本發(fā)明涉及一種sv82多肽及含有其作為有效成分的用于改善皮膚皺紋及保持皮膚彈性的化妝品組合物。
背景技術(shù)：
：作為巴西流浪蜘蛛(phoneutrianigriventer)的蜘蛛毒中的一種的pntx2-6是由403個核苷酸組成，這些403個核苷酸是由多數(shù)的谷氨酸(glutamate)和信號肽(signalpeptide)構(gòu)成。已知為pntx2-6會影響鈉離子通道(sodiumchannel)流通，并且會誘導(dǎo)經(jīng)過麻醉的老鼠的勃起。已知為巴西流浪蜘蛛的蜘蛛毒為3,500～9,000da大小的多肽且有100種以上，并且該蜘蛛毒在河豚毒素敏感型通道(ttx(tetrodotoxin)－sensitiveway)中誘導(dǎo)乙酰膽堿(acetylcholine)和谷氨酸的分泌，并增加外皮突觸體(corticalsynaptosomes)內(nèi)的鈉離子的流入，從而妨礙鈉通道的失活。由此會引起持續(xù)勃起癥(priapism)現(xiàn)象。誘導(dǎo)持續(xù)勃起癥現(xiàn)象的巴西流浪蜘蛛的蜘蛛毒中的一種的pntx2-6作為2010年以后全世界性的能夠取代偉哥的天然蛋白質(zhì)，正在持續(xù)地對其進(jìn)行研究。但是目前為止，正確的pntx2-6的細(xì)胞內(nèi)作用機理還不得而知，并且涉及作為取代偉哥的天然蛋白質(zhì)而使用的大量生產(chǎn)的研究也很少。巴西流浪蜘蛛的pntx2-6是由82個氨基酸組成且由10個半胱氨酸組成的約為9kda的多肽。自從已知pntx2-6多肽為通過鈉離子通道來誘導(dǎo)持續(xù)勃起癥的物質(zhì)，本發(fā)明人欲將蜘蛛毒sv82(蜘蛛毒82(spidervenom82))多肽利用為目前為止沒有適用過的美容整形及化妝品組合物。然而，能夠從巴西流浪蜘蛛提取天然pntx2-6多肽的方法目前為止還不得而知，并且提取蜘蛛毒sv82多肽的方法也不得而知。因此，必然需要一種利用基因工程技術(shù)的蜘蛛毒sv82多肽的生產(chǎn)。如上所述，就pntx2-6多肽而言，由于10個半胱氨酸互相形成半胱氨酸結(jié)(cysteineknot)，因此，化學(xué)合成方法及利用酵母的細(xì)胞外分離方法及用于獲得保持固有三維結(jié)構(gòu)的肽的融合伴侶蛋白質(zhì)的使用在大量生產(chǎn)方面都會受到限制。因此，為了解決利用大腸桿菌的細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)及培養(yǎng)大腸桿菌時需要考慮的內(nèi)毒素(endotoxin)問題，本發(fā)明人欲利用包涵體(inclusionbodies)來解決蜘蛛毒sv82多肽的大量生產(chǎn)及內(nèi)毒素問題。另外，歐洲授權(quán)專利第0374940號公開了一種“從hololenacurta種蜘蛛毒中分離的多肽”，并且韓國公開專利第2013-0102698號公開了一種“金環(huán)胡蜂毒提取方法及利用其的功能性化妝品組合物”，但是沒有記載關(guān)于本發(fā)明的sv82多肽及含有其作為有效成分的用于改善皮膚皺紋及保持皮膚彈性的化妝品組合物。技術(shù)實現(xiàn)要素：要解決的技術(shù)問題本發(fā)明是基于如上所述的要求而進(jìn)行的，本發(fā)明人使來源于pntx2-6基因的sv82基因經(jīng)由大腸桿菌密碼子優(yōu)化，并利用所述優(yōu)化的sv82基因制備重組載體，并且用該重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，從而生產(chǎn)sv82多肽。另外，使用所述生產(chǎn)的sv82多肽作為有效成分制備多種化妝品(化妝水、精華液、乳液及霜)劑型后，進(jìn)行皮膚測試并確認(rèn)測試對象的皮膚皺紋改善及皮膚彈性保持效果，從而完成了本發(fā)明。技術(shù)方案為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種由seqidno:2的氨基酸序列組成的sv82(蜘蛛毒82)多肽。此外，本發(fā)明提供一種由大腸桿菌密碼子優(yōu)化的seqidno:1的堿基序列組成的sv82多肽編碼基因。此外，本發(fā)明提供一種包含所述基因的重組載體。此外，本發(fā)明提供一種用所述重組載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌。此外，本發(fā)明提供一種在宿主細(xì)胞中生產(chǎn)sv82多肽的方法，所述方法用所述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。此外，本發(fā)明提供一種用于改善皮膚皺紋及保持皮膚彈性的化妝品組合物，所述化妝品組合物包含由seqidno:2的氨基酸序列組成的sv82多肽作為有效成分。