本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種α-葡萄糖苷酶抑制劑的制備方法。此外，本發(fā)明還涉及一種α-葡萄糖苷酶抑制劑。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，糖尿病在全世界廣泛流行，目前已成為繼腫瘤、心血管疾病之后第三大類嚴(yán)重危害人類健康的慢性疾病。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)、社會(huì)的迅速發(fā)展，膳食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變，人口老齡化速度的加快，糖尿病的患病率也呈現(xiàn)快速增加的趨勢(shì)。在糖尿病患病率快速上升的同時(shí)，我國(guó)糖尿病的知曉率、治療率及控制率明顯偏低。糖尿病已成為一個(gè)嚴(yán)重危害我國(guó)人群健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題，對(duì)經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展產(chǎn)生越來(lái)越嚴(yán)重的影響。
根據(jù)發(fā)病機(jī)制不同，糖尿病分為I型糖尿病(胰島素依賴型)和II型糖尿病(非胰島素依賴型)，后者約占糖尿病總數(shù)的85％以上。迄今為止，治療II型糖尿病的藥物根據(jù)治療機(jī)制不同主要分為：(1)促胰島素分泌劑；(2)胰島素增敏劑；(3)α-葡萄糖苷酶抑制劑(α-GI)。由于α-GI具有作用溫和持久、毒副作用小甚至無(wú)毒的優(yōu)點(diǎn)，因此得到越來(lái)越多國(guó)內(nèi)外研究者的青睞。
研究表明，α-葡萄糖苷酶抑制劑(α-GI)可有效地降低糖尿病人的餐后高血糖，作為口服降糖藥的一種，其發(fā)生作用的場(chǎng)所位于小腸，作用方式是抑制小腸體內(nèi)的α-葡萄糖苷酶活性，從而達(dá)到降低餐后高血糖的目的。如果使用者飲食中碳水化合物占50％以上，則降糖效果更為明顯，因此其適用于以碳水化合物為主食的人群，尤其是中老年糖尿病患者。
目前所發(fā)現(xiàn)的α-GI雖能克服傳統(tǒng)降糖藥的一些缺點(diǎn)，但其來(lái)源相對(duì)狹窄，主要集中于放線菌，導(dǎo)致α-葡萄糖苷酶抑制劑來(lái)源不足，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的問(wèn)題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
基于上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種α-葡萄糖苷酶抑制劑制備的新方法，以牛類芽孢桿菌CGMCC No.8333為發(fā)酵菌株，以脫脂乳作為培養(yǎng)基，發(fā)酵制得α-葡萄糖苷酶抑制劑。
具體的，一方面，提供了一種α-葡萄糖苷酶抑制劑的制備方法，包括以下步驟：(a)將牛類芽孢桿菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333接種于脫脂乳中進(jìn)行發(fā)酵，得到發(fā)酵乳；(b)將步驟(a)得到的發(fā)酵乳滅菌，離心取上清，超濾取分子量不大于10,000Da的部分，冷凍干燥，得到α-葡萄糖苷酶抑制劑。
進(jìn)一步地，上述步驟(a)中，牛類芽孢桿菌CGMCC No.8333的接種量為1.25x106～1x107cfu/mL。
進(jìn)一步地，上述步驟(a)中，脫脂乳包括脫脂乳粉和水，脫脂乳粉占脫脂乳的質(zhì)量百分比為6～12％。
進(jìn)一步地，上述步驟(a)中，發(fā)酵為振蕩培養(yǎng)，振蕩速度為100～300rpm。
