本發(fā)明涉及水產(chǎn)食品加工技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種具有降血糖和抗氧化功能的魚鰾蛋白肽及其制備方法。
背景技術(shù)：
降血糖功能因子是指能降低糖尿病患者血糖濃度以及改善其癥狀的生物活性成分。目前研究較多的天然產(chǎn)物類降糖因子、礦物質(zhì)類降糖因子、維生素類降糖因子，其作用機(jī)理各不相同。天然產(chǎn)物類降糖因子按化學(xué)結(jié)構(gòu)可分為黃酮類、活性多糖類、生物堿類、皂甙類、萜類、共軛亞油酸、多肽類等。自人工合成胰島素以來，磺脲類藥物、雙胍類、胰島素增敏劑、糖抑制劑等各種口服或注射的藥物相繼問世，然而化學(xué)藥物常產(chǎn)生一定的毒副作用，天然降血糖成分具有作用溫和而持久，性質(zhì)穩(wěn)定，幾乎無毒性反應(yīng)，還可多種降糖成分并存，綜合起作用等優(yōu)點(diǎn)，備受患者以及和醫(yī)學(xué)界的青睞，也成為了降血糖功能因子的主要研究方向。
目前國內(nèi)外專利中未見利用魚鰾資源制備二肽基肽酶IV(dipeptidyl peptidase IV：DPP-IV)抑制肽的專利文獻(xiàn)報(bào)道。本發(fā)明針對(duì)目前魚類加工產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，魚鰾蛋白資源數(shù)量的快速增加，根據(jù)魚鰾蛋白的特性，以魚鰾為原料，通過對(duì)魚鰾高溫高壓和超聲波等預(yù)處理，利用多種蛋白酶分步酶解技術(shù)，通過膜分離、凝膠分離及高效液相色譜分離技術(shù)，開發(fā)了同時(shí)具有特定降血糖和抗氧化功能的魚鰾蛋白肽，建立一套高效的多功能魚鰾蛋白肽的制備方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是在于提供一種具有降血糖和抗氧化功能的魚鰾蛋白肽。
本發(fā)明的另一目的在于提供上述魚鰾蛋白肽的制備方法。
本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供上述魚鰾蛋白肽的應(yīng)用。
為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明提供了一種具有降血糖和抗氧化功能的魚鰾蛋白肽的制備方法，包括以下步驟:
(1)超聲處理去脂的魚鰾漿液；
(2)加入復(fù)合蛋白酶進(jìn)行二步法酶解；
(3)對(duì)酶解液高溫下保溫后冷卻至室溫，離心并取上清液通過二步超濾法處理；
(4)濾液過柱層析分離，收集洗脫峰，即得。
上述制備方法中，步驟(1)的魚鰾清洗后先經(jīng)高溫處理，再制備魚鰾漿液。所述高溫處理為本領(lǐng)域公知的處理方式，例如可以采用110-121℃下20-40min。
步驟(1)超聲處理方法為將去脂的魚鰾漿液溫度調(diào)至65-75℃，30-40kH的超聲頻率處理15-25min。
本發(fā)明的實(shí)施例中，具體操作為選用冷凍魚鰾，在2-8℃條件下進(jìn)行解凍清洗，取魚鰾，用符合飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的清潔水清洗,魚鰾清洗后在110-121℃的條件下保溫20-40分鐘，然后在魚鰾中加入2.0～4.0倍的水，用打漿機(jī)將魚鰾打成漿，通過6000～8000g離心10～15min，去上層脂肪，得到去脂的魚鰾漿液。
本發(fā)明提供的具有降血糖和抗氧化功能的魚鰾蛋白肽的制備方法中，步驟(2)二步法酶解中，第一步酶解加入的復(fù)合蛋白酶為堿性蛋白酶和動(dòng)物蛋白酶，二者質(zhì)量比為1-2:1，且加入的復(fù)合蛋白酶質(zhì)量為魚鰾質(zhì)量的0.2％-0.3％；
第一步酶解條件為50-55℃，pH值7.0-8.0，酶解0.5-1.5h。
其中，步驟(2)二步法酶解中，第二步酶解加入的復(fù)合蛋白酶為中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶，二者質(zhì)量比為1-2:1，且加入的復(fù)合蛋白酶質(zhì)量為魚鰾質(zhì)量的0.1％-0.3％；
第二步酶解條件為50-60℃，pH值7.0-8.0，酶解1.0-2.0h。
上述制備方法中，步驟(3)的高溫下保溫是指于90-95℃下保溫3-5min；
步驟(3)的離心是指3000-4000g條件下離心10-15min。
步驟(3)的兩步超濾法為先用孔徑為6000D的膜超濾上清液，得到分子量小于6000D的濾液，再對(duì)該濾液用孔徑為3000D的膜超濾，得到分子量小于3000D的蛋白肽。
