含過(guò)氧基團(tuán)的倍半萜內(nèi)酯。但存在近期復(fù)燃率高、體內(nèi)半衰期短、水溶性小等缺點(diǎn)，為此，有機(jī)化學(xué)家和藥物學(xué)家對(duì)青蒿素進(jìn)行了大量的結(jié)構(gòu)改造，希望找到更為理想的抗瘧新藥。通過(guò)大量的研究表明過(guò)氧橋環(huán)結(jié)構(gòu)是最主要的藥效團(tuán)，環(huán)的擴(kuò)大和縮小都會(huì)引起抗瘧活性的降低。而C6、C7和C8原子很難用化學(xué)方法直接修飾，所以青蒿素衍生化的部位主要集中在C9到O11的內(nèi)酯環(huán)，尤其是以C10位的改造最為常見(jiàn)。其中二氫青蒿素(Dihydroartemisinin)、蒿甲醚(Artemether)和青蒿琥酯(Artesunate)是對(duì)C10位氧原子修飾的典范。2006年世界衛(wèi)生組織(WHO)開(kāi)始強(qiáng)力推行ACTs(artemisinin-basedcombinationtherapies，以青蒿素為基礎(chǔ)的聯(lián)合用藥療法)，這三個(gè)化合物都榜上有名。但是，2005年科學(xué)雜志報(bào)導(dǎo)要警惕個(gè)別瘧原蟲(chóng)對(duì)青蒿素敏感性降低，2009年有少量報(bào)道在柬埔寨泰國(guó)邊界出現(xiàn)了對(duì)青蒿琥酯(Artesunate)耐藥的瘧原蟲(chóng)，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)該瘧原蟲(chóng)還致使ACTs的敏感性降低，但所幸沒(méi)有擴(kuò)散。2010年Enserink等在Science雜志上撰文擔(dān)心現(xiàn)有的ACTs采用的三種C10位上氧原子修飾的青蒿素類藥物結(jié)構(gòu)太過(guò)于近似，將會(huì)產(chǎn)生交叉性耐藥，未來(lái)世界將面臨著爆發(fā)大規(guī)模瘧疾的威脅。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種修飾C6、C7位的二羥基青蒿素，以解決上述技術(shù)問(wèn)題中的至少一個(gè)。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述二羥基青蒿素的制備方法，以解決上述技術(shù)問(wèn)題中的至少一個(gè)。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供上述二羥基青蒿素的應(yīng)用，以解決上述技術(shù)問(wèn)題中的至少一個(gè)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種二羥基青蒿素，其結(jié)構(gòu)如式(Ⅰ)所示：根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了上述二羥基青蒿素的制備方法，包括以下步驟：(1)微生物發(fā)酵制備：將菌種雅致小克銀漢霉、產(chǎn)黃青霉或華根霉、層出鐮刀菌、葡枝根霉或少根根霉的斜面培養(yǎng)物接種于種子培養(yǎng)基中，在25～30℃、轉(zhuǎn)速150～200rpm下培養(yǎng)1～4天，獲得種子液；菌種雅致小克銀漢霉(Cunninghamellaelegans)ATCC9245購(gòu)買于美國(guó)菌種保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)；將種子液以5％(V/V)的接種量接種于1～1.2L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在25～30℃、轉(zhuǎn)速150～200rpm下培養(yǎng)1～4天，再加入青蒿素10～30mL濃度為20～30mg/mL的青蒿素-甲醇溶液，然后，搖勻，繼續(xù)在25～30℃、轉(zhuǎn)速150～200rpm下培養(yǎng)10～20天，得到發(fā)酵液；種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基(一般需在121℃滅菌30min)可以為：10～30g沙氏葡萄糖肉湯(SabouraudDextroseBroth(Difco))、10～30g蔗糖、5～25蛋白胨和1000mL去離子水的混合物；(2)提取分離將上述發(fā)酵液過(guò)濾，分為菌絲和濾液兩部分，菌絲棄去，濾液用等體積乙酸乙酯萃取1～3次，萃取液經(jīng)減壓濃縮得浸膏，浸膏用硅膠柱(300–400目)進(jìn)行柱層析分離(10～50％的乙酸乙酯-正己烷梯度洗脫)，得到二羥基青蒿素。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了上述二羥基青蒿素在制備治療瘧疾藥物上的應(yīng)用。附圖說(shuō)明圖1為式(Ⅰ)化合物的單晶結(jié)構(gòu)圖。圖2為式(Ⅰ)化合物的核磁共振氫譜圖。