本發(fā)明涉及一個(gè)高抗水稻白葉枯病的基因的DNA標(biāo)記及其在育種中的應(yīng)用，屬于分子遺傳育種領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

水稻白葉枯病是一種世界性的細(xì)菌病害，它與稻瘟病、紋枯病一起被稱為水稻的“三大病害”。水稻遭遇白葉枯病后，一般減產(chǎn)20～30％，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)50％，甚至絕收。發(fā)掘和利用抗病基因是防治水稻白葉枯病的最有效方法。迄今，國際上在水稻中已鑒定了近40個(gè)抗白葉枯病基因(國家水稻數(shù)據(jù)中心http://www.ricedata.cn)，但是只有少數(shù)幾個(gè)兼具全生育期、廣譜、持久等良好的抗病特性，真正能有效地用于水稻抗白葉枯病的育種和生產(chǎn)的基因并不多。水稻Xa7是一個(gè)來自孟加拉稻種的國際上公認(rèn)的白葉枯病高抗基因，是水稻抗病育種中一個(gè)較為理想的抗源。因此，利用分子標(biāo)記輔助育種(MAS)技術(shù)，將Xa7基因?qū)胫髟缘碾s交稻恢復(fù)系中，有望大大提高我國水稻的抗病性和生產(chǎn)安全。而開發(fā)目的基因的高精度分子標(biāo)記，是基因分子育種的關(guān)鍵，更能大大提高基因鑒定的精確度。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種水稻高抗白葉枯病基因特異性標(biāo)記及其應(yīng)用，本發(fā)明能用于Xa7基因的精準(zhǔn)的鑒定及其在水稻育種中應(yīng)用。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種水稻Xa7基因高精度分子標(biāo)記，以水稻作為物種，該分子標(biāo)記的擴(kuò)增引物選自下列引物對(duì)，其中的核苷酸序列為5′→3′，

Xa7-SM1正向：5’GATGGCTCTGATGATGCGCTCTGACTTGAT 3’，

反向：5’CCACTGCTAGAGACGGGGGACTTATCTCA 3’。

即，本發(fā)明提供了一個(gè)可以特異性鑒定抗白葉枯病Xa7基因的緊密連鎖或共分離標(biāo)記(即，水稻抗白葉枯病基因Xa7的DNA標(biāo)記)，該標(biāo)記為Xa7-SM1。

本發(fā)明還同時(shí)提供了上述水稻Xa7基因高精度分子標(biāo)記的用途：用于含Xa7的水稻與不含Xa77的水稻之間的分子檢測(cè)及其后代的標(biāo)記輔助選擇。即，用于Xa7基因的精準(zhǔn)的鑒定及其在水稻育種中應(yīng)用。

作為本發(fā)明的水稻Xa7基因高精度分子標(biāo)記的用途的改進(jìn)：當(dāng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳中含有如SEQ ID NO：1所示序列時(shí)，為含Xa7的水稻；反之，則為不含Xa7的水稻。

即，引物Xa7-SM1PCR擴(kuò)增所得的分子標(biāo)記Xa7-SM1在含Xa7品種(例如IRBB7)中的序列如SEQ ID NO：1所述；引物Xa7-SM1PCR擴(kuò)增所得的分子標(biāo)記Xa7-SM1在不含Xa7品種(例如IR24)中不含有SEQ ID NO：1所述序列。

本發(fā)明還提供了上述水稻抗白葉枯病Xa7基因標(biāo)記的用途：用于水稻Xa7基因的分子標(biāo)記輔助選擇育種。

發(fā)明人在發(fā)明過程中，

首先，利用“圖位克隆”技術(shù)將Xa7基因精細(xì)定位于水稻第6染色體的50kb間，并分別構(gòu)建了水稻含Xa7品種IRBB7與其近等基因系不含Xa7品種IR24的基因組文庫，通過測(cè)序和比對(duì)兩個(gè)品種定位區(qū)間的序列，發(fā)現(xiàn)IRBB7存在一些IR24中沒有的差異序列。將這些序列在國際權(quán)威的生物學(xué)NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行比對(duì)，在現(xiàn)有的水稻DNA數(shù)據(jù)中沒有搜索到相同或相似的序列，表明在IRBB7中這些序列是新發(fā)現(xiàn)的水稻基因組序列。因此，本發(fā)明利用以上序列中的1個(gè)位點(diǎn)，開發(fā)了1個(gè)新的DNA標(biāo)記，用于精確的檢測(cè)Xa7基因，在Xa7遺傳育種中可以比較快速、精確的鑒定Xa7基因，大大提高基因轉(zhuǎn)育的效率。

