本發(fā)明屬于精原干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種無生長因子添加的精原干細(xì)胞培養(yǎng)體系及其應(yīng)用，特別涉及一種高效表達(dá)重組生長因子GDNF的STO滋養(yǎng)層細(xì)胞和成分明確的精原干細(xì)胞培養(yǎng)基。

背景技術(shù)：

精原干細(xì)胞是位于雄性哺乳動(dòng)物睪丸曲細(xì)精管基底膜上的生殖干細(xì)胞。它在整個(gè)睪丸的生殖細(xì)胞中只占0.02％～0.03％，但卻是唯一的生殖干細(xì)胞，可以進(jìn)行自我更新和分化，維持整個(gè)雄性動(dòng)物生命過程中的精子發(fā)生。精原干細(xì)胞的分離培養(yǎng)對于研究精原干細(xì)胞的增殖和體外分化及精子發(fā)生的機(jī)制都起著非常重要的作用。早在2003年已經(jīng)有一些實(shí)驗(yàn)室可以在體外培養(yǎng)精原干細(xì)胞較長時(shí)間，其中比較有代表性的是Brinster RL和Shinohara T實(shí)驗(yàn)室。Brinster實(shí)驗(yàn)室采用小鼠囊胚上皮細(xì)胞(STO)為滋養(yǎng)層細(xì)胞而Shinohara實(shí)驗(yàn)室采用小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)作為滋養(yǎng)層細(xì)胞。這兩種培養(yǎng)方法都需要添加復(fù)雜的生長因子，包括：神經(jīng)膠質(zhì)源性生長因子(GDNF)，堿性成纖維生長因子(bFGF)，神經(jīng)膠質(zhì)源性生長因子受體-α1(GFRα-1)，重組白血病抑制因子(LIF)，胰島素樣生長因子-1(IGF-1)，重組干細(xì)胞因子(SCF)等。這些重組生長因子價(jià)格昂貴，且需要持續(xù)添加，培養(yǎng)成本十分昂貴(盡管只有GDNF是目前公認(rèn)的必須生長因子)，精原干細(xì)胞的增殖緩慢，平均倍增期在一周左右，使得培養(yǎng)操作也變得十分繁瑣復(fù)雜。此外以往有文獻(xiàn)報(bào)道需要血清支持精原干細(xì)胞的培養(yǎng)工作，血清的成分極其復(fù)雜，所包含的各成分對細(xì)胞生長的作用也不明確，且培養(yǎng)的細(xì)胞易分化，不支持體外長期培養(yǎng)。為解決上述問題，我們發(fā)明了一個(gè)簡單高效的體系，將GDNF基因轉(zhuǎn)入STO細(xì)胞使其高效表達(dá)GDNF蛋白，用這種高效表達(dá)GDNF蛋白的STO細(xì)胞作為滋養(yǎng)層，同時(shí)采用一種無血清的精原干細(xì)胞培養(yǎng)液，不需要額外添加任何生長因子即可體外建系培養(yǎng)精原干細(xì)胞。此體系培養(yǎng)的精原干細(xì)胞與傳統(tǒng)方法比較，增殖速率無顯著差異，同時(shí)具備完整的再生潛能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

解決的技術(shù)問題：本發(fā)明提供一種無生長因子添加的精原干細(xì)胞培養(yǎng)體系及應(yīng)用，無需添加任何重組生長因子同時(shí)克服含血清培養(yǎng)體系中成分不明的困難，可完全支持精原干細(xì)胞的體外培養(yǎng)。通過本發(fā)明公開的培養(yǎng)體系及高效表達(dá)重組生長因子GDNF的STO滋養(yǎng)層可以避免血清中復(fù)雜成分對于精原干細(xì)胞增殖的影響，不需要外源性重組生長因子的添加，在促進(jìn)精原干細(xì)胞快速增殖的同時(shí)維持其干性，極大減少培養(yǎng)成本，簡化了培養(yǎng)過程。