步驟(4)的具體操作是：取分子量為小于3000的蛋白肽液，再經(jīng)過Sephadex G-15凝膠分離，洗脫液為去離子水，洗脫峰在280nm下進(jìn)行檢測(cè)，收集第1個(gè)洗脫峰,再用RP-HPLC反相高效液相色譜進(jìn)行1次分離，反相HPLC的分離條件是以5～90％乙腈溶液作為洗脫液，取8-11分收集的肽溶液。
本發(fā)明提供的制備方法中，還包括步驟(5)將步驟(4)得到的DPP-Ⅳ抑制肽溶液通過濃縮、冷凍干燥，得到魚鰾抗DPP-Ⅳ抑制肽粉。通過LC-MS/MS對(duì)制得的魚鰾蛋白肽的主要成分進(jìn)行測(cè)定，其氨基酸序列為Trp-Gly-Asp-Glu-His-Ile-Pro-Gly-Ser-Pro-Tyr-His、Ile-Ala-Gln-Pro-Gln-Glu-Lys-Ala-Pro-Asp-Pro-Phe-Arg-His和Val-Ala-Pro-Glu-Glu-His-Pro-Thr-Leu的肽的含量為40％～60％。
上述制備方法制備得到的魚鰾蛋白肽屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明上述方法制備得到的魚鰾蛋白肽具有優(yōu)異的降血糖和抗氧化功能。
進(jìn)而，本發(fā)明提供了該魚鰾蛋白肽在制備降血糖或抗氧化藥物中的應(yīng)用。含有本發(fā)明方法制得的魚鰾蛋白肽的食品、保健品或藥物也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：
(1)本發(fā)明方法所用原料易得，成本低，可控性強(qiáng)，適于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。
(2)本發(fā)明首先對(duì)魚鰾先進(jìn)行高溫(110-121℃)處理，結(jié)合特定頻率超聲波技術(shù)處理的魚鰾蛋白漿，可以明顯改善魚鰾蛋白的結(jié)構(gòu)，提高魚鰾蛋白的酶敏感性和產(chǎn)品的得率。
(3)本發(fā)明制得的魚鰾蛋白肽具有較好的DPP-Ⅳ抑制的功能，其IC50值小于0.6mg/mL，同時(shí)具有較好的抗氧化功能，在1mg/mL的條件下，其清除DPPH自由基能力達(dá)到88％以上，還原力達(dá)到0.88以上。
(4)本發(fā)明制備的魚鰾蛋白肽安全無污染，采用多種食品級(jí)復(fù)合蛋白酶(堿性蛋白酶、動(dòng)物蛋白酶、中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶)，經(jīng)在溫和條件下，經(jīng)過適度酶解獲得特定分子量的魚鰾蛋白肽，不加任何添加劑，為100％魚鰾蛋白肽。
(5)本發(fā)明開發(fā)魚鰾蛋白肽中具有特定功能的三種肽(Trp-Gly-Asp-Glu-His-Ile-Pro-Gly-Ser-Pro-Tyr-His、Ile-Ala-Gln-Pro-Gln-Glu-Lys-Ala-Pro-Asp-Pro-Phe-Arg-His和Val-Ala-Pro-Glu-Glu-His-Pro-Thr-Leu)的比例為40％以上。本發(fā)明開發(fā)魚鰾蛋白肽中分子量小于2000的肽的比例為95％以上易于機(jī)體消化和吸收。
(6)本發(fā)明方法制得的魚鰾蛋白肽，能廣泛應(yīng)用于特需食品和營養(yǎng)食品的制造。
具體實(shí)施方式
除非另有定義，下文中所使用的所有專業(yè)術(shù)語與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的含義相同。本文中所使用的專業(yè)術(shù)語只是為了描述具體實(shí)施例的目的，并不是旨在限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
除有特別說明，本發(fā)明中用到的各種試劑、原料均為可以從市場(chǎng)上購買的商品或者可以通過公知的方法制得的產(chǎn)品。
實(shí)施例1具有降血糖和抗氧化功能的魚鰾蛋白肽的制備方法
(1)選用冷凍魚鰾100克，在4℃條件下進(jìn)行解凍，用符合飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的清潔水清洗,魚鰾清洗后在121℃的條件下保溫20分鐘，然后在魚鰾中加入2.0倍的水，用打漿機(jī)將魚鰾打成漿，通過6000g離心10～15min，去上層脂肪，得到去脂的魚鰾漿液。
(2)將去脂魚鰾漿液的溫度調(diào)整到65℃，于超聲波發(fā)生器中經(jīng)超聲波(頻率為40kH)處理15分鐘。