本發(fā)明的具體技術(shù)內(nèi)容如下：根據(jù)以上在水稻IRBB7中發(fā)現(xiàn)的1個(gè)新DNA序列，分別設(shè)計(jì)PCR引物，開發(fā)出1個(gè)對(duì)應(yīng)的DNA標(biāo)記Xa7-SM1。用這個(gè)標(biāo)記的引物，分別對(duì)含Xa7基因與不含Xa7基因的水稻品種基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在含Xa7水稻品種的PCR產(chǎn)物中檢測(cè)到1053bp(如SEQ ID NO：1所示)的條帶，而不含Xa7水稻品種的PCR產(chǎn)物中檢測(cè)不到無相應(yīng)的條帶(圖1)。表明標(biāo)記Xa7-SM1與Xa7基因具有很高的一致性，能精確的分析待測(cè)水稻品種是否含有Xa7基因，在Xa7遺傳育種中可以大大提高基因轉(zhuǎn)育的效率。

利用本發(fā)明檢測(cè)出某個(gè)水稻品種內(nèi)是否含有“Xa7基因位點(diǎn)”的最終目的是：確認(rèn)在被測(cè)定水稻品種中是否含有Xa7基因。一般現(xiàn)在可采用白葉枯病菌的抗譜分析來鑒定Xa7基因的存在，但是該方法需要多個(gè)菲律賓生理小種，接菌條件包括水稻的生育時(shí)期、氣候、溫度等也比較嚴(yán)格，且鑒定可靠性不夠高。

本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)單，該標(biāo)記的穩(wěn)定性好，不受其它基因效應(yīng)和環(huán)境因素的影響，結(jié)合已有的分子標(biāo)記，可以大大提高Xa7基因的鑒定精確性，適于推廣應(yīng)用。本發(fā)明對(duì)水稻抗白葉枯的品種改良具有重要意義，可直接用于Xa7基因的輔助選擇育種。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

圖1為IRBB7和IR24的Xa7-SM1標(biāo)記檢測(cè)圖；

圖1中：M.Marker；1.含Xa7基因的水稻品種IRBB7；2.不含Xa7基因的水稻品種IR24。

圖2為各種已知含Xa7與不含Xa7水稻品種的Xa7-SM1標(biāo)記檢測(cè)圖；

圖2中：M.Marker；含Xa7基因的水稻品種：1.IRBB7(對(duì)照)，2.DV85，3.鎮(zhèn)恢084；不含Xa7基因的水稻品種：4.日本晴，5.9311，6.浙輻802，7.中花11，8.TP309。

圖3為轉(zhuǎn)育Xa7基因的成恢448的Xa7-SM1標(biāo)記檢測(cè)圖；

圖3中：M.Marker；1.IRBB7(對(duì)照)；2.成恢448(不含Xa7)；3.成恢448(轉(zhuǎn)育了Xa7)。

圖4轉(zhuǎn)育Xa7基因的成恢448的白葉枯病抗性鑒定圖；

圖4中：橫坐標(biāo)P1～P10，國際公認(rèn)用來鑒定水稻白葉枯病抗性的10個(gè)不同白葉枯病原菌小種；縱坐標(biāo)，水稻葉片侵染白葉枯病菌后病斑的長(zhǎng)度(單位cm)，病斑越短表明抗病性越強(qiáng)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

實(shí)施例1、

1、引物合成：可委托Life Technologies公司合成Xa7-SM1標(biāo)記的引物，引物序列為：

5’GATGGCTCTGATGATGCGCTCTGACTTGAT 3’和

5’CCACTGCTAGAGACGGGGGACTTATCTCA 3’。

2、DNA提?。阂运镜娜~片為材料提取基因組DNA，已報(bào)道的DNA提取方法很多，可任意選擇一種，本案例采用的是Panaud等(Mol Gen Genet,1996,252:597-607)報(bào)道的方法。

3、PCR擴(kuò)增：在0.2ml的PCR擴(kuò)增專用薄壁管中，加入20ng水稻DNA、兩條引物各0.25μM、2×Taq PCR Master Mix(TIANGEN公司)、用ddH₂O定容到20μl，充分混勻。PCR擴(kuò)增在熱循環(huán)儀上進(jìn)行，擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸60秒，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸5分鐘。本發(fā)明采用的熱循環(huán)儀為Biometra公司的T3000型。

