本發(fā)明涉及一種對映體純的(1R,4S)-(-)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮以及(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-環(huán)戊烯-1-羧酸的制備方法。

背景技術(shù)：

(1R,4S)-(-)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮(如式(II)所示，簡稱為(-)-文斯內(nèi)酰胺、文斯內(nèi)酯或(-)-γ-內(nèi)酰胺)

是一種碳環(huán)核苷類化合物合成的重要手性前體。它可以用于合成多種手性藥物，例如抗艾滋病藥物阿巴卡韋(Abacavir)、抗甲型流感及禽流感藥物帕拉米韋(Peramivir)和新型降糖藥物美格列汀(Melogliptin)等。但是在該手性化合物的化學(xué)合成中，一般獲得的都是外消旋的(±)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮，如式(I)所示。

目前，眾多制備對映體純的(-)-文斯內(nèi)酰胺的方法(包括物理法、化學(xué)法和生物法)中，生物法因為具有反應(yīng)效率高、立體選擇性好、反應(yīng)條件溫和、低能耗、環(huán)境友好等優(yōu)點，受到越來越廣泛的關(guān)注和越來越深入的研究。

目前已有若干研究顯示，微生物細胞或來源于生物的酶，可以通過立體選擇性水解N-保護的文斯內(nèi)酰胺衍生物的外消旋體，制備對映體純的(-)-文斯內(nèi)酰胺。由于化合物(I)的氮原子被衍生化時，內(nèi)酰胺 鍵可以被活化，從而更容易在酶催化反應(yīng)中被水解，因而較早的研究集中于使用N-保護的文斯內(nèi)酰胺衍生物作為生物法拆分的原料。專利EP-A-0424064、CN1261405A和CN1133749C分別公開了使用不同生物酶拆分N-保護的文斯內(nèi)酰胺衍生物獲得(-)-文斯內(nèi)酰胺及其衍生物的方法。但是，這些生物酶不能催化N-未保護的文斯內(nèi)酰胺的水解，不便于工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用。

近年來，已有研究者發(fā)現(xiàn)若干生物細胞或其產(chǎn)生的酶能夠直接以(±)-文斯內(nèi)酰胺外消旋體作為原料，以較高的立體選擇性水解(+)-構(gòu)型，保留大多數(shù)所需的(-)-文斯內(nèi)酰胺。鄭國鈞等在專利CN101113423A、CN101240257A和CN101285059A中篩選了適用于此目的的菌株Microbacterium hydrocarbonxydans CGMCC 2085，并將該微生物的細胞及其產(chǎn)生的特異性內(nèi)酰胺酶應(yīng)用于(-)-文斯內(nèi)酰胺的制備。倪曄等在專利CN105200076A篩選得到了一種來源于Delftia sp.CGMCC 5755的(+)-γ-內(nèi)酰胺酶，通過將這種酶的基因重組表達于B.subtilis 168/pMA5-delm宿主菌中，獲得了一種高選擇性的制備(-)-文斯內(nèi)酰胺的重組微生物催化劑。

應(yīng)用上述微生物細胞，均可在較短反應(yīng)時間內(nèi)制備得到手性純度較高的(-)-文斯內(nèi)酰胺。然而已有報道的研究成果當中，將這些生物催化制備對映體純(-)-文斯內(nèi)酰胺的技術(shù)，生物細胞的用量大，底物濃度低，收率低，給后續(xù)產(chǎn)物分離純化帶來很多麻煩，不易于工業(yè)化生產(chǎn)。

此外，上述通過生物催化或酶技術(shù)由(±)-文斯內(nèi)酰胺外消旋體獲得(-)-文斯內(nèi)酰胺的方法中，均沒有回收分離作為水解產(chǎn)物的(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-環(huán)戊烯-1-羧酸，造成了這種化學(xué)原料的浪費。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

現(xiàn)在，我們已經(jīng)開發(fā)了一種高產(chǎn)率并且高效的由外消旋體制備對映體純的式(II)中間體，同時獲得對映體純的式(III)中間體的方法， 旨在通過一種新型酶催化技術(shù)，實現(xiàn)較高底物濃度(原料占反應(yīng)混合物的重量百分比超過20％)和較大反應(yīng)規(guī)模(100kg以上)的情況下，實現(xiàn)(±)-文斯內(nèi)酰胺的選擇性水解拆分，從而實現(xiàn)大規(guī)模制備對映體純的(1R,4S)-(-)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮以及(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-環(huán)戊烯-1-羧酸的目的。