進(jìn)一步地，上述步驟(a)中，發(fā)酵的溫度為20℃～35℃。
進(jìn)一步地，上述步驟(a)中，發(fā)酵的時(shí)間為3～12h。
進(jìn)一步地，上述步驟(b)中，離心的速度為8,000～12,000g，離心的時(shí)間為5～10分鐘。
另一方面，還提供了一種α-葡萄糖苷酶抑制劑，由上述任一種制備方法制得。
進(jìn)一步地，上述α-葡萄糖苷酶抑制劑對(duì)α-葡萄糖苷酶的半抑制率濃度IC50≤55mg/mL。
上述技術(shù)方案中的制備方法，首次采用牛類芽孢桿菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333，以脫脂乳作為培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，并經(jīng)過(guò)滅菌，離心，超濾，冷凍干燥，制備得到α-葡萄糖苷酶抑制劑，披露了牛類芽孢桿菌CGMCC No.8333具有發(fā)酵脫脂乳生成α-葡萄糖苷酶抑制劑的新用途，拓寬了α-葡萄糖苷酶抑制劑的來(lái)源。同時(shí)，牛類芽孢桿菌CGMCC No.8333發(fā)酵脫脂乳所制備的α-葡萄糖苷酶抑制劑的活性顯著，穩(wěn)定性好。
具體實(shí)施方式
為更清楚的對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案予以闡述，下面將結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步闡述：
在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，提供了一種α-葡萄糖苷酶抑制劑的制備方法，包括以下步驟：(a)將牛類芽孢桿菌(Paenibacillus bovis)CGMCC No.8333接種于脫脂乳中進(jìn)行發(fā)酵，得到發(fā)酵乳；(b)將步驟(a)得到的發(fā)酵乳滅菌，離心取上清，超濾取分子量不大于10,000Da的部分，冷凍干燥，得到α-葡萄糖苷酶抑制劑。
上述技術(shù)方案中的制備方法，首次采用牛類芽孢桿菌CGMCC No.8333，以脫脂乳作為培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，并經(jīng)過(guò)滅菌，離心，超濾，冷凍干燥，制備得到α-葡萄糖苷酶抑制劑，披露了牛類芽孢桿菌CGMCC No.8333具有發(fā)酵脫脂乳生成α-葡萄糖苷酶抑制劑的新用途，拓寬了α-葡萄糖苷酶抑制劑的來(lái)源。同時(shí)，牛類芽孢桿菌CGMCC No.8333發(fā)酵脫脂乳所制備的α-葡萄糖苷酶抑制劑的活性顯著，穩(wěn)定性好。
此外，上述技術(shù)方案中的制備方法極大簡(jiǎn)化了生產(chǎn)步驟，避免了傳統(tǒng)復(fù)雜工藝可能帶來(lái)的污染問(wèn)題；其次，整個(gè)制備過(guò)程不涉及任何有機(jī)溶劑，因此從根本上杜絕了有機(jī)溶劑殘留的問(wèn)題。制備所采用的發(fā)酵培養(yǎng)基來(lái)源廣泛、成本低廉、天然安全，避免使用化學(xué)合成培養(yǎng)基；加上發(fā)酵菌種采用牛類芽孢桿菌這一種單一菌種，上述的原料、菌種的組合，有利于產(chǎn)品品質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)化與工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)的成本控制。
進(jìn)一步地，步驟(a)中，牛類芽孢桿菌CGMCC No.8333的接種量為1.25x106～1x107cfu/mL；較佳地為2.5x106～7.5x106cfu/mL，更佳地為5x106cfu/mL。