技術(shù)方案：一種無重組生長因子添加的精原干細(xì)胞培養(yǎng)體系，包括含十二種明確化學(xué)成分組成的培養(yǎng)基和過表達(dá)生長因子GDNF的滋養(yǎng)層，所述培養(yǎng)基每500mL含有牛血清白蛋白(BSA)0.6wt.％，轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)100μg/mL，不飽和脂肪酸(FFA)15.2μeq/L，亞硒酸鈉(Na₂SeO₃)6×10^-8M，2-巰基乙醇(2-ME)100μM，胰島素(InsuLin)25μg/mL，4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES BUFFER)10mM，腐胺(Putrescine)120μM，青霉素(Penicillin)50units/mL(Gibco15140122(貨號))，鏈霉素(Streptomycin)50μg/mL(Gibco15140122(貨號))，L-谷氨酰胺(L-glutamine)2mM，其余為基礎(chǔ)培養(yǎng)基MEMα，0.22μm濾器過濾；每毫升所述不飽和脂肪酸(FFA 100meq/L)包括：亞麻酸(Linolenic acid)5.6mM，十八烯酸(Oleic acid)13.4mM，棕?cái)R油酸(Palmitoleic acid)2.8mM，亞油酸(Linoleic acid)35.6mM，十六烷酸(Palmitic acid)31mM，十八酸(Stearic acid)11.6mM，無水乙醇為溶劑。所述的過表達(dá)生長因子GDNF的滋養(yǎng)層細(xì)胞每2×10⁵細(xì)胞24小時(shí)GDNF分泌量為4.13ng/mL。

所述過表達(dá)生長因子GDNF的滋養(yǎng)層的制備方法為：1)用小鼠睪丸的cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增出723bp的GDNF基因編碼區(qū)片段，，引物如下：

GDNF-CDS-F：GCTCTAGAGCCACCATGAAGTTATGGGATGTC；

GDNF-CDS-R：CGGGATCCGATACATCCACACCGTTTAG；

2)通過瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證正確的GDNF編碼區(qū)序列并切膠回收PCR產(chǎn)物；3)pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro載體(System Biosciences公司購買)經(jīng)過限制性內(nèi)切酶XbaI和BamHI酶切消化后，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證回收；4)酶切后pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro載體和回收的PCR產(chǎn)物連接，構(gòu)建出pCDH-EF1-GDNF-T2A-Puro表達(dá)載體；5)在10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)293T細(xì)胞(人腎上皮細(xì)胞)，用于包裝病毒，病毒體系：ddH₂O:420μL，CaCl₂(2M):60μL，pSPAX2:2.5μg，pMD2.G：1μg，所制備的表達(dá)載體Plasmid:3.3μg，2×HBS:500μL，邊渦旋邊均勻滴加，空氣吹打3次，再混勻吹打3次，均勻滴加至培養(yǎng)皿內(nèi)，12h后換STO培養(yǎng)液，48h后收集培養(yǎng)皿中培養(yǎng)液，離心1500g，3min，將病毒上清用0.45μm濾器過濾分裝，-80℃保存；6)0.1％明膠孵育12孔板30min，吸去明膠，加入1mL STO培養(yǎng)液/孔，1mL病毒上清重懸0.8×10⁵個(gè)STO細(xì)胞/孔，接種于12孔板；7)48h后收集轉(zhuǎn)入病毒的STO細(xì)胞兩孔，提取RNA及蛋白，驗(yàn)證在STO細(xì)胞中過表達(dá)GDNF成功；8)對驗(yàn)證過表達(dá)成功的STO細(xì)胞傳代至10cm培養(yǎng)皿培養(yǎng)，并在細(xì)胞長滿后用絲裂霉素C(MITC 10μg/mL)在37℃孵育3小時(shí)，每隔半小時(shí)搖晃混勻一次，10mL HBSS蕩洗3次，去除殘留的絲裂霉素C，質(zhì)量濃度0.25％的胰酶(Trypsin-EDTA)1mL 37℃消化5min，3mL STO培養(yǎng)液終止消化，收集細(xì)胞，600g 5min 4℃離心，按1×10⁶個(gè)/細(xì)胞mL凍存，凍存液為90％體積STO培養(yǎng)液和10％體積二甲基亞砜(DMSO)，-80℃凍存過夜后轉(zhuǎn)移至液氮，得到高效表達(dá)GDNF的STO細(xì)胞系，作為精原干細(xì)胞的滋養(yǎng)層細(xì)胞；上述STO培養(yǎng)液500mL含有:基礎(chǔ)高糖培養(yǎng)基(DMEM):455mL，血清(FBS):35mL，青霉素-鏈霉素(P&S):5mL，L-谷氨酰胺(L-glutamine:)5mL，2-巰基乙醇(2-ME):3.6μL，0.22μm濾器過濾。

