本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種從動物組織得到的蛋白及其用途。

背景技術(shù)：
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鉀通道是廣泛分布于骨骼肌、神經(jīng)、心臟、血管、腺體等細胞和組織上的一類跨膜蛋白，其在許多細胞興奮性和非興奮性細胞的信號傳遞過程中有重要作用，如，動作電位調(diào)節(jié)、心臟起搏、信號整合、激素釋放、細胞容積調(diào)節(jié)和細胞增殖等方面(Curr Opin Support Palliat Care,2015Jun；9(2):147-54)。此外，鉀通道在前列腺癌、結(jié)腸癌、肺癌和乳腺癌的細胞增殖和生長中的作用也被發(fā)現(xiàn)(Annu Rev Cell Dev Biol,2015；31:231-47)。目前已經(jīng)有大約80種不同的鉀通道亞型被報到，其中Kv1.1在CD⁴⁺輔助性T細胞、血管平滑肌細胞、中樞和外周神經(jīng)元細胞以及肺癌細胞和乳腺癌細胞上表達，其與細胞炎性因子分泌、疼痛信號傳導(dǎo)、血管重塑等過程密切相關(guān)。因此，Kv1.1是治療疼痛、癌癥、炎性疾病、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、自免疫疾病和慢性感染性疾病的靶點(Pharmacol Ther,2016,159:93-101；Trends Neurosci,2014,37(3):146-58)。例如，抑制Kv1.1能降低A549細胞的增殖使細胞處在細胞周期的靜息期；麻醉劑氨基苯甲酸丁酯、布比卡因、丁哌卡因、羅哌卡因和馬比佛卡因能抑制Kv1.1具有鎮(zhèn)痛作用(Anesthesiology,2008,109(5):895-904)。

有毒動物，如蝎、蛇、蜘蛛、蟾蜍、蜈蚣等的毒素是我國傳統(tǒng)醫(yī)藥中治療疑難雜癥重要源泉。動物多肽毒素已成為全球研發(fā)相關(guān)疾病藥物的重要資源。例如，中國科學(xué)院、軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院、湖南師范大學(xué)等單位的研究人員分別從眼鏡蛇、芋螺、蜘蛛的毒素中發(fā)現(xiàn)的cobra toxin、SO-3和HWAP-I作為鎮(zhèn)痛藥物被廣泛應(yīng)用于臨床(Expert Opin Biol Ther,2011,11(11):1469-84)；而美國FDA已批準來源于蜥蜴和芋螺毒素的Exenatide和Ziconotide分別用于臨床治療糖尿病和疼痛(Methods Find Exp Clin Pharmacol,2009，31(7):463-93)。另外，上海大學(xué)相關(guān)實驗室針對東亞鉗蝎多肽毒素的系統(tǒng)動物疼痛或鎮(zhèn)痛行為模型研究表明我國蝎毒中含有多種致痛/鎮(zhèn)痛或癲癇/抗癲癇的膜鈉或鉀通道活性成份(J Neurooncol,2005,73(1):53-56；J Clin Oncol,2006,24(22):3644-3650)。因此，動物毒素將是研發(fā)新藥的有效途徑。

我國對蝎、蛇、蜘蛛、蟾蜍、蜈蚣等的毒素的藥用研究有悠久的歷史，但對跳蚤等吸血節(jié)肢動物體內(nèi)藥理活性組分研究不多。吸血節(jié)肢動物通常需要在生命周期內(nèi)的一定時期吸血以完成生命循環(huán)。在長期的吸血進化過程中，吸血節(jié)肢動物在其唾液內(nèi)形成了眾多的藥理活性物質(zhì)以克服宿主的防御。如，牛虻的唾液腺中含有許多血小板聚集抑制因子、抗血漿凝集因子、血管舒張劑和免疫調(diào)節(jié)肽等。因此牛虻成為活血化瘀中藥材(Mol Cell Proteomics,2008,7(3):582-90)。印鼠客蚤(Xenopsylla cheopis)是我國常見的吸血昆蟲，分布于除新疆、西藏和寧夏外的廣大地區(qū)。它們只有從小家鼠、褐家鼠、黃胸鼠和人身上吸血后才能產(chǎn)卵完成生命周期。

發(fā)明人將本發(fā)明的印鼠客蚤多肽FS48在pubmed數(shù)據(jù)庫進行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何關(guān)于該蛋白功能的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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為了解決上述問題，本發(fā)明一個方面提供了一種印鼠客蚤多肽FS48，其序列如SEQ ID No.1所示。