進(jìn)一步地，上述步驟(a)中，脫脂乳可以是新鮮的脫脂乳，也可以是配制而成的脫脂乳。優(yōu)選的為配制的脫脂乳，配制的脫脂乳包括脫脂乳粉和水，脫脂乳粉占脫脂乳的質(zhì)量百分比為6～12％。制備方法可以包括以下步驟：在蒸餾水中加入脫脂乳粉，混勻充分溶解后，95～125℃滅菌5～20分鐘，冷卻即得。
進(jìn)一步地，上述步驟(a)中，優(yōu)選的發(fā)酵溫度為20℃～35℃；較佳地為25℃～35℃；更佳地為30℃。
進(jìn)一步地，上述步驟(a)中，優(yōu)選的發(fā)酵時(shí)間為3～12h；較佳地為6～12小時(shí)；更佳地為6小時(shí)。
進(jìn)一步地，上述步驟(a)中，優(yōu)選的發(fā)酵方式為振蕩培養(yǎng)，振蕩速度為100～300rpm；較佳地為150～250rpm；更佳地為200rpm。
結(jié)合實(shí)施例和比較例1亦可知，在優(yōu)選發(fā)酵參數(shù)的范圍之外時(shí)，牛類芽孢桿菌CGMCC No.8333發(fā)酵脫脂乳，再經(jīng)過(guò)滅菌、離心、超濾和冷凍干燥后得到的α-葡萄糖苷酶抑制劑的抑制效果明顯下降。而在優(yōu)選范圍之內(nèi)，接種量、脫脂乳濃度、發(fā)酵溫度和時(shí)間相互影響，使得牛類芽孢桿菌CGMCC No.8333發(fā)酵產(chǎn)生的α-葡萄糖苷酶抑制劑的活性更佳。例如，在接種量過(guò)少時(shí)，菌種繁殖速度慢，使得最終獲得的α-葡萄糖苷酶抑制劑的活性低于優(yōu)選的接種量范圍；當(dāng)接種量過(guò)多時(shí)，一定時(shí)間后菌種個(gè)體因生存空間及營(yíng)養(yǎng)的限制而死亡或停滯生長(zhǎng)，不利于代謝物的積累，也使得最終獲得的α-葡萄糖苷酶抑制劑的活性低于優(yōu)選的接種量范圍。又例如，當(dāng)發(fā)酵溫度低于優(yōu)選范圍值時(shí)，菌種代謝緩慢，會(huì)導(dǎo)致α-葡萄糖苷酶抑制劑的活性有所降低。還例如，發(fā)酵的振蕩速度低于優(yōu)選范圍時(shí)，菌種發(fā)酵的溶氧量不夠，生產(chǎn)和代謝受到限制，導(dǎo)致α-葡萄糖苷酶抑制劑的活性降低。
進(jìn)一步地，上述步驟(b)中，超濾的截留分子量為1,000～10,000Da；較佳地為1,000～5,000Da，更佳地為1,000Da。
結(jié)合實(shí)施例及對(duì)比例1亦可知，在優(yōu)選的截留分子量之外時(shí)，α-葡萄糖苷酶抑制劑的抑制效果明顯下降。
進(jìn)一步地，上述步驟(b)中，滅菌的溫度較佳地為95℃～125℃，更佳地為98～110℃，最優(yōu)地為100℃；滅菌的時(shí)間為5～20分鐘，更佳地為10～18分鐘，最優(yōu)地為15分鐘。
進(jìn)一步地，上述步驟(b)中，離心的速度較佳地為8,000～12,000g，更佳地為10000～11000g；離心的時(shí)間較佳地為5～10分鐘，更佳地為6～8分鐘。
進(jìn)一步地，上述步驟(b)中，上述的冷凍干燥為真空冷凍干燥，真空冷凍干燥條件較佳地為：板層極限溫度≤-60℃，冷阱極限溫度-70℃，板層裝料厚度0.5～2.0mm，真空度10～30Pa。
在另一個(gè)具體的實(shí)施方式中，提供了一種α-葡萄糖苷酶抑制劑，由上述的任一種制備方法制得。
上述制備方法具備上述有益效果，因此，由上述制備方法所制得的α-葡萄糖苷酶抑制劑也具備相應(yīng)的有益效果，此處不再贅述。
進(jìn)一步的，上述α-葡萄糖苷酶抑制劑對(duì)α-葡萄糖苷酶的半抑制率濃度IC50≤55mg/mL。結(jié)合實(shí)施例亦可知，上述α-葡萄糖苷酶抑制劑的抑制活性顯著高于其他常規(guī)脫脂乳發(fā)酵菌株。
