本發(fā)明涉及一種燕窩制品的鑒定方法，尤其是涉及一種燕窩制品的實(shí)時熒光定量PCR鑒定方法以及相關(guān)的試劑盒。
背景技術(shù)：
：燕窩是雨燕科(Apodidae)金絲燕屬(Collocalia)幾種鳥類在繁殖期用分泌出的唾液或胃液與其自身的羽毛、雜草、苔蘚等混合凝結(jié)而筑成的巢窩，凝結(jié)于人煙稀少的懸崖峭壁或巖洞之中。燕窩又稱燕菜，最早在書籍《本草備要》記載為宜藥宜膳的珍貴藥材。現(xiàn)代臨床試驗(yàn)證實(shí)燕窩有一定的藥用價值，不僅是一種有效的預(yù)防流感病毒的“稀世名藥”，也是營養(yǎng)價值極高的補(bǔ)品,物以稀為貴，故有“東方珍品”的美稱。產(chǎn)可食用燕窩的金絲燕生活的特定區(qū)域位于馬來西亞、印尼、越南等地及我國的福建、廣東沿海地區(qū)。近年來，隨著人們不斷發(fā)現(xiàn)越來越多燕窩的功效，全球的燕窩產(chǎn)量呈穩(wěn)定上升趨勢。目前，燕窩的鑒別方法主要有理化鑒別、光譜鑒定、色譜鑒定、生物分子鑒定、感官鑒定及多種方法結(jié)合鑒定，這些方法存在準(zhǔn)確性不高、靈敏度低、重現(xiàn)性差等特征。實(shí)時熒光定量PCR(RealtimePCR)技術(shù)具有高靈敏度、高重復(fù)性等特征，目前在生物制品的真?zhèn)螜z測方面發(fā)揮了重要作用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種快速、敏感的檢測和篩選真?zhèn)窝喔C的TaqMan探針實(shí)時熒光定量PCR檢測燕窩的鑒定方法。本發(fā)明所述的燕窩制品的實(shí)時熒光定量PCR鑒定試劑盒包括：正向引物，序列為5’-TGAATTGAGCCTGTCGTCTG-3’(SEQIDNO.1)；反向引物，序列為5’-TGCTCCATAGCCAAACAAGA-3’(SEQIDNO.2)；TaqMan熒光探針，序列為5’-FAM-ATGCTGTCTCTTTCCTCAGGA-TAMRA-3’(SEQIDNO.3)；其中，所述TaqMan熒光探針的5’端標(biāo)記熒光報告基團(tuán)，3’端標(biāo)記非熒光淬滅基團(tuán)。根據(jù)本發(fā)明所述的燕窩制品的實(shí)時熒光定量PCR鑒定試劑盒的進(jìn)一步特征，所述熒光報告基團(tuán)是FAM，所述非熒光淬滅基團(tuán)為TAMRA。本發(fā)明還提供了一種燕窩制品的實(shí)時熒光定量PCR鑒定方法。本發(fā)明所述的燕窩制品的實(shí)時熒光定量PCR鑒定方法包括以下步驟：提供本發(fā)明所述的實(shí)時熒光定量PCR鑒定試劑盒；根據(jù)所述試劑盒，配制一定組分濃度的25μLPCR反應(yīng)體系；提取待測的燕窩制品的DNA，加入到反應(yīng)體系中，進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)；收集熒光信號，檢測Ct值。根據(jù)本發(fā)明所述的燕窩制品的實(shí)時熒光定量PCR鑒定方法的進(jìn)一步特征，所述25μLPCR反應(yīng)體系包括：根據(jù)本發(fā)明所述的燕窩制品的實(shí)時熒光定量PCR鑒定方法的進(jìn)一步特征，所述實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，95℃變性15s，60℃退火45s，60℃延伸35s，40個循環(huán)，終末延伸60℃5min。1)樣本用裂解液和DNA抽提液處理，提取燕窩樣本DNA；2)實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)，配制一定組分濃度的25μLPCR反應(yīng)體系，混勻后短暫離心分裝到PCR管中；3)將待測樣品加入到反應(yīng)體系中，進(jìn)行擴(kuò)增；4)收集熒光信號，檢測Ct值。進(jìn)一步，所述實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)的體系組分及其體積如下：擴(kuò)增條件：采用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增條件。本發(fā)明的有益效果在于：采用TaqMan探針實(shí)時熒光定量PCR(Real-timePCR)檢測燕窩的鑒定方法，該鑒定方法包括設(shè)計一對引物和探針對待檢樣本進(jìn)行實(shí)時定量檢測，通過特異性擴(kuò)增金絲燕的12SrRNA基因序列對燕窩制品進(jìn)行鑒定，擴(kuò)增的DNA片段大小為144bp。本發(fā)明利用了PCR對DNA的高效擴(kuò)增，探針技術(shù)的高特異性和光譜技術(shù)的敏感性以及定量的特點(diǎn)，克服常規(guī)PCR檢測的不足，具有直觀、高度特異性、檢測時速度快、步驟簡單、重復(fù)性好、靈敏度高、可進(jìn)行多重定量的特點(diǎn)。在實(shí)際快速診斷中有極強(qiáng)的操作性。