本發(fā)明另一個方面提供了編碼如前1所述的多肽的核苷酸。

本發(fā)明再一個方面提供了一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1所述的多肽和/或權(quán)利要求2所述的核苷酸，以及可藥用的輔料。

其中，所述藥物組合物其制劑為注射劑。

本發(fā)明再一個方面提供了一種前述的印鼠客蚤多肽FS48的制備方法，該方法包括以下步驟：

(1)提取印鼠客蚤唾液腺總mRNA，并采用SEQ ID NO：2所示的上游引物和SEQ ID NO：3所示的下游引物擴增編碼SEQ ID NO：4所示的印鼠客蚤抗心律失常的基因，然后先將該基因克隆到pET-17b表達載體中，再轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)pLysS大腸桿菌中重組表達，并收集目的細胞超聲上清；

(2)將所收集的上清透析后依次上Hiprep SP陽離子交換色譜柱、Sephadex SR-100凝膠過濾柱、Hiprep SP陽離子交換色譜柱和SephadexTM G75 10/300GL凝膠過濾柱層析，得到如SEQ ID NO：1所示的印鼠客蚤唾液腺基因重組表達蛋白，即印鼠客蚤多肽FS48。

本發(fā)明一個方面提供了前述的多肽或者前述的藥物組合物在制備抗腫瘤的藥物中的用途。

本發(fā)明一個方面提供了前述的多肽或者前述的藥物組合物在制備鎮(zhèn)痛和/或抗炎的藥物中的用途。

本發(fā)明一個方面提供了前述的多肽或者前述的藥物組合物在制備治療神經(jīng)退行性疾病或心腦血管疾病或自免疫疾病或慢性感染疾病的藥物中的用途。

本發(fā)明一個方面提供了前述的多肽或者前述的藥物組合物在制備靶向Kv1.1的藥物中的用途。

多肽多肽多肽多肽本發(fā)明的印鼠客蚤唾液腺多肽FS48，對大鼠背根神經(jīng)節(jié)上的鉀離子通道有明顯的抑制作用，并且該毒素能夠選擇性的作用鉀離子通道亞型Kv1.1、Kv1.2和Kv4.1。印鼠客蚤唾液腺多肽FS48在小鼠的疼痛模型及炎癥模型上表明出很好的治療效果，能顯著影響小鼠脾細胞增殖和細胞因子分泌，且能抑制非小細胞肺癌細胞NCI-H460的遷移。因此印鼠客蚤唾液腺多肽FS48能夠在治療K1.1相關(guān)的疼痛、癌癥、炎性疾病、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、自免疫疾病和慢性感染性疾病的藥物中得到應(yīng)用。

附圖說明：

圖1為本發(fā)明印鼠客蚤多肽FS48大腸桿菌表達結(jié)果電泳圖。從左到有泳道分別是蛋白質(zhì)標準，37℃1.0mM IPTG誘導(dǎo)樣品，37℃0.4mM IPTG誘導(dǎo)樣品，30℃0.4mM IPTG誘導(dǎo)樣品，箭頭所示為目的帶。

圖2為本發(fā)明印鼠客蚤多肽FS48的分離純化圖，圖中，箭頭所示為目的峰，A、B、C和D分別是利用Hiprep SP陽離子交換、Sephadex SR-100凝膠過濾、Hiprep SP陽離子交換和SephadexTM G75 10/300GL凝膠過濾色譜柱層析后得到的圖，其中圖2D中電泳圖是Sephadex^TM G75 10/300GL凝膠過濾層析后得到的純蛋白電泳結(jié)果，圖中條帶為目的蛋白，其被切膠用于N末端測序。

圖3為本發(fā)明印鼠客蚤多肽FS48膜片鉗分析結(jié)果圖。A，樣品對DRG上鉀電流的影響；B，為樣品對表達Kv4.1哺乳動物細胞鉀電流的影響；C，為樣品對表達Kv2.1哺乳動物細胞鉀電流的影響；D，為樣品對表達Kv1.1哺乳動物細胞鉀電流的影響；E，為樣品對Kv1.1通道抑制的濃度依賴曲線；F，為樣品對Kv1.1通道穩(wěn)定活化的影響。

圖4為本發(fā)明印鼠客蚤多肽FS48的鎮(zhèn)痛效果。A為鼠尾熱痛實驗結(jié)果；B為福爾馬林致痛實驗結(jié)果；C為醋酸扭體實驗結(jié)果。