所述無生長因子添加的精原干細(xì)胞培養(yǎng)體系在精原干細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。

所述精原干細(xì)胞為哺乳動(dòng)物精原干細(xì)胞。

所述哺乳動(dòng)物包括：小鼠，大鼠，家兔和恒河猴。

應(yīng)用步驟包括：1)提前兩天鋪板，預(yù)熱STO培養(yǎng)液，取全新24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入質(zhì)量濃度為0.1％的明膠(gelatin)鋪滿板底，37℃孵育30min，取出凍存的絲裂霉素C處理過的高效表達(dá)GDNF的STO細(xì)胞，37℃水浴鍋復(fù)蘇，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15mL離心管，加入4mL STO培養(yǎng)液，600g 4℃5min離心，棄上清，STO培養(yǎng)液5mL重懸細(xì)胞沉淀，對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)按0.9-1×10⁵/500μL每孔接種于孔底；2)將磁珠分選得到的精原干細(xì)胞重懸于精原干細(xì)胞無血清培養(yǎng)液(1.5-2×10⁵/mL)；3)取出提前鋪好的STO細(xì)胞，吸盡STO培養(yǎng)液，37℃預(yù)熱的HBSS輕柔清洗三遍，每次1mL/孔，洗去殘余培養(yǎng)液；4)吸盡HBSS后，將重懸在SSC培養(yǎng)液中的精原干細(xì)胞接種于板底(1.5-2×10⁵/孔)；5)細(xì)胞換液及傳代：每2天細(xì)胞換液一次，每4-6天細(xì)胞傳代一次轉(zhuǎn)移至新的滋養(yǎng)層細(xì)胞上。

所述的高效表達(dá)GDNF的STO滋養(yǎng)層是STO細(xì)胞(由American type culture collection美國模式菌種收集中心購得，貨號：SCRC-1050)經(jīng)過構(gòu)建的PCDH載體轉(zhuǎn)染后高效持續(xù)表達(dá)GDNF，再經(jīng)過絲裂霉素處理作為精原干細(xì)胞培養(yǎng)的滋養(yǎng)層細(xì)胞。

有益效果：利用本發(fā)明方法，可以長期體外培養(yǎng)精原干細(xì)胞，通過移植實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其干細(xì)胞特性與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法所培養(yǎng)的精原干細(xì)胞無差異。與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比，無需添加任何昂貴的重組生長因子及胎牛血清，培養(yǎng)基成分十分清晰，重復(fù)性好。應(yīng)用本發(fā)明方法所培養(yǎng)的精原干細(xì)胞具備完整的再生潛能和無限增殖的能力。本發(fā)明方法培養(yǎng)簡便，經(jīng)濟(jì)且高效。

附圖說明

圖1為過表達(dá)GDNF的病毒注射小鼠睪丸后形成精原干細(xì)胞過度增殖團(tuán)塊示意圖(箭頭所示)，說明包裝質(zhì)粒感染組織后能夠正常產(chǎn)生有功能的GDNF重組因子，體內(nèi)誘導(dǎo)精原干細(xì)胞過度增殖。

圖2為蛋白定量檢測驗(yàn)證與正常未感染GDNF過表達(dá)質(zhì)粒的STO相比在STO-GDNF細(xì)胞系中GDNF蛋白顯著表達(dá)示意圖，(β-tubulin為骨架蛋白做為蛋白定量對照)。

圖3為Elisa試劑盒(貨號：ab171178，Abcam)檢測2×10⁵GDNF-STO細(xì)胞24小時(shí)分泌GDNF量為2.57-5.69ng/mL，說明所述高效表達(dá)GDNF的STO可以體外分泌GDNF維持精原干細(xì)胞的生長。

圖4為計(jì)數(shù)Brinster RL的傳統(tǒng)培養(yǎng)方法、傳統(tǒng)方法結(jié)合過表達(dá)GDNF的STO滋養(yǎng)層細(xì)胞及本發(fā)明方法三者比較示意圖，說明本體系培養(yǎng)的精原干細(xì)胞增殖率無顯著差異。