(3)按照魚鰾重量0.4％的重量百分比比例向經(jīng)過超聲波處理的魚鰾漿液體中加入復(fù)合蛋白酶進(jìn)行分步酶解，第一步利用0.2％的復(fù)合蛋白酶(堿性蛋白酶和動(dòng)物蛋白酶組成，它們之間的質(zhì)量比為2：1)，在50℃，pH為7.5(用1mol/L的NaOH或HCl來調(diào)節(jié))的條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)1.5h；然后利用0.2％復(fù)合蛋白酶(中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶組成，它們之間的質(zhì)量比為2：1)，在55℃、pH為7.0(用1mol/L的NaOH或HCl來調(diào)節(jié))條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)2.0h；在95℃下保溫5分鐘，冷卻至室溫，在4000g條件下離心10min鐘，收集上清液；
(4)將步驟(3)所得的上清液利用孔徑為6000道爾頓的陶瓷膜將分子量小于6000的蛋白和多肽分離出來，再用孔徑為3000道爾頓的膜將分子量把小于3000道爾頓的蛋白肽分離出來。
(5)取分子量為小于3000的蛋白肽液，經(jīng)過Sephadex G-15凝膠分離，洗脫液為去離子水，洗脫峰在280nm下進(jìn)行檢測(cè)，收集第1個(gè)洗脫峰,用RP-HPLC反相高效液相色譜進(jìn)行分離，反相HPLC的分離條件是以5～90％乙腈溶液作為洗脫液，取8-11分收集的肽溶液；
(6)將步驟(5)得到的DPP-Ⅳ抑制肽溶液通過濃縮、冷凍干燥，得到魚鰾抗DPP-Ⅳ抑制肽粉。通過LC-MS/MS對(duì)魚鰾蛋白肽的主要成分進(jìn)行測(cè)定，本實(shí)施例制得的魚鰾蛋白肽中氨基酸序列為Trp-Gly-Asp-Glu-His-Ile-Pro-Gly-Ser-Pro-Tyr-His、Ile-Ala-Gln-Pro-Gln-Glu-Lys-Ala-Pro-Asp-Pro-Phe-Arg-His和Val-Ala-Pro-Glu-Glu-His-Pro-Thr-Leu的肽的含量為42％。
實(shí)施例2具有降血糖和抗氧化功能的魚鰾蛋白肽的制備方法
(1)選用冷凍魚鰾10克，在6℃條件下進(jìn)行解凍，用符合飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的清潔水清洗，魚鰾清洗后在110℃的條件下保溫40分鐘，然后在魚鰾中加入3.0倍的水，用打漿機(jī)將魚鰾打成漿，通過6000g離心15min，去上層脂肪，得到去脂的魚鰾漿液。
(2)將去脂魚鰾漿液的溫度調(diào)整到70℃，于超聲波發(fā)生器中經(jīng)超聲波(頻率為40kH)處理25分鐘。
(3)按照魚鰾重量0.5％的重量百分比比例向經(jīng)過超聲波處理的魚鰾漿液體中加入復(fù)合蛋白酶進(jìn)行分步酶解，第一步利用0.2％的復(fù)合蛋白酶(堿性蛋白酶和動(dòng)物蛋白酶組成，它們之間的質(zhì)量比為2：1)，在55℃，pH為7.5(用1mol/L的NaOH或HCl來調(diào)節(jié))的條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)1.0h；然后利用0.3％復(fù)合蛋白酶(中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶組成，它們之間的質(zhì)量比為2：1)，在55℃、pH為7.5(用1mol/L的NaOH或HCl來調(diào)節(jié))條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)2.0h；在95℃下保溫5分鐘，冷卻至室溫，在3500g條件下離15min，收集上清液；
(4)將步驟(3)所得的上清液利用孔徑為6000道爾頓的陶瓷膜超濾，先將分子量小于6000的蛋白和多肽分離出來，再用孔徑為3000道爾頓的膜將分子量小于3000道爾頓的蛋白肽分離出來。
(5)取分子量為小于3000的蛋白肽液，再經(jīng)過Sephadex G-15凝膠分離，洗脫液為去離子水，洗脫峰在280nm下進(jìn)行檢測(cè)，收集第1個(gè)洗脫峰,再用RP-HPLC反相高效液相色譜進(jìn)行1次分離，反相HPLC的分離條件是以5～90％乙腈溶液作為洗脫液，取8-11分收集的肽溶液；