圖5為本發(fā)明印鼠客蚤多肽FS48的抗炎效果。A為FS48對小鼠腳爪腫脹體積的影響，B為FS48對小鼠腳爪髓過氧化物酶活性的影響。

圖6為本發(fā)明印鼠客蚤多肽FS48抗腫瘤劃痕實驗結(jié)果。A為FS48對腫瘤細胞遷移的影響，B為統(tǒng)計學(xué)分析。

圖7為本發(fā)明印鼠客蚤多肽FS48抗腫瘤侵襲實驗結(jié)果，A為FS48對腫瘤細胞侵襲的影響，B為統(tǒng)計學(xué)分析。

圖8為本發(fā)明印鼠客蚤多肽FS48對小鼠脾細胞增殖和細胞因子分泌的影響。A為對小鼠脾細胞增殖的影響，B為對小鼠脾細胞分泌IL-2的影響，C為對小鼠脾細胞分泌INF-γ的影響，D為對小鼠脾細胞分泌TNF-α的影響。

具體實施方式：

印鼠客蚤多肽FS48注射液的制備：

實施例1印鼠客蚤多肽FS48基因克隆

I、印鼠客蚤唾液腺總RNA提取：活體印鼠客蚤放在冰上30-60min冰凍麻醉，在顯微鏡下解剖50只印鼠客蚤得到唾液腺，加入1mL總RNA提取緩沖液(Trizol溶液，美國GIBCOBRL公司產(chǎn)品)，于5m1玻璃勻漿器中勻漿1分鐘。加入等體積酚/氯仿溶液，劇烈混勻，室溫放置1分鐘，4℃，12000rpm離心10分鐘，棄除沉淀。上清加入等體積的異丙醇，室溫放置4分鐘，4℃，12000rpm離心10分鐘，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即為印鼠客蚤唾液腺總RNA。

II、印鼠客蚤唾液腺mRNA的純化：印鼠客蚤唾液腺mRNA分離純化采用美國PROMEGA公司的mRNA Isolation Systems試劑盒。取印鼠客蚤唾液腺總RNA 500μg溶于500μl DEPC水中，放入65℃水浴10分鐘，加人3μl的Oligo(dT)探針和13μl 20×SSC溶液，混勻，放置室溫冷卻，稱為A液。磁珠(SA-PMP)的洗滌：將磁珠輕彈混勻，至磁力架吸附30秒，棄上清，加0.5×SSC 0.3m1，至磁力架吸附30秒，最后加0.1ml 0.5×SSC懸浮，稱之為B液。將A液加入B液中，室溫放置10分鐘，至磁力架吸附30秒，棄上清，用0.1×SSC洗滌4次，最后棄上清，加0.l ml DEPC水懸浮，至磁力架上吸附30秒，將上清移至新的試管，再加入0.15m1DEPC水重新懸浮，至磁力架吸附30秒，移上清至上述試管，則上清中為純化的印鼠客蚤唾液腺mRNA。加入1/10體積3M乙酸鈉，pH 5.2，等體積異丙醇，于-70℃放置30分鐘，4℃，12000rpm離心10分鐘，棄上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中。

III、印鼠客蚤唾液腺總cDNA擴增：采用CLONTECH公司Creator^TM SMART ^TM cDNA Library Construction Kit質(zhì)粒cDNA文庫構(gòu)建試劑盒擴增。A.cDNA第一鏈合成(mRNA反轉(zhuǎn)錄)：在0.5ml無菌的離心管加入1μl印鼠客蚤唾液腺mRNA、1μl SMART IV寡聚核苷酸、1μl CDS III/3’PCR引物，加2μl去離子水使總體積達到5μl。混勻離心管中的試劑并以12000rpm離心15秒，72℃保溫2分鐘。將離心管在冰上孵育2分鐘。在離心管中加入2.0μl 5×第一鏈緩沖、1.0μl 20mM二硫蘇糖醇、1.0μl 10mM dNTP混合物、1.0μl PowerScript反轉(zhuǎn)錄酶?；旌想x心管中試劑并以12000rpm離心15秒，在42℃保溫1小時。將離心管置于冰上中止第一鏈的合成。從離心管取2μl所合成的cDNA第一鏈備用。B.采用長末端聚合酶鏈式反應(yīng)(LD-PCR)方法擴增第二鏈：95℃預(yù)熱PCR儀。將2μl cDNA第一鏈(mRNA反轉(zhuǎn)錄)、80μl去離子水、10μl 10×Advantage 2PCR緩沖、2μl 50×dNTP混合物、2μl 5’PCR引物、2μl CDS III/3’PCR引物以及2μl大腸桿菌聚合酶離心管進行反應(yīng)。在PCR儀中按以下程序擴增：①95℃，20秒鐘；②22個循環(huán)：95℃，5秒鐘；68℃，6分鐘。循環(huán)結(jié)束后，將離心管中合成的cDNA雙鏈進行抽提。C.PCR產(chǎn)物用PROMEGA公司的SV Gel and PCR Clean-Up System試劑盒進行抽提回收，步驟如下：將通過PCR得到的cDNA雙鏈加入等體積的膜結(jié)合緩沖顛倒混勻，然后將混和液轉(zhuǎn)入離心純化柱，室溫靜置5分鐘，使DNA充分與硅膠膜結(jié)合。以12000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液。加入700μl的洗脫液(含乙醇)于離心純化柱中，以12000rpm離心30秒，倒掉收集管中的廢液。重復(fù)步驟2，12000rpm離心5分鐘。將離心純化柱置于新的離心管中，加入30μl超純水，在室溫下靜置5分鐘，以12000rpm離心30秒，管底溶液即為所純化過的印鼠客蚤唾液腺總cDNA。