圖5為在實(shí)施例1體系上培養(yǎng)的精原干細(xì)胞克隆(A圖箭頭所示)和該體系培養(yǎng)的精原干細(xì)胞移植回睪丸后形成克隆(B圖箭頭所示)說明該體系培養(yǎng)的精原干細(xì)胞具有完整的再生潛能。

具體實(shí)施方式

下面的實(shí)施例可使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。

實(shí)施例1

1、精原干細(xì)胞(SSC)培養(yǎng)液500mL配方：基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MEMα)，牛血清白蛋白(BSA)0.6％，轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)100μg/mL，不飽和脂肪酸(FFA)15.2μeq/L，亞硒酸鈉(Na₂SeO₃)6×10^-8M，2-巰基乙醇(2-ME)100μM，胰島素(InsuLin)25μg/mL，4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES BUFFER)10mM，腐胺(Putrescine)120μM，青霉素(Penicillin)50units/mL(Gibco15140122(貨號))，鏈霉素(Streptomycin)50μg/mL(Gibco15140122(貨號))，L-谷氨酰胺(L-glutamine)2mM，0.22μm濾器過濾；每毫升所述不飽和脂肪酸(FFA 100meq/L)包括：亞麻酸(Linolenic acid)5.6mM，十八烯酸(Oleic acid)13.4mM，棕?cái)R油酸(Palmitoleic acid)2.8mM，亞油酸(Linoleic acid)35.6mM，十六烷酸(Palmitic acid)31mM，十八酸(Stearic acid)11.6mM，無水乙醇為溶劑。

2、STO細(xì)胞系培養(yǎng)所用培養(yǎng)液500mL配方:基礎(chǔ)高塘培養(yǎng)基(DMEM):455mL，血清(FBS):35mL，青霉素-鏈霉素(P&S):5mL，L-谷氨酰胺(L-glutamine:)5mL，2-巰基乙醇(2-ME):3.6μL，0.22μm濾器過濾。HBS每500mL含有：NaCl-8g，KCl-0.38g，Na₂HPO₄-0.1g，Hepes-5g，Glucose-1g，pH 7.05。

3、所用培養(yǎng)液試劑購買來源：基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MEMα，DMEM)Gibco，牛血清白蛋白(BSA)Sigma，轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)Sigma，不飽和脂肪酸(FFA)Sigma，亞硒酸鈉(Na₂SeO₃)Sigma，2-巰基乙醇(2-ME)Sigma，胰島素(InsuLin)Sigma，4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES BUFFER)Sigma，腐胺(Putrescine)Sigma，青霉素-鏈霉素(P&S)Gibco，L-谷氨酰胺(L-glutamine)Gibco，血清(FBS)Hyclone。

4、高效表達(dá)重組生長因子GDNF的滋養(yǎng)層細(xì)胞系的構(gòu)建，包括以下幾個(gè)步驟：

1)用小鼠睪丸的cDNA為模板，通過PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增出723bp的GDNF基因編碼區(qū)片段，所用引物如下：

GDNF-CDS-F：GCTCTAGAGCCACCATGAAGTTATGGGATGTC；

GDNF-CDS-R：CGGGATCCGATACATCCACACCGTTTAG。

2)通過瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證正確的GDNF編碼區(qū)序列并切膠回收PCR產(chǎn)物；

3)pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro(System Biosciences公司購買)經(jīng)過限制性內(nèi)切酶XbaI和BamHI酶切消化后，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證回收；

4)酶切后pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro載體和回收的PCR產(chǎn)物連接，連接體系：回收酶切載體：6.8μL，回收PCR產(chǎn)物：1.2μL，T4DNA Ligase(T4DNA連接酶)：1μL，10×T4DNA Ligase Buffer:1μL，4℃過夜，構(gòu)建表達(dá)載體；

5)對構(gòu)建好的pCDH-EF1-GDNF-T2A-Puro表達(dá)載體進(jìn)行XbaI和BamHI雙酶切驗(yàn)證，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證正確后送測序，測序結(jié)果顯示擴(kuò)增出的GDNF基因與NCBI基因庫中GDNF基因序列匹配率100％。

6)在10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)293T細(xì)胞，用于包裝病毒，病毒體系：ddH₂O:420μL，CaCl₂(2M):60μL，pSPAX2:2.5μg，pMD2.G：1μg，所制備的表達(dá)載體Plasmid:3.3μg，2×HBS:500μL(邊渦旋邊均勻滴加)，空氣吹打3次，再混勻吹打3次，均勻滴加至培養(yǎng)皿內(nèi)，12h后換STO培養(yǎng)液，48h后收集培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，離心1500g，3min，將病毒上清用0.45μm濾器過濾分裝，-80℃保存。