下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明上述具體實(shí)施方式，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說(shuō)明書(shū)選擇。實(shí)施例中所使用的試劑若未加說(shuō)明，均為分析純?cè)噭?，?gòu)買自國(guó)藥集團(tuán)。其他試驗(yàn)儀器、試劑、菌種，如未做特別說(shuō)明，均可通過(guò)商業(yè)途徑直接購(gòu)得。
實(shí)施例1
1、材料與方法
(a)種子(發(fā)酵菌種)的制備：將牛類芽孢桿菌CGMCC No.8333(該菌株的來(lái)源請(qǐng)參見(jiàn)公開(kāi)號(hào)為CN 103740618A的中國(guó)專利)的凍干粉用少量無(wú)菌蒸餾水溶解，用接種環(huán)取一環(huán)劃線于TYC固體培養(yǎng)基(購(gòu)買自O(shè)XOID Co.，英國(guó))，30℃好氧培養(yǎng)48h取出，用接種環(huán)挑取單菌落放入10mL TYC液體培養(yǎng)基(購(gòu)買自O(shè)XOID Co.，英國(guó))，運(yùn)用渦旋振蕩器將菌落均勻分散于液體培養(yǎng)基內(nèi)，30℃、180rpm振蕩培養(yǎng)24h取出，以2％(v/v)接種量接種于TYC液體培養(yǎng)基(購(gòu)買自O(shè)XOID Co.，英國(guó))，30℃、180rpm振蕩培養(yǎng)24h后，培養(yǎng)物15,000rpm離心10分鐘，棄去上清，菌體用無(wú)菌蒸餾水洗滌2次后，用原培養(yǎng)體積的無(wú)菌蒸餾水懸浮，得到發(fā)酵用的種子，種子液的菌濃度為2.5x108cfu/mL。
(b)脫脂乳的制備：將質(zhì)量百分比為10％的脫脂乳粉與蒸餾水混勻，充分溶解后，在125℃下滅菌5min，冷卻至室溫，即得所需濃度的脫脂乳。
(c)待測(cè)樣品制備：將α-葡萄糖苷酶抑制劑溶解于無(wú)菌水中，pH調(diào)節(jié)至6.80，，再4℃、10,000rpm離心10min，取上清，pH調(diào)節(jié)至6.80，再次4℃、10,000rpm離心10min，取得的上清即可用于α-葡萄糖苷酶抑制活性的檢測(cè)。
α-葡萄糖苷酶抑制活性的檢測(cè)：取100μL待測(cè)樣品于1.5mL EP(Eppendorf)管，接著加入50μLα-葡萄糖苷酶(100mU/mL，sigma，美國(guó))，混勻，37℃溫育15min，然后加入80μL 2mM的PNPG(sigma，美國(guó))，混勻，37℃反應(yīng)15min，最后加入80μL 0.2M的Na2CO3終止反應(yīng)，再4℃、10,000rpm離心2min，取200μL上清于96孔微孔板(Greinerbio-one，德國(guó))，在405nm波長(zhǎng)下用Spectra Max M5多功能酶標(biāo)儀(MolecularDevices,美國(guó))測(cè)定吸光度值。待測(cè)樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性如以下公式所示：
其中：陰性對(duì)照組為空白脫脂乳替代待測(cè)樣品；
陰性空白組為0.1M、pH＝6.8的磷酸鹽緩沖液(PBS)替代陰性對(duì)照組中的α-葡萄糖苷酶；
樣品空白組為PBS替代待測(cè)樣品組中的α-葡萄糖苷酶。
α-葡萄糖苷酶半抑制率濃度IC50的測(cè)定：以倍半稀釋的方法將待測(cè)樣品溶液進(jìn)行稀釋，獲得不同濃度的待測(cè)樣品組，利用上述檢測(cè)方法測(cè)定不同濃度的待測(cè)樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率，根據(jù)濃度與α-葡萄糖苷酶抑制率構(gòu)成的線性關(guān)系計(jì)算得出樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的半抑制率濃度(IC50)。
2、α-葡萄糖苷酶抑制劑的制備
