本發(fā)明涉及一種檢測(cè)方法，具體是一種霍亂弧菌的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
霍亂弧菌是人類霍亂的病原體，霍亂是一種古老且流行廣泛的烈性傳染病之一。曾在世界上引起多次大流行，主要表現(xiàn)為劇烈的嘔吐，腹瀉，失水，死亡率甚高。屬于國(guó)際檢疫傳染病。由于霍亂流行迅速，且在流行期間發(fā)病率及死亡率均高，危害極大，因此早期迅速和正確的診斷，對(duì)治療和預(yù)防本病的蔓延有重大意義。目前霍亂弧菌的檢測(cè)方法主要有以下幾種。直接鏡檢:采取病人“米浴水樣”大便或嘔吐物。鏡檢(涂片染色及懸滴法檢查)觀察細(xì)菌形態(tài)，動(dòng)力特征。此種方法的準(zhǔn)確性不高；細(xì)菌分離培養(yǎng)：可將材料接種至堿性蛋白胨水37℃培養(yǎng)6一8小時(shí)后，取生長(zhǎng)物作形態(tài)觀察，并轉(zhuǎn)種于堿性平板作分離培養(yǎng)，取可疑菌落作玻片凝集，陽(yáng)性者再作生化反應(yīng)及生物型別鑒定試驗(yàn)。此種方法檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng);特異性制動(dòng)試驗(yàn):取檢材或新鮮堿性蛋白胨水培養(yǎng)物一滴，置于載玻片上，再加霍亂弧菌多價(jià)診斷血清，加蓋玻片，用暗視野鏡觀察，3分鐘內(nèi)運(yùn)動(dòng)被抑制的即為陽(yáng)性。此種方法必須有數(shù)量較多的弧菌才檢出。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種霍亂弧菌的檢測(cè)方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問題。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
一種霍亂弧菌的檢測(cè)方法，包含以下步驟：
（a）取樣過程：去一定量的待檢測(cè)物放置于可以加熱的容器中，作為待檢測(cè)物，
（b）對(duì)待檢測(cè)物進(jìn)行第一次增菌操作，其操作步驟為：在無菌條件下，取充分剪碎的樣品，加入盛有9倍量的3%的NaCl堿性蛋白胨水的滅菌容器內(nèi)，在36℃士2℃條件下培養(yǎng)4h-15h；
（c）對(duì)待檢測(cè)物進(jìn)行第二次增菌，其操作步驟為:吸取一定量第一次增菌的增菌液加入盛有9倍量的3%NaCl堿性蛋白胨水的滅菌試管內(nèi)，在36℃士2℃條件下培養(yǎng)4h-15h；
（d）采用水煮法提取弧菌基因組DNA；
（e）經(jīng)PCR反應(yīng)后，再經(jīng)電泳、染色、漂洗，接著用凝膠成像儀觀察結(jié)果并拍照；
（f）經(jīng)過譜圖分析得出檢測(cè)結(jié)果。
作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述的水煮法提取弧菌基因組DNA，其操作步驟為:取培養(yǎng)的菌液加入離心管中，以13000rpm離心3min，棄上清液，然后加入1m1無菌去離子水懸浮沉淀，振蕩混勻后，96-100衛(wèi).水浴8min， 12000rpm離心3min，取上清液作為DNA模板，-20℃環(huán)境下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>
作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述的PCR反應(yīng)為先做三重PCR反應(yīng)，檢出霍亂弧菌后再做V. c二重PCR反應(yīng)。
作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性3min；然后94℃變性1min,，60℃退火lmin，72℃復(fù)性lmin循環(huán)35次，最后72℃延伸7min。
作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述的電泳為瓊脂糖凝膠電泳，其操作步驟為:PCR反應(yīng)結(jié)束后以98V電壓2.5%凝膠電泳90min。
作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述的染色為在溟化乙錠溶液中染色20min。
作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述的譜圖分析包括陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，對(duì)于譜圖中是否有相應(yīng)特征位置條帶的出現(xiàn)，即可判別被檢測(cè)對(duì)象中是否有霍亂弧菌、副溶血弧菌和擬態(tài)弧菌的存在。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明霍亂弧菌的檢測(cè)方法可同時(shí)檢測(cè)以上三種致病性弧菌，在不影響檢出率的條件下加快檢測(cè)速度，減少工作量和檢測(cè)成本。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本專利的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。