特別是我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，脂肪酶Amano Lipase A(又名Lipase A"Amano")和酯酶Esterase-53(又名Esterase AR)對此水解拆分(±)-文斯內(nèi)酰胺有非常好的活性。在此優(yōu)選使用酯酶Esterase-53，其表現(xiàn)出(±)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的生物催化轉(zhuǎn)化率適用于工業(yè)規(guī)模上應(yīng)用。Esterase-53是一種將來源于分枝節(jié)桿菌(Anthrobatcter ramosus)的基因重組于大腸桿菌(Escherichia coli)中發(fā)酵制備的酯水解酶。

本發(fā)明提供了一種通過對映體拆分式(I)的(±)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的外消旋物，制備式(II)的(1R,4S)-(-)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮，同時制備式(III)的(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-環(huán)戊烯-1-羧酸的方法，

該方法包括使用對映體選擇性水解所述外消旋物(I)的內(nèi)酰胺鍵的脂肪酶或酯酶與所述外消旋物(I)進行反應(yīng)，以生成作為未反應(yīng)物的對映體純的所述(1R,4S)-(-)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮(II)和作為水解產(chǎn)物的所述(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-環(huán)戊烯-1-羧酸(III)。

上述反應(yīng)的反應(yīng)式如式(IV)所示。

在本發(fā)明的制備方法中，所述脂肪酶是Amano Lipase A。該脂肪酶來源于黑曲霉(Aspergillus niger)。

在本發(fā)明的制備方法中，所述酯酶是Esterase-53。該酯酶來源于分枝節(jié)桿菌(Anthrobatcter ramosus)或來源于將所述菌種的基因重組于大腸桿菌(Escherichia coli)中。

在本發(fā)明的制備方法中，還包括以常規(guī)方法分離出未反應(yīng)的式(II)的對映體，以及以常規(guī)方法分離出式(III)的水解產(chǎn)物。常規(guī)分離方法包括有機溶劑進行萃取、離子交換或?qū)游龅取Ｆ渲?，?yōu)選使用溶劑萃取法分離未反應(yīng)的所述式(II)的對映體以及所述式(III)的水解產(chǎn)物。

在本發(fā)明的制備方法中，所述反應(yīng)在有機溶劑和水的混合物，或純水中進行。在使用有機溶劑和水的混合物的情況下，所述有機溶劑是水不可混溶的。其作用在于進一步增加底物的溶解性同時降低在水相中的底物濃度。優(yōu)選的水不可混溶的有機溶劑是甲基叔丁基醚或甲基四氫呋喃。

在本發(fā)明的制備方法中，所述反應(yīng)在pH范圍為5～9的條件下進行。當pH小于5時，酶的催化活力可能顯著降低。當pH大于9時，酶活亦有可能降低，同時底物會無選擇性地自發(fā)水解。優(yōu)選的反應(yīng)pH為8。通過向反應(yīng)溶劑中加入緩沖液進行pH控制。常用的緩沖液包括但不限于KH₂PO₄-K₂HPO₄或NaH₂PO₄-Na₂HPO₄緩沖液。

在本發(fā)明的制備方法中，所述反應(yīng)在溫度為15～60℃的條件下進行。當溫度低于15℃時，反應(yīng)速度較慢。但溫度高于60℃時，酶會不可逆失活。出于保證反應(yīng)穩(wěn)定、高效進行的目的，優(yōu)選的反應(yīng)溫度為30℃。

在本發(fā)明的制備方法中，還包括在分離出未反應(yīng)的所述式(II)的對映體之后，以重結(jié)晶法提純分離的所述(1R,4S)-(-)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮(II)的步驟。

在本發(fā)明的制備方法中，還包括在分離出未反應(yīng)的所述式(II)的對映體之后，以常規(guī)方法從母液中分離出水解產(chǎn)物(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-環(huán)戊烯-1-羧酸(III)的步驟。

以本發(fā)明的方法制備的(1R,4S)-(-)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮(II)，對映體過量值不低于99％，純度不低于99％。以本發(fā)明的方法制備的(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-環(huán)戊烯-1-羧酸(III)，對映體過量值不低于99％。