Ⅳ、印鼠客蚤唾液腺多肽FS48基因的克隆：依據(jù)報道的印鼠客蚤唾液腺核苷酸序列(GenBank:EF179444.1)為參考設(shè)計引物，正向引物序列為5’GGCATATGATAAGTGCAACTGAGTATAAATGC3’(SEQ ID NO：2)，反向引物序列為5’CTCGAGACAATAGCATTTCTTTCC 3’(SEQ ID NO：3)。以100倍稀釋純化過的印鼠客蚤唾液腺總cDNA為模板擴增印鼠客蚤唾液腺多肽FS48的基因。PCR反應(yīng)程序為：①95℃，4分鐘；②35個循環(huán)：94℃，30秒鐘；56℃，30秒鐘；72℃，45秒鐘；③72℃，10分鐘。將擴增產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳，切取目的條帶，用DNA純化試劑盒進行純化。將純化的目的片段連接到pMD19-T載體中，即得連接產(chǎn)物。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進Takara公司的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。取適量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布至含Amp的LB平板上，經(jīng)37℃培養(yǎng)16小時形成的單菌落即為含目的基因的陽性克隆，提取質(zhì)粒酶切鑒定并送到英偉創(chuàng)津公司測序。測序結(jié)果顯示基因自5’端至3’端序列為(SEQ ID NO：4):

CATATGATAAGTGCAACTGAGTATAAATGCAAAGTAACAGGAACAGGTGATATGACAATACCATTTGGATGTAAAGATGGCAATGATGTTCAAGGATGTAAAAAACTTTGTCAGGAGAAATGTAAATACACGACAACACGACAATCTTGTGTTGGAAAGAAATGCTATTGTCTCGAG

Ⅴ、印鼠客蚤多肽FS48的基因克隆到pET-17b表達載體：在微量離心管中加入1μg含多肽FS48基因的pMD19-T載體、2μl H緩沖液，0.5μl Nde Ⅰ和0.5μl Xhol Ⅰ限制性內(nèi)切酶，加入水致使最終體積為20μl；1μg pET-17b質(zhì)粒采用同樣的酶切體系。酶切條件為：37℃反應(yīng)2小時；將酶切產(chǎn)物分別用1％瓊脂糖凝膠電泳，切取目的條帶，用DNA純化試劑盒進行純化。將純化的目的片段按照摩爾3:1(多肽基因：pET-17b載體)的比例混合加入到等量的連接酶緩沖液混合物中進行連接。連接調(diào)節(jié)為16℃反應(yīng)8小時；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進Takara公司的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。取適量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布至含Amp的LB平板上，經(jīng)37℃培養(yǎng)16小時形成的單菌落即為含目的片段的陽性克隆進行酶切和測序鑒定。