7)0.1％明膠(gelatin)孵育12孔板30min，吸去明膠，加入1mL STO培養(yǎng)液/孔，1mL病毒重懸0.8×10⁵個(gè)STO細(xì)胞/孔，接種于12孔板。

8)48h后收集轉(zhuǎn)入病毒的STO細(xì)胞兩孔用于提取RNA及蛋白驗(yàn)證在STO細(xì)胞中過表達(dá)GDNF成功。

9)對驗(yàn)證成功的STO細(xì)胞傳代至10cm培養(yǎng)皿培養(yǎng)，并在細(xì)胞長滿后用絲裂霉素C(10μg/mL)在37℃孵育3小時(shí)，每個(gè)半小時(shí)搖晃混勻，共10mL HBSS蕩洗3次，去除殘留的絲裂霉C，0.25％Trypsin-EDTA 1mL 37℃消化5min，3mL STO培養(yǎng)液終止消化，收集細(xì)胞，600g 5min 4℃離心，按1×10⁶個(gè)細(xì)胞/mL凍存，凍存液為90％體積STO培養(yǎng)液和10％體積二甲基亞砜(DMSO)，-80℃凍存過夜后轉(zhuǎn)移至液氮，得到高效表達(dá)GDNF的滋養(yǎng)層細(xì)胞。

5、精原干細(xì)胞無血清培養(yǎng)液及過表達(dá)GDNF的STO細(xì)胞在精原干細(xì)胞培養(yǎng)中應(yīng)用步驟包括：

1)提前兩天鋪板，預(yù)熱STO培養(yǎng)液，取全新24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入0.1％明膠，鋪滿板底，37℃孵育30min，，取出凍存的絲裂霉素C處理過的高效表達(dá)GDNF的STO細(xì)胞，37℃水浴鍋復(fù)蘇，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15mL離心管，加入4mL STO培養(yǎng)液，600g 4℃離心5min，棄上清，STO培養(yǎng)液5mL重懸細(xì)胞沉淀，對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，吸去明膠后按0.9-1×10⁵個(gè)細(xì)胞/500μL每孔接種于孔底；

2)將磁珠分選得到的精原干細(xì)胞重懸于精原干細(xì)胞無血清培養(yǎng)液(1.5-2×10⁵個(gè)細(xì)胞/mL)；

3)取出提前鋪好的滋養(yǎng)層細(xì)胞，吸盡STO培養(yǎng)液，37℃預(yù)熱的HBSS輕柔清洗三遍，每次1mL/孔，洗去殘余培養(yǎng)液；

4)吸盡HBSS后，將重懸在SSC培養(yǎng)液中的精原干細(xì)胞接種于板底(1.5-2×10⁵個(gè)細(xì)胞/孔)；

5)細(xì)胞換液及傳代：每2天細(xì)胞換液一次，每4-6天細(xì)胞傳代一次轉(zhuǎn)移至新的滋養(yǎng)層細(xì)胞上。

6、通過對在高表達(dá)GDNF的STO滋養(yǎng)層上建系培養(yǎng)的精原干細(xì)胞移植，發(fā)現(xiàn)所培養(yǎng)的精原干細(xì)胞具有干細(xì)胞再生潛能和無限增殖的特性，證明本發(fā)明所公開的方法真實(shí)可靠，簡單經(jīng)濟(jì)。

實(shí)施例2

該實(shí)施例與實(shí)施例1相比僅使用普通STO細(xì)胞作為滋養(yǎng)層細(xì)胞。

1、精原干細(xì)胞(SSC)無血清培養(yǎng)液500mL配方：基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MEMα)，牛血清白蛋白(BSA)0.6％，轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)100μg/mL，不飽和脂肪酸(FFA)15.2μeq/L，亞硒酸鈉(Na₂SeO₃)6×10^-8M，2-巰基乙醇(2-ME)100μM，胰島素(InsuLin)25μg/mL，4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES BUFFER)10mM，腐胺(Putrescine)120μM，青霉素(Penicillin)50units/mL(Gibco15140122(貨號))，鏈霉素(Streptomycin)50μg/mL(Gibco15140122(貨號))，L-谷氨酰胺(L-glutamine)2mM，0.22μm濾器過濾；每毫升所述不飽和脂肪酸(FFA 100meq/L)包括：亞麻酸(Linolenic acid)5.6mM，十八烯酸(Oleic acid)13.4mM，棕?cái)R油酸(Palmitoleic acid)2.8mM，亞油酸(Linoleic acid)35.6mM，十六烷酸(Palmitic acid)31mM，十八酸(Stearic acid)11.6mM，無水乙醇為溶劑。