將牛類芽孢桿菌CGMCC No.8333種子以接種量2％(v/v)無(wú)菌接種于10％(w/w)脫脂乳，30℃、200rpm培養(yǎng)6小時(shí)得發(fā)酵乳。
將發(fā)酵乳95℃滅菌20min，8,000g離心10min取上清，超濾(Mwco＝1,000Da)(超濾設(shè)備Pellicon 0.1M2及超濾膜都購(gòu)買自密理博公司，下同)取低分子量部分，冷凍干燥即得α-葡萄糖苷酶抑制劑產(chǎn)品A。
3、α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定
將α-葡萄糖苷酶抑制劑產(chǎn)品A以上述方法制備為待測(cè)樣品后測(cè)定其對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性，結(jié)果表明該產(chǎn)品A對(duì)α-葡萄糖苷酶的半抑制率濃度IC50＝42mg/mL。
實(shí)施例2
1、材料與方法
(a)種子(發(fā)酵菌種)的制備：同實(shí)施例1。
(b)脫脂乳的制備：將質(zhì)量百分比為12％的脫脂乳粉與蒸餾水混勻，充分溶解后，在95℃下滅菌20min，冷卻至室溫，即得所需濃度的脫脂乳。
(c)待測(cè)樣品制備：同實(shí)施例1。
2、α-葡萄糖苷酶抑制劑的制備
將牛類芽孢桿菌CGMCC No.8333種子以接種量0.5％(v/v)無(wú)菌接種于12％(w/w)脫脂乳，35℃、100rpm培養(yǎng)12小時(shí)得發(fā)酵乳。
將發(fā)酵乳125℃滅菌5min，10,000g離心8min取上清，超濾(Mwco＝5,000Da)取低分子量部分，冷凍干燥即得α-葡萄糖苷酶抑制劑產(chǎn)品B。
3、α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定
將α-葡萄糖苷酶抑制劑產(chǎn)品B以上述方法制備為待測(cè)樣品后測(cè)定其對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性，結(jié)果表明該產(chǎn)品B對(duì)α-葡萄糖苷酶的半抑制率濃度IC50＝49mg/mL。
實(shí)施例3
1、材料與方法
(a)種子(發(fā)酵菌種)的制備：同實(shí)施例1。
(b)脫脂乳的制備：將質(zhì)量百分比為6％的脫脂乳粉與蒸餾水混勻，充分溶解后，在100℃下滅菌15min，冷卻至室溫，即得所需濃度的脫脂乳。
(c)待測(cè)樣品制備：同實(shí)施例1。
2、α-葡萄糖苷酶抑制劑的制備
將牛類芽孢桿菌CGMCC No.8333種子以接種量4％(v/v)無(wú)菌接種于6％(w/w)脫脂乳，20℃、300rpm培養(yǎng)3小時(shí)得發(fā)酵乳。
將發(fā)酵乳120℃滅菌10min，12,000g離心5min取上清，超濾(Mwco＝10,000Da)取低分子量部分，冷凍干燥即得α-葡萄糖苷酶抑制劑產(chǎn)品C。
3、α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定
將α-葡萄糖苷酶抑制劑產(chǎn)品C以上述方法制備為待測(cè)樣品后測(cè)定其對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性，結(jié)果表明該產(chǎn)品C對(duì)α-葡萄糖苷酶的半抑制率濃度IC50＝55mg/mL。
實(shí)施例4
1、材料與方法
(a)種子(發(fā)酵菌種)的制備：同實(shí)施例1。
(b)脫脂乳的制備：將質(zhì)量百分比為8％的脫脂乳粉與蒸餾水混勻，充分溶解后，在120℃下滅菌10min，冷卻至室溫，即得所需濃度的脫脂乳。
(c)待測(cè)樣品制備：同實(shí)施例1。
2、α-葡萄糖苷酶抑制劑的制備