圖3為式(Ⅰ)化合物的核磁共振碳譜圖。圖4為式(Ⅰ)化合物的質(zhì)譜圖。具體實(shí)施方式下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。一、二羥基青蒿素的制備菌種雅致小克銀漢霉(Cunninghamellaelegans)ATCC9245購(gòu)買于美國(guó)菌種保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)。種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基均為:20g沙氏葡萄糖肉湯(SabouraudDextroseBroth(Difco)),15g蔗糖,10g蛋白胨,1000mL去離子水，121℃滅菌30min。將菌種雅致小克銀漢霉ATCC9245的斜面培養(yǎng)物接種于種子培養(yǎng)基，在28℃，轉(zhuǎn)速180rpm下培養(yǎng)2天，獲得種子液。將種子液以5％(V/V)的接種量接種于20個(gè)裝有1L發(fā)酵培養(yǎng)基的4L搖瓶中，在28℃、轉(zhuǎn)速180rpm條件下培養(yǎng)2天，每瓶加入底物青蒿素500mg(青蒿素用甲醇溶解成濃度為25mg/mL，每瓶加20mL該溶液，20瓶總共加入青蒿素10g)。加入底物后搖瓶繼續(xù)在28℃、轉(zhuǎn)速180rpm條件下培養(yǎng)14天。將上述發(fā)酵液過(guò)濾，分為菌絲和濾液兩部分，菌絲棄去。濾液用等體積乙酸乙酯萃取3次，提取液經(jīng)減壓濃縮得浸膏約11g。浸膏用硅膠(300–400目)柱進(jìn)行柱層析分離(10％-50％的乙酸乙酯-正己烷梯度洗脫)，得到無(wú)色針狀結(jié)晶6β,7α-二羥基青蒿素225mg，轉(zhuǎn)化率2.3％。二、化合物的確認(rèn)上述制備方法得到的化合物，經(jīng)1H-NMR、13C-NMR以及X-單晶衍射得以確認(rèn)為6β,7α-二羥基青蒿素；其1H-NMR和13C-NMR譜圖分別如圖2和圖3所示，X-單晶衍射譜圖如圖1所示。HRMSm/z:C15H22O7：[M+Na]+理論值337.1263,實(shí)測(cè)值337.1284，[2M+Na]+理論值651.2628,實(shí)測(cè)值651.2675，質(zhì)譜圖如圖4所示。產(chǎn)物6β,7α-二羥基青蒿素的核磁共振譜數(shù)據(jù)如下：1HNMR(CD3OD,400MHz)δ6.58(1H,s,H-12),3.54(1H,brs,H-7β),3.33(1H,m,H-9),2.45(1H,m,H-4α),2.37(1H,m,H-8a),2.15(1H,m,H-4β),2.10(1H,m,H-5α),1.98(1H,m,H-5a),1.79(1H,m,H-8α),1.77(1H,m,H-5β),1.72(1H,m,H-8β),1.40(3H,s,Me-13),1.29(3H,s,Me-14),1.18(3H,d,J＝7.3Hz,Me-15)。13CNMR(CD3OD,100MHz)δ175.5(s,C-10),106.6(s,C-3),96.8(d,C-12),81.4(s,C-12a),75.1(s,C-6),74.4(d,C-7),48.1(d,C-5a),38.8(d,C-8a),36.9(t,C-4),33.8(d,C-9),27.6(t,C-8),25.8(q,C-14),25.6(q,C-13),19.8(t,C-5),13.0(q,C-15)。三、化合物的活性實(shí)驗(yàn)1、瘧原蟲(chóng)的培養(yǎng)按Trager&Jensen(Trager,W.,andJensen,J.B..Humanmalariaparasitesincontinuousculture.Science1976,193:673-675.)以及Haynes(Haynes,J.D.,Diggs,C.L.,Hines,F.A.andDesjardins,R.E..CultureofhumanmalariaparasitesPlasmodiumfalciparum.Nature1976,263:767-769.)法建立瘧原蟲(chóng)P.falciparumW2株體外培養(yǎng)體系。瘧原蟲(chóng)培養(yǎng)基為含25mmol/LHEPES、32mmol/LNaHCO3及10％A型人血清的RMPI1640。A型紅細(xì)胞用培養(yǎng)基稀釋至紅細(xì)胞比容為6％。培養(yǎng)條件為37℃、5％CO2、5％O2及90％N2。2、6β,7α-二羥基青蒿素的體外抗瘧活性試驗(yàn)采用半自動(dòng)微量稀釋技術(shù)測(cè)定產(chǎn)物6β,7α-二羥基青蒿素的抗瘧活性。藥物先用70％乙醇溶解,再用培養(yǎng)基稀釋至8.0μM，保證乙醇含量在0.1％以下。采用Desjardins法(Desjardins,R.E.,Canfield,C.J.,Haynes,J.D.,andChulayJ.D..Quantitativeassessmentofantimalarialactivityinvitrobyasemiautomatedmicrodilutiontechnique.Antimicrob.AgentsChemother.1979,16:710-718.)