本發(fā)明的方法能夠在較高底物濃度(原料占反應(yīng)混合物的重量百分比超過20％)和較大反應(yīng)規(guī)模(100kg以上)的情況下進行，反應(yīng)操作簡單、產(chǎn)率高、選擇性好，對原料利用率高。

本發(fā)明的積極進步效果在于，成功實現(xiàn)了生物催化技術(shù)大規(guī)模和高效率制備對映體純(1R,4S)-(-)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮，同時實現(xiàn)對水解產(chǎn)物(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-環(huán)戊烯-1-羧酸的回收。對于工業(yè)化生產(chǎn)這兩種化合物具有重要價值。

附圖說明

圖1是(±)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的外消旋物的手性HPLC圖譜。左側(cè)的峰為(1S,4R)-(+)-構(gòu)型，右側(cè)的峰為(1R,4S)-(-)-構(gòu)型。

圖2是按照本發(fā)明實施例1的方法，轉(zhuǎn)化后的(1R,4S)-(-)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的手性HPLC圖譜。圖中唯一的峰為目標化合物(1R,4S)-(-)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮，(+)-構(gòu)型沒有檢出。

圖3是(±)-4-氨基-2-環(huán)戊烯-1-羧酸的外消旋物的手性HPLC圖譜。 左側(cè)的峰為(1S,4R)-(+)-構(gòu)型，右側(cè)的峰為(1R,4S)-(-)-構(gòu)型。

圖4是按照本發(fā)明實施例1的方法，轉(zhuǎn)化后的(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-環(huán)戊烯-1-羧酸的手性HPLC圖譜。圖中唯一的峰為目標化合物(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-環(huán)戊烯-1-羧酸，(-)-構(gòu)型沒有檢出。

圖5是按照本發(fā)明實施例2的方法，轉(zhuǎn)化后的(1R,4S)-(-)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的手性HPLC圖譜。圖中左側(cè)的峰為(+)-構(gòu)型，右側(cè)的峰為目標化合物(1R,4S)-(-)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮。

具體實施方式

本發(fā)明所述的通過脂肪酶或酯酶催化，對映體拆分式(I)的(±)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的外消旋物，制備式(II)的(1R,4S)-(-)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮，同時制備式(III)的(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-環(huán)戊烯-1-羧酸的反應(yīng)方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)利用Esterase-53或Amano Lipase A，催化外消旋的(±)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮水解的步驟。

本文中所指的“外消旋的(±)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮”一般地表示(1R,4S)-(-)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮和(1S,4R)-(+)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的混合物，并不特別限定其中(+)-文斯內(nèi)酰胺和(-)-文斯內(nèi)酰胺的含量比例。例如，以混合物的總重量計，(-)-異構(gòu)體可以占其中的0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或上述數(shù)值組成的范圍內(nèi)的任意值。

對作為原料的外消旋的(±)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮在反應(yīng)體系中的濃度沒有特別限定，可以基于反應(yīng)器設(shè)計、反應(yīng)條件和酶催化劑的選擇等具體判定。出于提高反應(yīng)效率的目的，(±)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的濃度優(yōu)選為50～200g/L。

作為原料的(±)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮可以在反應(yīng)開始時一次性加入反應(yīng)介質(zhì)中，也可以在反應(yīng)過程中分多次加入反應(yīng)體系。

對所使用的脂肪酶或酯酶沒有特別限定，只要其能夠催化(+)-文斯內(nèi)酰胺的水解即可。優(yōu)選的脂肪酶是Esterase-53，并且在原料外消旋體的濃度為50～200g/L的情況下，Esterase-53的濃度優(yōu)選為0.4～5g/L。優(yōu)選的酯酶是Amano Lipase A，并且在原料外消旋體的濃度為25～200g/L的情況下，Amano Lipase A的濃度為10～200g/L。

在本發(fā)明的水解步驟中，考慮到酶催化劑的活性，適合的反應(yīng)溫度為15-60℃。并且出于保證反應(yīng)穩(wěn)定、高效進行的目的，最優(yōu)選的反應(yīng)溫度為30℃。

在本發(fā)明的水解步驟中，所使用的反應(yīng)介質(zhì)包括但不限于水。具體來說，反應(yīng)介質(zhì)可以是純水，或者有機溶劑和水的混合物。為了進一步增加底物的溶解性同時降低在水相中的底物濃度，其中所使用的有機溶劑能夠溶解文斯內(nèi)酰胺，并且是水不可混溶的。優(yōu)選的有機溶劑包括甲基叔丁基醚、異丙醚或2-甲基四氫呋喃等。在使用水和水不可混溶的有機溶劑的情況下，反應(yīng)體系為兩相體系。