2、STO細(xì)胞系培養(yǎng)所用培養(yǎng)液500mL配方:基礎(chǔ)高塘培養(yǎng)基(DMEM):455mL，血清(FBS):35mL，青霉素-鏈霉素(P&S):5mL，L-谷氨酰胺(L-glutamine:)5mL，2-巰基乙醇(2-ME):3.6μL，0.22μm濾器過濾。

3、所用培養(yǎng)液試劑購買來源：基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MEMα，DMEM)Gibco，牛血清白蛋白(BSA)Sigma，轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)Sigma，不飽和脂肪酸(FFA)Sigma，亞硒酸鈉(Na₂SeO₃)Sigma，2-巰基乙醇(2-ME)Sigma，胰島素(InsuLin)Sigma，4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES BUFFER)Sigma，腐胺(Putrescine)Sigma，青霉素-鏈霉素(P&S)Gibco，L-谷氨酰胺(L-glutamine)Gibco，血清(FBS)Hyclone

4、在10cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)正常STO細(xì)胞并在細(xì)胞長滿后用絲裂霉素C(10μg/mL)在37℃孵育3小時(shí)，每個(gè)半小時(shí)搖晃混勻，10mL HBSS蕩洗3次，去除殘留的絲裂霉C，0.25％Trypsin-EDTA1mL 37℃消化5min，3mLSTO培養(yǎng)液終止消化，收集細(xì)胞，600g 5min 4℃離心，按1×10⁶個(gè)/細(xì)胞mL凍存，凍存液為90％體積STO培養(yǎng)液和10％體積二甲基亞砜(DMSO)，-80℃凍存過夜后轉(zhuǎn)移至液氮，得到正常滋養(yǎng)層細(xì)胞。

5、提前兩天鋪板，預(yù)熱STO培養(yǎng)液，取全新24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入0.1％明膠，鋪滿板底，37℃孵育30min，，取出凍存的絲裂霉素MITC處理過的正常STO細(xì)胞37℃水浴鍋復(fù)蘇，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15mL離心管，加入4mLSTO培養(yǎng)液，600g 4℃5min離心，棄上清，STO培養(yǎng)液5mL重懸細(xì)胞沉淀，對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，吸去明膠后按0.9-1×10⁵/500μL每孔接種于孔底

6、將磁珠分選得到的精原干細(xì)胞重懸于精原干細(xì)胞無血清培養(yǎng)液(1.5-2×10⁵/mL)；取出提前鋪好的滋養(yǎng)層細(xì)胞，吸盡STO培養(yǎng)液，37℃預(yù)熱的HBSS輕柔清洗三遍，每次1mL/孔，洗去殘余培養(yǎng)液；吸盡HBSS后，將重懸在SSC培養(yǎng)液中的精原干細(xì)胞接種于板底(1.5-2×10⁵/孔)，2天后換液觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形成克隆較小，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，細(xì)胞逐漸死亡減少，不能傳代培養(yǎng)。說明該體系不能支持精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)。

實(shí)施例3

該實(shí)施例與實(shí)施例1相比僅在精原干細(xì)胞培養(yǎng)液中加入體積1％的血清(FBS)。

1、精原干細(xì)胞(SSC)含血清培養(yǎng)液500mL配方：基礎(chǔ)培養(yǎng)基MEMα，牛血清白蛋白0.6％，轉(zhuǎn)鐵蛋白100μg/mL，不飽和脂肪酸15.2μeq/L，亞硒酸鈉6×10^-8M，2-巰基乙醇100μM，胰島素25μg/mL，4-羥乙基哌嗪乙磺酸10mM，腐胺120μM，青霉素50units/mL，鏈霉素50μg/mL，L-谷氨酰胺2mM，，F(xiàn)BS(胎牛血清):5mL，0.22μm濾器過濾；每毫升所述不飽和脂肪酸包括：亞麻酸5.6mM，十八烯酸13.4mM，棕?cái)R油酸2.8mM，亞油酸35.6mM，十六烷酸31mM，十八酸11.6mM，無水乙醇為溶劑。