用微量滴定板測(cè)定藥物的抗瘧活性。微量滴定板使用96孔板,每孔加培養(yǎng)基25μL。在板子的第二行(B)，每孔可加25μL待測(cè)的8.0μM藥液，B行的孔加好藥液后，用自動(dòng)稀釋器將板子的每列進(jìn)行連續(xù)的2倍稀釋，使每種藥物有7種濃度，稀釋范圍64倍，最高濃度8.0μM在B行，2倍稀釋后最低濃度0.125μM在H行。每塊板可以測(cè)定12列數(shù)據(jù)，如果做2個(gè)復(fù)孔，則可以測(cè)定12/3＝4個(gè)化合物(本實(shí)驗(yàn)中用1～3孔測(cè)定6β,7α-二羥基青蒿素)。這樣，A行的1-8孔是瘧原蟲(chóng)對(duì)照(沒(méi)有藥物)，9-12孔是紅細(xì)胞對(duì)照(沒(méi)有藥物和瘧原蟲(chóng))，B行的1-3孔是8.0μM的6β,7α-二羥基青蒿素，C行的1-3孔是4.0μM的6β,7α-二羥基青蒿素，D行的1-3孔是2.0μM的6β,7α-二羥基青蒿素，E行的1-3孔是1.0μM的6β,7α-二羥基青蒿素，F(xiàn)行的1-3孔是0.5μM的6β,7α-二羥基青蒿素，G行的1-3孔是0.25μM的6β,7α-二羥基青蒿素，H行的1-3孔是0.125μM的6β,7α-二羥基青蒿素。除了A行最后的4個(gè)孔，200μL瘧原蟲(chóng)感染的紅細(xì)胞懸浮液被加到微量滴定板的每個(gè)孔里。A行最后的4個(gè)孔每孔加入200μL等量的非瘧原蟲(chóng)感染的A型人紅細(xì)胞懸浮液。這樣每個(gè)孔總體積是225μL。A行最開(kāi)始的8個(gè)孔，不含藥物，是瘧原蟲(chóng)對(duì)照。A行最后的4個(gè)孔，既不含藥物也不含瘧原蟲(chóng)，是非瘧原蟲(chóng)感染的紅細(xì)胞對(duì)照。完成后，微量滴定板置于潮濕密閉的CO2培養(yǎng)箱中(5％CO2、5％O2及90％N2)，37℃培養(yǎng)24小時(shí),然后從箱中取出,每孔加入25μL的含有0.5μCi[G-3H]-次黃嘌呤的培養(yǎng)基,再置入箱中培育18小時(shí),最后用自動(dòng)細(xì)胞收集器采集每孔的固體殘留物,通過(guò)次黃嘌呤的攝入量(測(cè)量每分鐘衰變數(shù)，DPM)來(lái)反映原蟲(chóng)的生長(zhǎng)指數(shù)(需扣除非瘧原蟲(chóng)感染的紅細(xì)胞對(duì)照組的DPM)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Desjardins法進(jìn)行分析，所用的統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件是SPSS20，按照常規(guī)，DPM增量小于瘧原蟲(chóng)對(duì)照組DPM增量50％的孔視為有效，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。表1：第一次實(shí)驗(yàn)采集的Disintegrationsperminute(dpm)數(shù)據(jù)123456789101112A4900949210487304924049500500404904849687770725787756B102021067810339C117181164711233D135681376013883E172521775617665F244822469724569G314913206732432H348073420234814經(jīng)軟件處理得到IC50＝0.49uM表2：第二次實(shí)驗(yàn)采集的Disintegrationsperminute(dpm)數(shù)據(jù)經(jīng)軟件處理得到IC50＝0.57uM表3：第三次實(shí)驗(yàn)采集的Disintegrationsperminute(dpm)數(shù)據(jù)123456789101112A5623055878553475747956348559455691655745690731724707B117891096211982C12451211624780D160081497614665E213782010719432F276862814227173G373743615736547H402793914839357經(jīng)軟件處理得到IC50＝0.47uM結(jié)合3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示6β,7α-二羥基青蒿素抗瘧活性IC50值為0.51±0.05μM，證明本發(fā)明的二羥基青蒿素有一定的抗瘧活性，可以用于制備治療治療瘧疾的藥物。以上所述的僅是本發(fā)明的一些實(shí)施方式。對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3