一種霍亂弧菌的檢測(cè)方法，包含以下步驟：
（a）取樣過程：去一定量的待檢測(cè)物放置于可以加熱的容器中，作為待檢測(cè)物，
（b）對(duì)待檢測(cè)物進(jìn)行第一次增菌操作，其操作步驟為：在無菌條件下，取充分剪碎的樣品，加入盛有9倍量的3%的NaCl堿性蛋白胨水的滅菌容器內(nèi)，在36℃士2℃條件下培養(yǎng)4h-15h；
（c）對(duì)待檢測(cè)物進(jìn)行第二次增菌，其操作步驟為：吸取一定量第一次增菌的增菌液加入盛有9倍量的3%NaCl堿性蛋白胨水的滅菌試管內(nèi)，在36℃士2℃條件下培養(yǎng)4h-15h；
（d）采用水煮法提取弧菌基因組DNA；
（e）經(jīng)PCR反應(yīng)后，再經(jīng)電泳、染色、漂洗，接著用凝膠成像儀觀察結(jié)果并拍照；
（f）經(jīng)過譜圖分析得出檢測(cè)結(jié)果。
水煮法提取弧菌基因組DNA，其操作步驟為:取培養(yǎng)的菌液加入離心管中，以13000rpm離心3min，棄上清液，然后加入1m1無菌去離子水懸浮沉淀，振蕩混勻后，96-100衛(wèi).水浴8min，12000rpm離心3min，取上清液作為DNA模板，-20℃環(huán)境下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>
PCR反應(yīng)為先做三重PCR反應(yīng)，檢出霍亂弧菌后再做V. c二重PCR反應(yīng)。
PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性3min；然后94℃變性1min，60℃退火lmin，72℃復(fù)性lmin循環(huán)35次，最后72℃延伸7min。
電泳為瓊脂糖凝膠電泳，其操作步驟為：PCR反應(yīng)結(jié)束后以98V電壓2.5%凝膠電泳90min。
染色為在溟化乙錠溶液中染色20min。
譜圖分析包括陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，對(duì)于譜圖中是否有相應(yīng)特征位置條帶的出現(xiàn)，即可判別被檢測(cè)對(duì)象中是否有霍亂弧菌、副溶血弧菌和擬態(tài)弧菌的存在。
本發(fā)明的工作原理是：實(shí)施例1：
肉雞的檢測(cè)：1.無菌操作，取50g雞肉樣品，充分粉碎，加入盛有500m1 3%NaCl堿性蛋白胨水(APW)的滅菌容器內(nèi)，36℃士2℃條件下培養(yǎng)4h-15h。
2.吸取l ml增菌液加入盛有9m1 3%NaCl堿性蛋白胨水(APW)的滅菌試管內(nèi)，36℃士2℃條件下培養(yǎng)4h-15h。
3.移液槍吸取1.5m1培養(yǎng)的菌液，加入1.5m1離心管中13000rpm離心l min，棄上清。
4.加入0. 6m1無菌去離子水懸浮沉淀，振蕩混勻，100℃水浴l0min。
5. 12000rpm離心5min，取上清作為DNA模板，-20℃?zhèn)溆谩?/p>
6.加樣，做PCR。
7.取10u1PCR反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。
8.EB染色20min，漂洗，拍照。
9.分析譜圖。
實(shí)施例2：
牡蠣檢測(cè)：1.無菌操作，取25g文蛤樣品，充分剪碎，加入盛有225m1的3%NaCl堿性蛋白胨水(APW)的滅菌容器內(nèi)，37℃士1℃條件下培養(yǎng)4h-15h。
2，吸取lml增菌液加入盛有9m1 3%NaCl堿性蛋白胨水((APW)的滅菌試管內(nèi)，37 士1℃條件下培養(yǎng)4h-15h。
3.移液槍吸取1.5 m1培養(yǎng)的菌液，加入1.5 m1離心管中13000rpm離心lmin，棄上清。
4.加入0.6m1無菌去離子水懸浮沉淀，振蕩混勻，100℃水浴 l0min。
5. 12000rpm離心5min，取上清作為DNA模板，-20℃?zhèn)溆谩?/p>
6.加樣，做PCR。
7.取10ul PCR反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。
8.EB染色20min，漂洗，拍照。
9.分析譜圖。
對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點(diǎn)來看，均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。
此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實(shí)施方式加以描述，但并非每個(gè)實(shí)施方式僅包含一個(gè)獨(dú)立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說明書作為一個(gè)整體，各實(shí)施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實(shí)施方式。