將牛類芽孢桿菌CGMCC No.8333種子以接種量3％(v/v)無(wú)菌接種于8％(w/w)脫脂乳，25℃、250rpm培養(yǎng)5小時(shí)得發(fā)酵乳。
將發(fā)酵乳100℃滅菌15min，10,000g離心6min取上清，超濾(Mwco＝1,000Da)取低分子量部分，冷凍干燥即得α-葡萄糖苷酶抑制劑產(chǎn)品D。
3、α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定
將α-葡萄糖苷酶抑制劑產(chǎn)品D以上述方法制備為待測(cè)樣品后測(cè)定其對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性，結(jié)果表明該產(chǎn)品D對(duì)α-葡萄糖苷酶的半抑制率濃度IC50＝46mg/mL。
實(shí)施例5
1、材料與方法
(a)種子(發(fā)酵菌種)的制備：同實(shí)施例1。
(b)脫脂乳的制備：將質(zhì)量百分比為9％的脫脂乳粉與蒸餾水混勻，充分溶解后，在115℃下滅菌12min，冷卻至室溫，即得所需濃度的脫脂乳。
(c)待測(cè)樣品制備：同實(shí)施例1。
2、α-葡萄糖苷酶抑制劑的制備
將牛類芽孢桿菌CGMCC No.8333種子以接種量1％(v/v)無(wú)菌接種于9％(w/w)脫脂乳，28℃、150rpm培養(yǎng)9小時(shí)得發(fā)酵乳。
將發(fā)酵乳115℃滅菌12min，11,000g離心8min取上清，超濾(Mwco＝5,000Da)取低分子量部分，冷凍干燥即得α-葡萄糖苷酶抑制劑產(chǎn)品E。
3、α-葡萄糖苷酶抑制活性的測(cè)定
將α-葡萄糖苷酶抑制劑產(chǎn)品E以上述方法制備為待測(cè)樣品后測(cè)定其對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性，結(jié)果表明該產(chǎn)品E對(duì)α-葡萄糖苷酶的半抑制率濃度IC50＝50mg/mL。
效果實(shí)施例1冷藏條件下α-葡萄糖苷酶抑制劑抑制效果的穩(wěn)定性
將實(shí)施例1-5制備的產(chǎn)品A、B、C、D和E分別裝入密封袋后，置于冷藏條件(8℃)保存0、10、20和30天后取出，分別測(cè)定各樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的半抑制率濃度IC50值，結(jié)果如表1所示。
表1冷藏條件下α-葡萄糖苷酶抑制劑產(chǎn)品抑制效果的穩(wěn)定性
由表1可知，所有測(cè)試的α-葡萄糖苷酶抑制劑產(chǎn)品在冷藏(8℃)保存30天后，對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性穩(wěn)定保持在同一水平，穩(wěn)定性較好。
對(duì)比例1
將實(shí)施例1中的接種量，脫脂乳濃度，培養(yǎng)溫度，發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵振蕩的速度以及超濾截留分子量逐一進(jìn)行調(diào)整，獲得了以下一組不同方法制備的α-葡萄糖苷酶抑制劑產(chǎn)品，各組所得α-葡萄糖苷酶抑制劑對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果如表2所示。
表2不同方法制備所得α-葡萄糖苷酶抑制劑的抑制效果
從表2所示的結(jié)果中可以得出，將所述α-葡萄糖苷酶抑制劑產(chǎn)品的制備方法中接種量，脫脂乳濃度，培養(yǎng)溫度，發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵振蕩的速度以及超濾截留分子量調(diào)整到優(yōu)選范圍之外的時(shí)候，牛類芽孢桿菌CGMCC No.8333依然可以發(fā)酵脫脂乳產(chǎn)生α-葡萄糖苷酶抑制劑，但是產(chǎn)物的α-葡萄糖苷酶抑制效果明顯下降。