附圖說明圖1燕窩基因片段實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增曲線；具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡釋本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍，下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件和方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。以下實(shí)施例中所使用的引物和探針序列如下：正向引物，序列為5’-TGAATTGAGCCTGTCGTCTG-3’(SEQIDNO.1)；反向引物，序列為5’-TGCTCCATAGCCAAACAAGA-3’(SEQIDNO.2)；TaqMan熒光探針，序列為5’-FAM-ATGCTGTCTCTTTCCTCAGGA-TAMRA-3’(SEQIDNO.3)；實(shí)施例1：1.待檢樣品為燕窩樣品的DNA提取液，陽性對照為血燕血液的DNA提取液，陰性對照為DNase-FreeWater。2.燕窩樣品的DNA提?。喊碤IPromega試劑盒使用說明書提取樣品DNA。具體操作步驟如下：①稱量：用潔凈鑷子和剪刀取得適量燕窩，剪碎，用電子分析天平稱量，將剪碎的燕窩樣品分別置于2ml離心管中，做好標(biāo)記；②裂解：向裝有燕窩樣品的離心管中分別加入500l核酸裂解液，使其充分浸泡裂解樣品；使用渦旋振蕩器混勻后于恒溫加熱器以65(±2)℃溫浴15min；③除RNA：向各離心管液面分別加入2ulRNase溶液，反復(fù)吹打混勻；于恒溫加熱器以37(±2)℃溫浴15min，繼續(xù)下一步驟前需室溫冷卻放置5min；④除蛋白：向各離心管中分別加入200l蛋白沉淀液后，使用渦旋振蕩器振蕩30s，充分混勻；使用微量離心機(jī)以13000-16000r/min離心2min，轉(zhuǎn)移上清至另一潔凈2ml離心管中；向裝有上清的離心管中分別加入500lTris飽和酚，使用渦旋振蕩器振蕩30s混勻；使用微量離心機(jī)以13000-16000r/min離心2min，轉(zhuǎn)移上清；再次除去蛋白，蛋白質(zhì)難以一步完全除去；向裝有上清的離心管中分別加入500l氯仿溶液，顛倒混勻離心管數(shù)次；使用微量離心機(jī)以13000-16000r/min高速離心2min，轉(zhuǎn)移上清；⑤向各離心管分別加入與上清液等體積的異丙醇溶液，輕柔顛倒混勻；將離心管于冰箱-20℃靜置10min，冷凍析出并沉淀DNA；使用微量離心機(jī)以13000-16000r/min離心3min后，小心地棄去上清液；⑥洗滌：向各離心管中分別加入500l的70％乙醇溶液，傾斜并輕輕轉(zhuǎn)動離心管數(shù)圈；使用微量離心機(jī)以13000-16000r/min快速離心1min后，小心地棄去洗滌液，可在離心管底部發(fā)現(xiàn)小團(tuán)略透明白色DNA沉淀；打開離心管管蓋，管口向下，用吸水紙吸收并室溫晾干管內(nèi)液體，需要約1-2小時；⑦溶解：向已晾干的離心管中加入50lTE緩沖液，用移液槍反復(fù)吹打溶解DNA，于冰箱4℃保存?zhèn)溆茫?.配制反應(yīng)體系每個反應(yīng)管中包含以下試劑：在1.5mL離心管中配制4個除模板DNA外的體系，混勻后短暫離心分裝到3個PCR反應(yīng)管中，分別加入陰性對照、待檢樣品DNA、陽性對照。4.上機(jī)，在如下條件下進(jìn)行擴(kuò)增，95℃預(yù)變性5min，95℃變性15s，60℃退火45s，60℃延伸35s，40個循環(huán)，終末延伸60℃5min。擴(kuò)增條件：采用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增條件。5.收集熒光信號，檢測Ct值。6.結(jié)果判斷：根據(jù)陽性對照，陰性對照Ct值判斷。當(dāng)Ct值小于等于37時，即判斷為陽性。如圖1所示為燕窩樣品擴(kuò)增曲線。實(shí)施例2：按照實(shí)施例1處理方法，采用QiAquick試劑盒法測定不同樣品的CT值，所得結(jié)果見表2。表2：不同燕窩樣品的CT值品牌樣品質(zhì)量(mg)CT值A(chǔ)4044.21A5015.76A6012.49B4035.20B5034.61B6042.43C4047.04C5040.36C6044.13SEQUENCELISTING<110>肇慶學(xué)院<120>一種燕窩制品的實(shí)時熒光定量PCR鑒定試劑盒及其鑒定方法<130><160>3<170>PatentInversion3.4<210>1<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>1tgaattgagcctgtcgtctg20<210>2<211>48<212>DNA<213>人工合成<400>2tgctccatagccaaacaaga20<210>3<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>3atgctgtctctttcctcagga21當(dāng)前第1頁1 2 3