實施例2印鼠客蚤多肽FS48的大腸桿菌表達

將含印鼠客蚤多肽FS48的基因的表達載體質(zhì)粒化學(xué)轉(zhuǎn)化到BL₂₁(DE₃)pLysS大腸桿菌中重組表達，1L LB培養(yǎng)基中接入10ml過夜培養(yǎng)種子菌液，37℃培養(yǎng)3小時，當(dāng)細菌吸光值OD₆₀₀達到0.8左右時加入IPTG終濃度為1mM，繼續(xù)培養(yǎng)3小時，8000rpm 10分鐘離心收集菌體，用100ml pH 8.0的25mM Tris-HCl溶液懸浮沉淀，然后離心8000rpm離心10分鐘收集菌體，去掉上清，向沉淀中加入40ml pH 8.0的25mM Tris-HCl溶液，4℃超聲波破碎細胞，超30s停30s連續(xù)4次，然后12000rpm離心30分鐘收集上清，用3kDa透析袋透析，在10L pH 6.0的PBS溶液中透析24小時。SDS-PAGE檢測蛋白的表達，得到圖1，目的條帶應(yīng)該在6kDa附近。

實施例3印鼠客蚤多肽FS48大腸桿菌表達產(chǎn)物的分離純化

第一步，Hiprep SP陽離子交換色譜柱層析。按上述方法透析印鼠客蚤多肽FS48的大腸桿菌表達產(chǎn)物后14000rpm 4℃離心60min去除沉淀，上清液上樣于GE公司的Hiprep SP陽離子交換色譜柱。Hiprep SP陽離子交換色譜柱用20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄pH 6.0的緩沖液平衡，用含1M NaCl的同樣緩沖液從0％至100％的線性梯度洗脫得到圖2A，收集如圖所示活性峰。

第二步，Sephadex SR-100凝膠過濾柱層析。Hiprep SP陽離子交換色譜柱層析得到的活性峰經(jīng)3kDa超濾管濃縮后上樣于25mM Tris-HCl 0.15M NaCl pH 8.0的溶液平衡的Sephadex SR-100凝膠過濾柱。用同樣緩沖液洗脫得到圖2B，收集如圖所示活性峰。

第三步，Hiprep SP陽離子交換色譜柱層析。Sephadex SR100凝膠過濾得到的活性峰用超濾管濃縮更換為20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄pH 6.0緩沖液后上樣于GE公司的Hiprep SP陽離子交換色譜柱。Hiprep SP陽離子交換色譜柱用20mM Na₂HPO₄-NaH₂PO₄pH 6.0的緩沖液平衡，用含1M NaCl的同樣緩沖液從0％至100％的線性梯度洗脫得到圖2C，收集如圖所示活性峰。

第四步，Sephadex^TM G75 10/300GL凝膠過濾柱層析。Sephadex SR-100凝膠過濾柱層析得到的活性峰經(jīng)3kDa超濾管濃縮后上樣于生理鹽水或PBS平衡的Sephadex^TM G75 10/300GL凝膠過濾層析柱。用同樣緩沖液洗脫得到圖2B，收集如圖所示活性峰。

第五步，純化得到的印鼠客蚤多肽FS48電泳后得到圖2B-b電泳圖，然后切膠用自動氨基酸測序儀測定N末端氨基酸序列。

通過上述方法制備的印鼠客蚤多肽FS48是利用印鼠客蚤唾液腺基因重組表達的一種多肽，分子量為6182.26道爾頓，等電點為8.481，具體序列如SEQ ID NO：1所示。

MISATEYKCKVTGTGDMTIPFGCK DGNDVQGCKKLCQEKCKYTTTRQSCVGKKCYC(SEQ ID NO：1)

實施例4印鼠客蚤多肽FS48注射液制備：

(1)取純化鑒定的印鼠客蚤多肽FS48純品經(jīng)3kDa超濾管濃縮后將緩沖液更換為生理鹽水或pH值7～8的PBS緩沖液，采用Lowry氏法測定印鼠客蚤多肽FS48含量，調(diào)整濃度為10mg/ml注射液母液，分裝、-20℃保存。

(2)向注射液母液中加入終濃度為1％的Triton X-114立即劇烈振蕩混勻冰育10min后，20℃孵育10min，10000g室溫離心10分鐘，于超凈工作臺內(nèi)小心吸取上清液至無熱源器皿中，經(jīng)鱟試劑檢測內(nèi)毒素小于10EU/mL后將注射液母液調(diào)整濃度回10mg/ml待用。