發(fā)明效果本發(fā)明的在大腸桿菌中利用大腸桿菌密碼子優(yōu)化的sv82多肽編碼基因的生產(chǎn)方法可以實現(xiàn)sv82多肽的大量生產(chǎn)，并且就含有sv82多肽作為有效成分的用于改善皮膚皺紋及保持皮膚彈性的化妝品組合物而言，將少量該組合物涂布于皮膚，通過刺激皮膚內(nèi)的末梢神經(jīng)來誘導(dǎo)細(xì)胞的持續(xù)勃起，從而具有能夠提高皮膚皺紋改善及皮膚彈性保持效果的效果，因此，日后可以有效地使用于功能性化妝品領(lǐng)域或美容整形領(lǐng)域。附圖說明圖1為涉及包含本發(fā)明中使用的蜘蛛毒sv82多肽基因的重組質(zhì)粒(pet22b::sv82)的制備過程及用該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌的模式圖。圖2為通過sds-page凝膠電泳確認(rèn)大腸桿菌中的sv82多肽的表達(dá)的結(jié)果。a為1l分批培養(yǎng)的結(jié)果，b為20l連續(xù)培養(yǎng)的結(jié)果。m為尺寸標(biāo)注；bi為誘導(dǎo)(induction)表達(dá)前的細(xì)胞粗裂解物(crudelysate)；ai為誘導(dǎo)表達(dá)后的細(xì)胞粗裂解物；s為誘導(dǎo)表達(dá)后的總水溶性蛋白質(zhì)；ib為誘導(dǎo)表達(dá)后的總不溶性(包涵體，inclusionbody)蛋白質(zhì)；箭頭為預(yù)期的sv82多肽。圖3為本發(fā)明的用于分離精制sv82多肽的模式圖。圖4為經(jīng)過分離精制的sv82多肽的電泳結(jié)果。a為確認(rèn)重折疊過程及緩沖液交換過程期間的sv82多肽的分離程度的結(jié)果，b為通過鎳-瓊脂糖柱來分離的最終sv82多肽的電泳結(jié)果。m為尺寸標(biāo)注；1為經(jīng)過增溶的sv82多肽的ib試樣；2為過濾后的試樣；3為濃縮的試樣；4為重折疊試樣(滲余物，retentate)；5為重折疊試樣(滲透物，permeate)；6為緩沖液交換試樣(滲余物)；7為緩沖液交換試樣(滲透物)；8及bs為最終試樣；up為沒有結(jié)合的蛋白質(zhì)；w為洗滌試樣；e為柱洗脫試樣。圖5為確認(rèn)sv82多肽對人真皮成纖維細(xì)胞(hdfa，humandermalfibroblastadult)的細(xì)胞增殖效果的結(jié)晶紫染色結(jié)果。具體實施方式為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供一種由seqidno:2的氨基酸序列組成的sv82(蜘蛛毒82)多肽。本發(fā)明的sv82多肽的范圍包含具有seqidno:2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)及所述蛋白質(zhì)的功能性等同物。“功能性等同物”表示氨基酸的附加、取代或缺失的結(jié)果，與所述seqidno:2的氨基酸序列至少具有70％以上、優(yōu)選為80％以上、更優(yōu)選為90％以上、進(jìn)一步優(yōu)選為95％以上的序列同源性，其表示與seqidno:2所示的蛋白質(zhì)顯示出實質(zhì)上同質(zhì)的活性的蛋白質(zhì)?！皩嵸|(zhì)上同質(zhì)的活性”表示皮膚皺紋改善及皮膚彈性保持活性。另外，本發(fā)明還包含sv82多肽的片段、衍生物及類似物(analogues)。本發(fā)明中使用的術(shù)語“片段”、“衍生物”及“類似物”表示與本發(fā)明的sv82多肽在實質(zhì)上具有相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。另外，本發(fā)明提供一種由大腸桿菌密碼子優(yōu)化的seqidno:1的堿基序列組成的sv82(蜘蛛毒82)多肽編碼基因。本發(fā)明的所述sv82多肽編碼基因可以包含seqidno:1的堿基序列。另外，所述堿基序列的同源體包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。具體地，所述基因可以包含與選自由seqidno:1的堿基序列組成的堿基序列分別具有70％以上、更優(yōu)選為80％以上、進(jìn)一步優(yōu)選為90％以上、最優(yōu)選為95％以上的序列同源性的堿基序列。對多核苷酸的“序列同源性的％”是通過對比兩個經(jīng)過優(yōu)化排列的序列和比較區(qū)來確認(rèn)，并且在比較區(qū)中的多核苷酸序列的一部分與對兩個序列的優(yōu)化排列的參考序列(不包含附加或刪除)相比，可以包含附加或刪除(即缺口)?！懊艽a子優(yōu)化”為在特定有機體中優(yōu)先使用，使得經(jīng)過編碼的蛋白質(zhì)能夠在有機體中更加有效地進(jìn)行表達(dá)，其表示變化編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸的密碼子。