(6)將步驟(5)得到的DPP-Ⅳ抑制肽溶液通過濃縮、冷凍干燥，得到魚鰾抗DPP-Ⅳ抑制肽粉。通過LC-MS/MS對(duì)魚鰾蛋白肽的主要成分進(jìn)行測(cè)定，本實(shí)施例制得的魚鰾蛋白肽中其氨基酸序列為Trp-Gly-Asp-Glu-His-Ile-Pro-Gly-Ser-Pro-Tyr-His、Ile-Ala-Gln-Pro-Gln-Glu-Lys-Ala-Pro-Asp-Pro-Phe-Arg-His和Val-Ala-Pro-Glu-Glu-His-Pro-Thr-Leu的肽的含量為43％。
實(shí)施例3具有降血糖和抗氧化功能的魚鰾蛋白肽的制備方法
(1)選用冷凍魚鰾1000克，在8℃條件下進(jìn)行解凍清洗，取魚鰾，用符合飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的清潔水清洗,魚鰾清洗后在121℃的條件下保溫25分鐘，然后在魚鰾中加入3.0倍的水，用打漿機(jī)將魚鰾打成漿，通過6000g離心15min，去上層脂肪，得到去脂的魚鰾漿液。
(2)將去脂魚鰾漿液的溫度調(diào)整到70℃，于超聲波發(fā)生器中經(jīng)超聲波(頻率為40kH)處理15分鐘。
(3)按照魚鰾重量0.4％的重量百分比比例向經(jīng)過超聲波處理的魚鰾漿液體中加入復(fù)合蛋白酶進(jìn)行分步酶解，第一步利用0.2％的復(fù)合蛋白酶(堿性蛋白酶和動(dòng)物蛋白酶組成，它們之間的質(zhì)量比為1：1)，在55℃，pH為8(用1mol/L的NaOH或HCl來調(diào)節(jié))的條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)1.5h；然后利用0.2％復(fù)合蛋白酶(中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶組成，它們之間的質(zhì)量比為1：1)，在60℃、pH為7.0(用1mol/L的NaOH或HCl來調(diào)節(jié))條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)2.0h；在95℃下保溫5分鐘，冷卻至室溫，在4000g條件下離心12min，收集上清液；
(4)將步驟(3)所得的上清液通過二步超濾方法進(jìn)行處理，利用孔徑為6000道爾頓的陶瓷膜超濾，先將分子量小于6000的蛋白和多肽分離出來，再用孔徑為3000道爾頓的膜將分子量小于3000道爾頓的蛋白肽分離出來。
(5)取分子量為小于3000的蛋白肽液，再經(jīng)過Sephadex G-15凝膠分離，洗脫液為去離子水，收集第1個(gè)洗脫峰,再用RP-HPLC反相高效液相色譜進(jìn)行1次分離，反相HPLC的分離條件是以5～90％乙腈溶液作為洗脫液，取8-11分收集的肽溶液；
(6)將步驟(5)得到的DPP-Ⅳ抑制肽溶液通過濃縮、冷凍干燥，得到魚鰾抗DPP-Ⅳ抑制肽粉。通過LC-MS/MS對(duì)魚鰾蛋白肽的主要成分進(jìn)行測(cè)定，本實(shí)施例制得的魚鰾蛋白肽中氨基酸序列為Trp-Gly-Asp-Glu-His-Ile-Pro-Gly-Ser-Pro-Tyr-His、Ile-Ala-Gln-Pro-Gln-Glu-Lys-Ala-Pro-Asp-Pro-Phe-Arg-His和Val-Ala-Pro-Glu-Glu-His-Pro-Thr-Leu的肽的含量為43％。
實(shí)施例4魚鰾蛋白肽DPP-Ⅳ抑制能力的測(cè)定試驗(yàn)
試驗(yàn)樣品：實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3制備的魚鰾蛋白肽及合成的肽DPP-Ⅳ抑制能力按照如下方法進(jìn)行：
將樣品用100mmol/L的Tris-HCL(pH8.0)緩沖液稀釋至合適的濃度，吸取25μL樣品稀釋液與25μL底物(濃度為1.6mmol/L)混合，加入到96孔酶標(biāo)板中。在37℃下孵育10min后，加入50μL DPP-IV酶液(酶活力為8U/L)，混勻后在37℃下精確孵育60min，立即加入100μL 1mol/L的醋酸-醋酸鈉(pH 4.0)緩沖液終止反應(yīng)，于405nm下測(cè)吸光值A(chǔ)，并根據(jù)下列公式計(jì)算樣品的DPP-IV抑制率。
DPP-IV抑制率％＝{1-(A樣品-A樣品空白對(duì)照)/(A陰性對(duì)照-A陰性空白對(duì)照)}×100
A樣品：為樣品反應(yīng)液在405nm處的吸光值A(chǔ)；
A樣品空白對(duì)照：以Tris-HCL緩沖液代替DPP-IV酶液作為樣品空白對(duì)照的吸光值A(chǔ)；
A陰性對(duì)照：以Tris-HCL緩沖液代替樣品作為陰性對(duì)照的吸光值；