(3)去內(nèi)毒素的10mg/ml注射液母液用生理鹽水或pH值7～8的PBS緩沖稀釋成0.5mg/ml的使用液后過濾除菌，-20℃保存分裝待用。

印鼠客蚤多肽FS48注射液的藥理學(xué)效果證實：

實施例5印鼠客蚤多肽FS48注射液對鉀離子通道的抑制作用

1)膜片鉗分析印鼠客蚤多肽FS48注射液對大鼠背根神經(jīng)元的作用：挑選出生4周左右、體重約為140～200g的SD大鼠，麻醉后斷頸處死，迅速挑出脊椎并將其剪成2～4段，將椎管沿與肋骨垂直的方向剪開，然后在盛有少量培養(yǎng)液的燒杯中浸泡椎管；仔細撕破附在椎管內(nèi)壁上的無色黏膜，暴露椎管和肋骨交匯處的背根神經(jīng)纖維。在胸椎和腰椎部分，挑選10～15個較好的背根神經(jīng)節(jié)放入裝有2mL臨時培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中。分離出神經(jīng)節(jié)以及神經(jīng)纖維后，用維娜斯剪切除神經(jīng)節(jié)外的絮狀物和軸索，放入盛有約0.5mL臨時培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中。倒去臨時培養(yǎng)液，用維娜斯剪將分離的神經(jīng)節(jié)剪碎。然后將剪碎后神經(jīng)細胞轉(zhuǎn)入含有15mL消化液的指管中,在34℃下、110rpm的環(huán)境中用消化液酶解20～30min。酶解期間每隔8～10min取出指管吹打細胞以防止細胞成團；酶解終止后向消化液中加入胰蛋白酶抑制劑，終止酶解反應(yīng)。將酶解后的溶液轉(zhuǎn)入離心管中離心(1000rpm、2-5min)，去除上清。用含10％小牛血清的培養(yǎng)液重懸細胞，重懸后的細胞分成3～4皿，每皿加入2mL培養(yǎng)液，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱(5％CO₂、95％空氣)中，培養(yǎng)3～4小時后用于記錄電流。

實驗前必須將細胞外液置于室溫下平衡后再更換培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液，以防止溶液溫度的劇烈變化。更換溶液時要防止細胞從培養(yǎng)皿底部脫落。倒置顯微鏡下選擇細胞膜較為光滑、細胞質(zhì)均勻的細胞，在室溫20～25℃條件下進行膜片鉗實驗。選用100μl硼硅酸鹽玻璃毛細管為玻璃電極材料，玻璃電極在拉制儀(PC-10，Narishige)上經(jīng)兩步拉制而成，玻璃電極熱拋光后電極尖端口徑為1.5～3.0μm，拉制完成后在玻璃電極內(nèi)灌細胞內(nèi)液。玻璃電極初始電阻為1.5～2.5MΩ比較好。待電極與細胞膜之間形成高阻抗的京歐封接后，補電極快電容。然后將細胞鉗制在-60mV，給予一短而有力的負壓，將鉗制在電極中的細胞膜迅速打破，再補償細胞慢電容。形成全細胞記錄模式后將細胞鉗制為-80mV，細胞穩(wěn)定4～6min開始記錄電流。Ca²⁺、Na⁺和K⁺電流被記錄用全細胞膜片鉗模式，用EPC-10放大器(HEKA,Lambrecht/Pfalz,德國)，P/4實驗方法被運用減去線性電容和漏電電流。實驗數(shù)據(jù)用(version 8.31；HEKA)脈沖程序獲取和用Sigmaplot(Sigma)分析。結(jié)果如圖3A所示，印鼠客蚤多肽FS48能抑制大鼠背根神經(jīng)元鉀離子通道。