2、STO細(xì)胞系培養(yǎng)所用培養(yǎng)液500mL配方:基礎(chǔ)高塘培養(yǎng)基(DMEM):455mL，血清(FBS):35mL，青霉素-鏈霉素(P&S):5mL，L-谷氨酰胺(L-glutamine:)5mL，2-巰基乙醇(2-ME):3.6μL，0.22μm濾器過濾。

3、所用培養(yǎng)液試劑購買來源：基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MEMα，DMEM)Gibco，牛血清白蛋白(BSA)Sigma，轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)Sigma，不飽和脂肪酸(FFA)Sigma，亞硒酸鈉(Na₂SeO₃)Sigma，2-巰基乙醇(2-ME)Sigma，胰島素(InsuLin)Sigma，4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES BUFFER)Sigma，腐胺(Putrescine)Sigma，青霉素-鏈霉素(P&S)Gibco，L-谷氨酰胺(L-glutamine)Gibco，血清(FBS)Hyclone。

4、在10cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)驗(yàn)證成功過表達(dá)GDNF的STO細(xì)胞并在細(xì)胞長滿后用絲裂霉素C(10μg/mL)在37℃孵育3小時(shí)，每個(gè)半小時(shí)搖晃混勻，10mL HBSS蕩洗3次，去除殘留的絲裂霉C，0.25％Trypsin-EDTA1mL 37℃消化5min，3mLSTO培養(yǎng)液終止消化，收集細(xì)胞，600g 5min 4℃離心，按1×10⁶個(gè)/細(xì)胞mL凍存，凍存液為90％體積STO培養(yǎng)液和10％體積二甲基亞砜(DMSO)，-80℃凍存過夜后轉(zhuǎn)移至液氮，得到高效表達(dá)GDNF的滋養(yǎng)層細(xì)胞。

5、提前兩天鋪板，預(yù)熱STO培養(yǎng)液，取全新24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入0.1％明膠，鋪滿板底，37℃孵育30min，，取出凍存的絲裂霉素MITC處理過的高效表達(dá)GDNF的STO細(xì)胞37℃水浴鍋復(fù)蘇，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15mL離心管，加入4mLSTO培養(yǎng)液，600g 4℃5min離心，棄上清，STO培養(yǎng)液5mL重懸細(xì)胞沉淀，對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，吸去明膠后按0.9-1×10⁵/500μL每孔接種于孔底。

6、將磁珠分選得到的精原干細(xì)胞重懸于精原干細(xì)胞含血清培養(yǎng)液(1.5-2×10⁵/mL)；取出提前鋪好的滋養(yǎng)層細(xì)胞，吸盡STO培養(yǎng)液，37℃預(yù)熱的HBSS輕柔清洗三遍，每次1mL/孔，洗去殘余培養(yǎng)液；吸盡HBSS后，將重懸在SSC含血清培養(yǎng)液中的精原干細(xì)胞接種于板底(1.5-2×10⁵/孔)。

7、細(xì)胞換液及傳代：每2天細(xì)胞換液一次，每4-6天細(xì)胞傳代一次轉(zhuǎn)移至新的滋養(yǎng)層細(xì)胞上。

8、通過在含血清培養(yǎng)基上培養(yǎng)的精原干細(xì)胞細(xì)胞移植，發(fā)現(xiàn)其所培養(yǎng)的精原干細(xì)胞形成的克隆與本發(fā)明公開的培養(yǎng)體系相比，克隆數(shù)目顯著減少，說明其不支持精原干細(xì)胞體外增殖。

以上所述為本發(fā)明較佳實(shí)施例，應(yīng)當(dāng)理解的是，對于本行業(yè)研究人員可利用以上公開技術(shù)而加以改變或調(diào)整，而這些改變或調(diào)整都屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京醫(yī)科大學(xué)

<120> 一種無生長因子和血清添加的精原干細(xì)胞培養(yǎng)體系及應(yīng)用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gctctagagc caccatgaag ttatgggatg tc 32

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgggatccga tacatccaca ccgtttag 28