A陰性空白對(duì)照：以Tris-HCL緩沖液代替DPP-IV酶液和樣品作為陰性空白對(duì)照的吸光值
DPP-IV抑制的IC50值測(cè)定：
測(cè)定樣品在不同濃度下的DPP-IV抑制率，以多肽濃度的對(duì)數(shù)值與抑制率做回歸曲線，得到回歸方程，由回歸方程計(jì)算IC50，即50％的DPP-IV酶活性抑制是肽的濃度。結(jié)果見表1。
實(shí)施例5本發(fā)明魚鰾蛋白抗氧化活性的測(cè)定試驗(yàn)
試驗(yàn)樣品：實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例3制備的魚鰾蛋白肽。
按照如下方法進(jìn)行：
(1)清除DPPH自由基能力：取1mg/mL的魚鰾蛋白肽1.5mL，加入99.5％乙醇1.5mL和0.02％DPPH乙醇溶液0.675mL混合，振蕩混勻，室溫下避光水浴30min，然后在517nm下檢測(cè)體系吸光值。吸光值越低，體系的清除DPPH自由基能力越強(qiáng)?？瞻讓?duì)照即是將樣品溶液1.5mL換成去離子水1.5mL。
DPPH自由基清除能力％＝((空白吸光值-樣品吸光值)/空白吸光值)×100
(2)還原力測(cè)定：取1mg/mL的魚鰾蛋白肽1mL，加入0.2M磷酸緩沖液(pH 6.6)2.5mL和1％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的鐵氰化鉀溶液2.5mL，混勻，然后在50℃水浴加熱20min。取出迅速冷卻，加入10％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))三氯乙酸(TCA)溶液2.5mL，混合均勻，然后在3000g下離心10min。取上清液2.5mL，加入去離子水2.5mL和1％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))三氯化鐵溶液0.5mL，充分混勻，在室溫下反應(yīng)10min，用700nm波長測(cè)定吸光度。還原力即可用700nm波長處吸光值表示。
結(jié)果(見表1)本發(fā)明魚鰾蛋白肽具有很好的DPP-IV抑制能力，DPP-IV抑制活性(IC50值)低于0.60mg/mL，顯著低于同類復(fù)合蛋白肽的IC50值，具有很好的DPP-IV抑制能力。同時(shí)本發(fā)明的魚鰾蛋白肽具有較好的抗氧化能力，在1mg/mL的條件下，其清除DPPH自由基能力達(dá)到88％以上，還原力達(dá)到0.88以上，也是一種較好的抗氧化肽。
表1本發(fā)明魚鰾蛋白肽的DPP-IV抑制和抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果
注：合成肽1的氨基酸序列Trp-Gly-Asp-Glu-His-Ile-Pro-Gly-Ser-Pro-Tyr-His
合成肽2的氨基酸序列Ile-Ala-Gln-Pro-Gln-Glu-Lys-Ala-Pro-Asp-Pro-Phe-Arg-His
合成肽3的氨基酸序列Val-Ala-Pro-Glu-Glu-His-Pro-Thr-Leu
以上的實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通工程技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做出的各種變型和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
序列表
<110> 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120> 一種具有降血糖和抗氧化功能的魚鰾蛋白肽及其制備方法
<130> KHP161116973.3
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 魚
<400> 1
Trp Gly Asp Glu His Ile Pro Gly Ser Pro Tyr His
1 5 10
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> 魚
<400> 2
Ile Ala Gln Pro Gln Glu Lys Ala Pro Asp Pro Phe Arg His
1 5 10
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 魚
<400> 3
Val Ala Pro Glu Glu His Pro Thr Leu
1 5