2)膜片鉗分析印鼠客蚤多肽FS48注射液對表達離子通道細胞系的作用：脂質(zhì)體將離子通道質(zhì)粒和綠色熒光蛋白質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進HEK 293細胞，細胞用含10％胎牛血清的DMEM中在5％CO2，37℃條件下培養(yǎng)。將1.7mm軟質(zhì)玻璃毛坯(VWR,West Chester,PA)用P-97拉制儀拉制拋光后形成電極尖端口徑為1.5～3.0μm玻璃電極。膜片鉗分析多肽對Kv鉀通道作用的離子通道內(nèi)外液分別為：140mM KF,1mM EGTA,5mM ATP-Na,10mM HEPES,4mMMgCl₂,pH 7.3溶液和137mM NaCl,5.9mM KCl,1.2mM MgCl₂,2.2mM CaCl₂,10mM HEPES,14mM glucose pH 7.3溶液。將附有細胞的載玻片加入到灌流槽中，放置在倒置顯微鏡工作臺上，用含100％飽和氧細胞外液灌流裝置灌流，選取紋理清晰，表面無顆粒，無收縮的細胞作為實驗對象。鉗制電極充灌細胞內(nèi)液后用注射器加入少許正壓，使得電極尖端形成一向外凸的液面以便有助于電極入水時保持干凈。在液面上選擇干凈處讓電極入水，玻璃電極初始電阻為1.5～2.5MΩ比較好。待電極與細胞膜之間形成高阻抗的京歐封接后，補電極快電容。然后將細胞鉗制在-60mV，給予一短而有力的負壓，將鉗制在電極中的細胞膜迅速打破，再補償細胞慢電容。形成全細胞記錄模式后將細胞鉗制為-80mV，細胞穩(wěn)定4～6min開始記錄電流。系統(tǒng)電阻(Rs)在實驗過程中始終保持在5～10MΩ的范圍之內(nèi)最好能維持不變，系統(tǒng)串聯(lián)電阻(Rseries compensation)補償一般在30～70％之間，實驗過程中系統(tǒng)電阻始終保持在5～10MΩ的范圍之內(nèi)。記錄電流信號經(jīng)EPC-10膜片鉗放大器以3kHz和10kHZ雙重濾波過濾。線性漏電流和電容電流用P/4程序予以刪除。實驗數(shù)據(jù)用(version 8.31；HEKA)脈沖程序獲取和用Sigmaplot分析。由圖3可見，印鼠客蚤多肽FS48能特異性抑制Nav1.5鈉離子通道。結(jié)果如圖3A所示，印鼠客蚤多肽FS48能抑制Kv1.1和Kv4.1鉀離子通道，對Kv1.1抑制的IC50是72.4nM，不影響Kv1.1的穩(wěn)態(tài)活化。

實施例6印鼠客蚤多肽FS48注射液體內(nèi)鎮(zhèn)痛抗炎效果

實驗采用鼠尾熱痛、福爾馬林致痛、醋酸扭體實驗?zāi)Ｐ?。實驗小鼠選用出生4周左右的單一性別(雄性)，體重18-22g之間，分為實驗組(10、50、250nM/Kg)以及空白組。

1)鼠尾熱痛實驗：小鼠實驗前先稱量體重，按照體重腹腔注射相應(yīng)體積的三種濃度藥物，半小時后將小鼠裝入套管。儀器(泰盟SW-200光熱尾痛測試儀)預(yù)熱數(shù)分鐘將光強度調(diào)至062檔，探測方式為自動，將小鼠尾部后三分之一段放到檢測孔上，待儀器顯示準備就緒后打開強光源，當(dāng)鼠尾受熱甩尾時，儀器自動停止計時，結(jié)束實驗，記錄時間。結(jié)果如圖4A所示，印鼠客蚤多肽FS48能抑制小鼠的熱痛，且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。

2)福爾馬林致痛實驗：小鼠實驗前先稱量體重，按照體重腹腔注射相應(yīng)體積的三種濃度藥物，半小時后給每只小鼠按體重給予右后腳爪皮下1％福爾馬林溶液20μL。疼痛記錄分為兩相，phase I(0-5min)，phase II(15-45min)，記錄該時段小鼠舔爪總時間。結(jié)果如圖4B所示，印鼠客蚤多肽FS48能抑制福爾馬林對小鼠的致痛作用，且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。

3)醋酸扭體實驗：小鼠實驗前先稱量體重，按照體重腹腔注射相應(yīng)體積的三種濃度藥物，半小時后給每只小鼠按體重給予腹腔注射100μL 0.68％醋酸，記錄0-30min小鼠扭體次數(shù)。扭體判斷標準為表現(xiàn)為腹部收內(nèi)凹、腹前壁緊貼籠底、臀部歪扭和后肢伸張，呈一種特殊姿勢。結(jié)果如圖4C所示，印鼠客蚤多肽FS48能抑制醋酸對小鼠的致痛作用，且呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。

4)腳爪腫脹實驗：小鼠實驗前先稱量體重，按照體重腹腔注射相應(yīng)體積的三種濃度藥物，體積為100μL，半小時后給每只小鼠按體重給予右后爪皮下注射100μL 1％角叉菜膠，使用泰盟PV-200足趾容積測量儀記錄不同時間段小鼠爪子體積。在注射100μL 1％角叉菜膠4h后將腳爪從跗骨處砍下，稱重，在含0.5％的十六基溴化三甲胺PBS，pH6.0溶液中勻漿，然后13000g離心3分鐘，上清液被轉(zhuǎn)入96孔板，3，3-二甲氧基聯(lián)苯胺和1％過氧化氫的溶液中，每個樣品重復(fù)三個孔。設(shè)置髓過氧化物酶陽性對照孔。孵育10min后在酶標儀上測定450nm波長吸光值。髓過氧化物酶的活性單位被定義為在22℃1min內(nèi)使1μM過氧化氫轉(zhuǎn)化成水為1個活性單位。結(jié)果如圖4C所示，印鼠客蚤多肽FS48能抑制甲叉菜膠誘導(dǎo)的炎癥，且抑制了腳掌中炎性標志物髓過氧化物酶的活性。