本發(fā)明的水解反應(yīng)在pH范圍為5～9的條件下進行。出于最大化酶活性的目的，最優(yōu)選的pH為8。為了調(diào)整反應(yīng)體系的pH值，反應(yīng)介質(zhì)中可以含有緩沖液。能夠使用的緩沖液包括但不限于KH₂PO₄-K₂HPO₄或NaH₂PO₄-Na₂HPO₄緩沖液。緩沖液中磷酸鹽的濃度在25～500mmol/L的范圍內(nèi)，優(yōu)選為100mmol/L。

對本發(fā)明的水解反應(yīng)的進行時間沒有特別限定，只要達到期望的反應(yīng)程度即可。為了提高反應(yīng)產(chǎn)率和生產(chǎn)效率，反應(yīng)時間可以是2小時、6小時、12小時、24小時、36小時、48小時、60小時、72小時、或上述時間組成的范圍內(nèi)的任意時間。

(2)水解反應(yīng)后，分離未反應(yīng)的(1R,4S)-(-)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5- 烯-3-酮(II)粗產(chǎn)品的步驟。

在本發(fā)明的水解步驟之后，可以以常規(guī)方法分離出未反應(yīng)的式(II)的對映體的粗產(chǎn)品。常規(guī)分離方法包括有機溶劑萃取、離子交換或?qū)游龅取Ｆ渲?，?yōu)選使用溶劑萃取法分離未反應(yīng)的式(II)的對映體。

萃取的具體步驟如下：使用二氯甲烷或甲基叔丁基醚萃取整個反應(yīng)體系2～6次；以體積計，每次萃取使用二氯甲烷或甲基叔丁基醚的量不少于反應(yīng)混合物的0.5倍，萃取時間不少于20分鐘。每次萃取結(jié)束后，萃取混合物經(jīng)離心機或過濾器處理，分層后，取中間層和水層用于下一次萃取。合并每一次萃取的有機層，即為粗產(chǎn)品的溶液。

保留最后一次萃取之后的水層，用于隨后的分離水解產(chǎn)物(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-環(huán)戊烯-1-羧酸(III)的步驟。

(3)對分離的(1R,4S)-(-)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮(II)粗產(chǎn)品進行提純的步驟。

在分離步驟中獲得的包含(1R,4S)-(-)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮(II)粗產(chǎn)品的有機溶液，可以直接在不高于45℃的條件下減壓濃縮蒸干，獲得式(II)對映體的固體。

或者，分離步驟獲得的粗產(chǎn)品可以通過下面的方法進行結(jié)晶提純：

將粗產(chǎn)品的有機溶液在45℃以下減壓濃縮至初始原積的5～20％，再加入所剩溶液體積1～3倍的正庚烷或正己烷。混合均勻后，繼續(xù)在不高于45℃的溫度下減壓濃縮，直至體積減小至濃縮前的20～40％。然后過濾或離心，將所得濕物料在不超過30℃、氮氣保護的條件下干燥，獲得式(II)對映體的固體。

上述兩種方式，均能夠得到淺黃色或淺灰色至白色的固體或晶體粉末。經(jīng)手性HPLC檢測，為對映體過量值不低于99％、純度不低于99％的產(chǎn)品(1R,4S)-(-)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮。

(4)提取水解產(chǎn)物(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-環(huán)戊烯-1-羧酸(III)的步驟。

水解反應(yīng)之后，作為水解產(chǎn)物的(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-環(huán)戊烯-1-羧酸(III)溶解于反應(yīng)體系的水相中。因此，水解產(chǎn)物的提取可以在水解反應(yīng)之后，直接從反應(yīng)體系水相中提??；也可以在從整個反應(yīng)體系中分離出式(II)的對映體之后，從剩余的水層中提取。

在使用萃取法分離式(II)的對映體的情況下，可以按照下列步驟，從萃取后所剩的水相母液中提取水解產(chǎn)物(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-環(huán)戊烯-1-羧酸：