對(duì)比例2
參考實(shí)施例1所述方法，比較由牛類芽孢桿菌CGMCC No.8333、干酪乳桿菌(L.casei)ATCC 393(購(gòu)買自ATCC)、保加利亞乳桿菌(L.bulgaricus)LB340(由丹尼斯科公司提供)、嗜熱鏈球菌(S.thermophilus)ST-BODY-3(由科.漢森公司提供)制備的α-葡萄糖苷酶抑制劑對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果，具體操作如下：
1、材料與方法
(a)種子(發(fā)酵菌種)的制備：
干酪乳桿菌和保加利亞乳桿菌種子的制備：將干酪乳桿菌ATCC 393和保加利亞乳桿菌LB340的凍干粉分別用少量無(wú)菌蒸餾水溶解，各自用接種環(huán)取一環(huán)劃線于MRS固體培養(yǎng)基(購(gòu)買自Merck Co.德國(guó))上，37℃厭氧培養(yǎng)24h取出，用接種環(huán)挑取單菌落放入1mL MRS液體(購(gòu)買自Merck Co.德國(guó))，運(yùn)用渦旋震蕩器將菌落均勻分散于液體培養(yǎng)基內(nèi)，37℃厭氧培養(yǎng)24h取出，以2％(v/v)接種量接種于50mL MRS液體，37℃培養(yǎng)24h后，培養(yǎng)物9,000rpm離心10分鐘，棄去上清，菌體用無(wú)菌蒸餾水洗滌2次后，用原培養(yǎng)體積的無(wú)菌蒸餾水懸浮，得到相應(yīng)的發(fā)酵用的種子。
嗜熱鏈球菌種子的制備：將嗜熱鏈球菌ST-BODY-3的凍干粉用少量無(wú)菌蒸餾水溶解，用接種環(huán)取一環(huán)劃線于M17固體培養(yǎng)基(購(gòu)買自Merck Co.德國(guó))上，40℃厭氧培養(yǎng)24h取出，用接種環(huán)挑取單菌落放入1mL M17液體(購(gòu)買自Merck Co.德國(guó))，運(yùn)用渦旋震蕩器將菌落均勻分散于液體培養(yǎng)基內(nèi)，40℃厭氧培養(yǎng)24h取出，以2％(v/v)接種量接種于50mLM17液體，40℃培養(yǎng)24h后，培養(yǎng)物9,000rpm離心10分鐘，棄去上清，菌體用無(wú)菌蒸餾水洗滌2次后，用原培養(yǎng)體積的無(wú)菌蒸餾水懸浮，得到發(fā)酵用的種子。
(b)脫脂乳的制備：同實(shí)施例1。
(c)待測(cè)樣品制備：同實(shí)施例1。
2、α-葡萄糖苷酶抑制劑產(chǎn)品的制備
將各菌株以2％(v/v)接種量無(wú)菌接種于10％(w/w)脫脂乳，分別培養(yǎng)(保加利亞乳桿菌和干酪乳桿菌37℃厭氧培養(yǎng)，嗜熱鏈球菌40℃厭氧培養(yǎng)，牛類芽孢桿菌30℃、200rpm振蕩培養(yǎng))6h，獲得相應(yīng)的發(fā)酵乳。
將上述發(fā)酵乳按照實(shí)施例1中所述方法進(jìn)行滅菌，離心，超濾，冷凍干燥，制備得到α-葡萄糖苷酶抑制劑。
3、α-葡萄糖苷酶抑制劑活性的測(cè)定
上述不同菌株制備的α-葡萄糖苷酶抑制劑的抑制效果如表3所示：
表3不同菌株制備的α-葡萄糖苷酶抑制劑的抑制效果
由表3可知，其他常規(guī)發(fā)酵菌株不具有發(fā)酵脫脂乳產(chǎn)生α-葡萄糖苷酶抑制劑的能力，而牛類芽孢桿菌CGMCC No.8333可以發(fā)酵脫脂乳，最后得到α-葡萄糖苷酶抑制劑，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性非常顯著。
以上對(duì)本發(fā)明所提供的α-葡萄糖苷酶抑制劑及其制備方法進(jìn)行了詳細(xì)介紹。本文中應(yīng)用了具體個(gè)例對(duì)本發(fā)明的原理及實(shí)施方式進(jìn)行了闡述，以上實(shí)施例的說(shuō)明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。