4、PCR產(chǎn)物的電泳：用1×TAE電泳液制備濃度為1％(w/w)的瓊脂糖凝膠，取步驟3所得的PCR產(chǎn)物10μl，與1μl 10×Loading Buffer混合，加到凝膠的點(diǎn)樣孔中，在100V恒壓下電泳30分鐘。用溴化乙錠(Ethidium bromide，EB)對(duì)凝膠進(jìn)行染色，顯示DNA條帶，染色方法按照《分子克隆》(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，第三版)。

5、電泳圖譜分析：在紫外透射儀上，用305nm波段觀察凝膠上的電泳條帶，通過比對(duì)DNA Marker判斷電泳條帶的大小。以IRBB7的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，標(biāo)記Xa7-SM1電泳條帶的大小為1053bp(圖1)，其序列為SEQ ID NO：1；以IR24的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，標(biāo)記Xa7-SM1電泳無相應(yīng)的條帶(圖1)。

為了證明本發(fā)明的正確性，發(fā)明人設(shè)置了如下驗(yàn)證試驗(yàn)：

實(shí)驗(yàn)1、

以水稻IRBB7作為對(duì)照，分別將事先已知含Xa7基因的水稻品種DV85、鎮(zhèn)恢084，與已知不含Xa7基因的感病水稻品種日本晴、9311、浙輻802、中花11、TP309，按照實(shí)施例1所述的方法進(jìn)行檢測(cè)，最終結(jié)果如下(圖2)：

已知含Xa7基因位點(diǎn)的水稻品種：鎮(zhèn)恢084、DV85，所得的電泳條帶均為1053bp。

而已知不含Xa7基因位點(diǎn)的水稻品種：日本晴、9311、浙輻802、中花11、TP309，電泳無相應(yīng)的條帶。

實(shí)施例2、

已知水稻品種成恢448不含Xa7基因(圖3)，對(duì)白葉枯病的抗性較差(圖4)。為了改良該水稻品種的抗病性，發(fā)明人以水稻品種成恢448為輪回親本，與鎮(zhèn)恢084雜交、回交。并利用本發(fā)明的標(biāo)記Xa7-SM1對(duì)回交后代植株進(jìn)行了逐代檢測(cè)，選出擴(kuò)增出1053bp條帶的單株，即含有Xa7基因的植株，成功將Xa7基因轉(zhuǎn)育到了成恢448中(圖3)。通過水稻白葉枯病菌的抗性鑒定，也表明轉(zhuǎn)育了Xa7基因的成恢448顯著性增強(qiáng)了抗病性(圖4)。

對(duì)比例1、

將實(shí)施例1中的引物改成如下序列：

正向引物5’GATGGCTCTGATGATGCGCTCTTACTCCCA 3’，

反向引物5’CCACTGCTAGAGACGGGGGACAAATTTTG 3’。

對(duì)比例2、

將實(shí)施例1中的引物改成如下序列：

正向引物5’GATGGCTCTGATGATGCCGTCTGTTGACAT 3’，

反向引物5’CCACTGCTAGAGACGGGCCACTCCAAACA 3’。

利用上述2個(gè)對(duì)比例所得引物如同實(shí)驗(yàn)1所述進(jìn)行試驗(yàn)，所得結(jié)果為：

對(duì)比例1：IRBB7、DV85和鎮(zhèn)恢084電泳均無1053bp條帶出現(xiàn)；因此，無法對(duì)Xa7基因進(jìn)行有效鑒定。

對(duì)比例2：IRBB7、DV85和鎮(zhèn)恢084電泳均無1053bp條帶出現(xiàn)；因此，無法對(duì)Xa7基因進(jìn)行有效鑒定。

最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。

<110> 浙江師范大學(xué)

<120> 水稻Xa7基因高精度分子標(biāo)記及其育種應(yīng)用

<160> 1

<210> 1

<211> 1053

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa）

<400> 1

gatggctctg atgatgcgct ctgacttgat cgtcatcaac ttcagggtgt ggaacatgag 60

ggaaatggcg gtgataaagg ctgtgaatgc aaagaaggct gcgaatttca gtccatgtgg 120

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