以體積計，向水相母液中加入1～2倍的正丁醇或3～5倍的2-丁酮，在不低于50℃的溫度下減壓濃縮至原體積的20～50％，直至出現(xiàn)固體析出。向此混合物中加入原體積0.2～0.8倍的甲醇或乙醇，在不高于50℃溫度下繼續(xù)濃縮直至大量固體析出。過濾或離心分離出固體。將分離所得固體用甲醇洗滌數(shù)次，在不高于30℃、氮氣保護的條件下干燥，獲得式(III)的水解產(chǎn)物。

通過以上步驟得到淺黃色或淺灰色至白色的固體或粉末。經(jīng)手性HPLC檢測，為對映體過量值不低于99％的產(chǎn)品(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-環(huán)戊烯-1-羧酸(III)。

在本發(fā)明的制備方法中，所使用試劑和原料均市售可得。

實施例

以下根據(jù)實施例，并且結(jié)合附圖，詳細描述本發(fā)明。從下文的詳 細描述中，本發(fā)明的上述方面和本發(fā)明的其他方面將是明顯的。下列實施例僅試圖闡明本發(fā)明，而對本發(fā)明保護范圍不起任何限定作用。

實施例1

在500mL玻璃夾套反應(yīng)瓶中，加入100mL水，0.064g NaH₂PO₄和1.344g Na₂HPO₄，攪拌直至固體溶清；加入20g(±)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的外消旋物，攪拌至固體溶清；調(diào)整并控制反應(yīng)液溫度30℃；向反應(yīng)液中加入0.4g Esterase-53酶，攪拌12小時；向反應(yīng)液加入10g(±)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的外消旋物，繼續(xù)攪拌24小時。

用二氯甲烷萃取反應(yīng)液4次，每次使用150mL二氯甲烷。合并全部萃取有機相，在30℃減壓蒸餾濃縮有機相至大約30mL；向濃縮液中加入70mL正庚烷，在50℃減壓蒸餾濃縮有機相至大約30mL；過濾；所得固體在30℃、氮氣流保護下減壓烘干12小時，稱重得13.5g白色粉末，分離收率45％。經(jīng)手性HPLC分析，所得固體即產(chǎn)品(1R,4S)-(-)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮，對映體過量值100％。HPLC分析條件：島津LC-20A液相色譜儀和紫外檢測器；Chirapak IC(250×4.6mm，0.5μm)手性色譜柱；流動相：正己烷-乙醇(體積比70:30)；柱溫40℃、流速1mL/min下平衡；檢測波長225nm(以下簡稱為HPLC條件1)。

向萃取后剩余的水相中，加入100mL正丁醇，在50℃下減壓濃縮至20mL；加入20mL甲醇，在50℃下繼續(xù)減壓濃縮至20mL，過濾；將過濾所得固體用甲醇洗滌3次，每次使用20mL；所得固體在30℃、氮氣流保護下減壓烘干12小時，稱重得16.0g淺黃色粉末，分離收率46％。經(jīng)N-Boc衍生化后用手性HPLC分析，所得固體即副產(chǎn)品(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-環(huán)戊烯-1-羧酸，對映體過量值100％。HPLC分析條件：島津LC-20A液相色譜儀和紫外檢測器；Chirapak IC(250×4.6mm，0.5μm)手性色譜柱；流動相：正己烷-乙醇(體積比95:5)；柱溫30℃、流速1mL/min下平衡；檢測波長210nm(以下簡稱為HPLC條件2)。

實施例2

在250mL反應(yīng)瓶中加入70mL水，0.06g KH₂PO₄·2H₂O和1.5g K₂HPO₄，控制反應(yīng)溫度30℃，攪拌1小時；加入12g(±)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的外消旋物，加入600mg Esterase-53酶，控制溫度30℃，攪拌16小時。

用二氯甲烷萃取反應(yīng)液4次；萃取后的有機相，在30℃減壓蒸餾濃縮直至20mL；加入正庚烷60mL，減壓蒸餾濃縮直至40mL；過濾；所得固體在40℃、氮氣保護下減壓干燥12小時，稱重得到5.6g白色晶體狀粉末，分離收率46.8％。經(jīng)手性HPLC分析，所得固體即產(chǎn)品(1R,4S)-(-)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮，對映體過量值99.9％。HPLC分析條件同HPLC條件1。

向萃取后剩余的水相中，加入50mL正丁醇，在50℃下減壓濃縮至15mL；加入15mL甲醇，在50℃下繼續(xù)減壓濃縮至10mL，過濾；將過濾所得固體用甲醇洗滌3次，每次使用3mL；所得固體在30℃、氮氣流保護下減壓烘干12小時，稱重得5.6g淺黃色粉末，分離收率40％。經(jīng)手性HPLC分析，所得固體即(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-環(huán)戊烯-1-羧酸，對映體過量值99.9％。HPLC分析條件同HPLC條件2。