實施例7印鼠客蚤多肽FS48的抗腫瘤效果

1)劃痕實驗：高表達Kv1.1亞型鉀通道細胞系NCI-H460以每孔3×10⁵個接種到六孔板內(nèi)，待細胞融合度達到80％左右時，在板底部用記號筆做10個點作為拍照時的坐標，將培養(yǎng)基換成沒有FBS的RPI1640，并用10μL槍頭劃三條痕，輕輕晃動用PBS洗掉漂浮的細胞，加入FS48使得濃度為16μΜ,在倒置顯微鏡下拍照。觀察24小時及48小時后加藥組與空白組的差異。數(shù)據(jù)處理采用ImageJ軟件。結(jié)果如圖6所示，印鼠客蚤多肽FS48抑制NCI-H460遷移。

2)侵襲實驗：Transwell內(nèi)孔加入用無血清培養(yǎng)基懸浮的高表達Kv1.1亞型鉀通道細胞系NCI-H460細胞懸液，細胞濃度為3×10⁵個每毫升，每孔加入200μL，外孔為含有10％FBS的全培養(yǎng)基RPI1640 500μL，待細胞在37℃5％CO₂培養(yǎng)箱穩(wěn)定4小時后向內(nèi)孔加入FS48使得終濃度為16μΜ，培養(yǎng)24小時后，取出內(nèi)孔，用醫(yī)用棉簽輕輕擦去孔內(nèi)細胞后放置在4％甲醛內(nèi)固定30min，用PBS清洗后使用10％結(jié)晶紫染液染色15min，顯微鏡下拍照。再用10％醋酸脫色后測量在570nm下的吸光度。結(jié)果如圖7所示，印鼠客蚤多肽FS48抑制NCI-H460侵襲。

實施例8印鼠客蚤多肽FS48的免疫調(diào)節(jié)作用

小鼠被無菌脫頸椎處死，無菌取出脾臟，用RPMI1640培養(yǎng)基去掉表明的血液，然后用1ml無菌注射器使其分散成單個細胞，利用紅細胞裂解液裂解去掉紅細胞，1500rpm離心5分鐘，去掉上清，沉淀細胞用含10％小牛血清的RPMI1640重懸，接種10⁵個/孔細胞到96孔細胞培養(yǎng)板，然后加入不同濃度的FS48無菌蛋白和0.75μg/Ml Con A設(shè)置空白細胞對照，在5％CO₂，37℃條件下培養(yǎng)30min，加入10％濃度的臺盼藍染色液繼續(xù)培養(yǎng)48h，細胞板測定570nm吸光值。細胞上清中細胞因子的含量采用BD公司的OptEIA^TM set MOUSE TNF,IL-2,INF捕獲ELISA試劑盒檢測。結(jié)果如圖7所示，印鼠客蚤多肽FS48能抑制小鼠脾細胞增殖，抑制IL-2和INF-γ釋放，促進TNF-α釋放。

SEQUENCE LISTING

<110> 南方醫(yī)科大學(xué)

<120> 印鼠客蚤多肽及其基因和應(yīng)用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 56

<212> PRT

<213> Xenopsylla cheopis

<400> 1

Met Ile Ser Ala Thr Glu Tyr Lys Cys Lys Val Thr Gly Thr Gly Asp

1 5 10 15

Met Thr Ile Pro Phe Gly Cys Lys Asp Gly Asn Asp Val Gln Gly Cys

20 25 30

Lys Lys Leu Cys Gln Glu Lys Cys Lys Tyr Thr Thr Thr Arg Gln Ser

35 40 45

Cys Val Gly Lys Lys Cys Tyr Cys

50 55

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggcatatgat aagtgcaact gagtataaat gc 32

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctcgagacaa tagcatttct ttcc 24

<210> 4

<211> 177

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

catatgataa gtgcaactga gtataaatgc aaagtaacag gaacaggtga tatgacaata 60

ccatttggat gtaaagatgg caatgatgtt caaggatgta aaaaactttg tcaggagaaa 120

tgtaaataca cgacaacacg acaatcttgt gttggaaaga aatgctattg tctcgag 177