實施例3

在200mL玻璃燒瓶中加入40mL水，20mL甲基叔丁基醚和和10g(±)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的外消旋物，充分震蕩至固體溶清；將0.2g Esterase-53酶溶于10mL純水，再將所得酶溶液與反應(yīng)物混合；在室溫下攪拌24小時。

用甲基叔丁基醚萃取反應(yīng)液6次，每次使用50mL甲基叔丁基醚。合并萃取有機相，減壓蒸餾濃縮直至溶劑完全蒸干。所得固體在40℃、氮氣流保護下減壓烘干12小時，稱重得4.4g白色晶體狀粉末，分離收率44％。經(jīng)手性HPLC分析，所得固體即產(chǎn)品(1R,4S)-(-)-2-氮雜雙環(huán) [2.2.1]庚-5-烯-3-酮，對映體過量值100％。HPLC分析條件同HPLC條件1。

將萃取后剩余的水相在50℃下減壓濃縮至10mL；加入6mL甲醇，過濾；將過濾所得固體用甲醇洗滌3次，每次使用3mL；所得固體在30℃、氮氣流保護下減壓烘干24小時，稱重得3.5g淺黃色粉末，分離收率30％。經(jīng)手性HPLC分析，所得固體即(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-環(huán)戊烯-1-羧酸，對映體過量值99.9％。HPLC分析條件同HPLC條件2。

實施例4

除了將NaH₂PO₄的量改變?yōu)?.244g、Na₂HPO₄的量改變?yōu)?.185g、水浴溫度改變?yōu)?5℃之外，以與實施例1相同的方法，制備及分析(-)-對映體和水解產(chǎn)物。

從萃取的有機相中分離得到8.1g(1R,4S)-(-)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮，對映體過量值98％，分離收率27％。從水相中分離得到7.0g(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-環(huán)戊烯-1-羧酸，對映體過量值99％，分離收率20％。

實施例5

除了將KH₂PO₄的量改變?yōu)?g、水浴溫度改變?yōu)?0℃之外，以與實施例2相同的方法，制備及分析(-)-對映體和水解產(chǎn)物。

從萃取的有機相中分離得到4.7g(1R,4S)-(-)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮，對映體過量值99％，分離收率39％。從水相中分離得到4.2g(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-環(huán)戊烯-1-羧酸，對映體過量值99％，分離收率30％。

實施例6

在1000mL玻璃夾套反應(yīng)瓶中，加入500mL水，0.064g NaH₂PO₄和1.344g Na₂HPO₄，攪拌直至固體溶清；加入10.0g(±)-2-氮雜雙環(huán) [2.2.1]庚-5-烯-3-酮的外消旋物，攪拌至固體溶清；通過恒溫循環(huán)水浴控制反應(yīng)液溫度30℃；加入5g Amano Lipase A酶，攪拌60小時。

用二氯甲烷萃取反應(yīng)液。合并全部萃取有機相，在30℃減壓蒸餾濃縮直至溶劑完全蒸干。所得固體在氮氣流保護下減壓烘干12小時，稱重得4.5g白色晶體狀粉末，分離收率45％。經(jīng)手性HPLC分析，所得固體即產(chǎn)品(1R,4S)-(-)-2-氮雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-3-酮，對映體過量值100％。HPLC分析條件同HPLC條件1。

將萃取后剩余的水相在50℃下減壓濃縮至7mL；加入10mL甲醇，過濾；將過濾所得固體用甲醇洗滌3次，每次使用3mL；所得固體在30℃、氮氣流保護下減壓烘干24小時，稱重得4.2g淺黃色粉末，分離收率36％。經(jīng)手性HPLC分析，所得固體即(1S,4R)-(+)-4-氨基-2-環(huán)戊烯-1-羧酸，對映體過量值99％。HPLC分析條件同HPLC條件2。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當明了，盡管為了舉例說明的目的，本文描述了本發(fā)明的具體實施方式，但可以對其進行各種修改而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。因此，本發(fā)明的具體實施方式和實施例不應(yīng)當視為限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明僅受所附權(quán)利要求的限制。本申請中引用的所有文獻均完整地并入本文作為參考。