鑒于大多數(shù)的氨基酸是根據(jù)稱為“同義詞”或“同義”密碼子的幾個密碼子表示，雖然基因編碼是退化性的，但是根據(jù)特定有機體的密碼子用法不是隨機的，而是偏向于特定的三聯(lián)體密碼子。就這種密碼子用法的偏向性而言，與一些基因、共同的功能或起源于共同的祖先的基因、高表達(dá)蛋白質(zhì)對低復(fù)制數(shù)蛋白質(zhì)及有機體基因組的集合性蛋白質(zhì)編碼區(qū)相關(guān)時，這種密碼子用法的偏性可能會更高。本發(fā)明的所述seqidno:1的堿基序列為大腸桿菌密碼子優(yōu)化的序列，使得來源于蜘蛛的sv82基因能夠在大腸桿菌內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。另外，本發(fā)明提供一種包含所述sv82多肽編碼基因的重組載體及用所述重組載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌。術(shù)語“重組”表示細(xì)胞復(fù)制外源核酸，或者表達(dá)所述核酸的細(xì)胞，或者表達(dá)通過肽、外源肽或外源核酸編碼的蛋白質(zhì)的細(xì)胞。重組細(xì)胞可以將所述細(xì)胞的在天然形態(tài)下不能被發(fā)現(xiàn)的基因或基因片段以正義或反義形態(tài)中的一種來表達(dá)。另外，重組細(xì)胞能夠表達(dá)在天然狀態(tài)的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的基因，但是所述基因是經(jīng)過修飾的，是通過人工方法重新引入細(xì)胞內(nèi)的。在本發(fā)明中，編碼所述sv82多肽的基因可以插入到重組表達(dá)載體內(nèi)。術(shù)語“重組表達(dá)載體”表示細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動物細(xì)胞病毒或其它載體。大體上，任意的質(zhì)粒及載體只要是能夠在宿主內(nèi)復(fù)制及穩(wěn)定化的，則可以使用。所述表達(dá)載體的重要特征為具有復(fù)制起點、啟動子、標(biāo)記基因及翻譯控制因素(translationcontrolelement)。可以通過本領(lǐng)域內(nèi)公知的方法來構(gòu)建編碼sv82多肽的基因序列及包含適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達(dá)載體。所述方法包括試管內(nèi)重組dna技術(shù)、dna合成技術(shù)及體內(nèi)重組技術(shù)等。所述dna序列為了引導(dǎo)mrna合成，可以有效地連接在表達(dá)載體內(nèi)的適當(dāng)?shù)膯幼由?。另外，表達(dá)載體作為翻譯起始部位，可以包含核糖體結(jié)合部位及轉(zhuǎn)錄終止子。本發(fā)明一實施方案的重組載體，其特征為，所述重組載體是通過將合成的編碼蜘蛛毒sv82多肽的基因(seqidno:1)，在框架內(nèi)(inframe)融合至pet22b載體的5'末端(ncoi限制酶位點)和3'末端(xhoi限制酶位點)來制成，并且通過lac啟動子(lacpromoter)和laci阻遏物(lacirepressor)有效地表達(dá)所述基因，從而制備蜘蛛毒sv82多肽。就本發(fā)明的在原核細(xì)胞中能夠使載體穩(wěn)定并連續(xù)地克隆及表達(dá)的宿主細(xì)胞而言，可以利用本領(lǐng)域公知的任意的宿主細(xì)胞，例如有大腸桿菌rosetta(e.colirosetta)、大腸桿菌jm109(e.colijm109)、大腸桿菌bl21(e.colibl21)、大腸桿菌rr1(e.colirr1)、大腸桿菌le392(e.colile392)、大腸桿菌b(e.colib)、大腸桿菌x1776(e.colix1776)、大腸桿菌w3110(e.coliw3110)、枯草芽抱桿菌、蘇云金芽孢桿菌等芽孢桿菌屬菌株，還有諸如鼠傷寒沙門氏菌、粘質(zhì)沙雷氏菌及多種假單胞菌種等腸道細(xì)菌和菌株等。另外，將本發(fā)明的載體用于轉(zhuǎn)化真核細(xì)胞的情況下，作為宿主細(xì)胞可以利用酵母(saccharomycecerevisiae)、昆蟲細(xì)胞、人體細(xì)胞(例如，cho細(xì)胞株(chinesehamsterovary，中國倉鼠卵巢)、w138、bhk(幼倉鼠腎)、cos-7、293、hepg2、3t3、rin及mdck細(xì)胞株)及植物細(xì)胞等。本發(fā)明一實施方案的用重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可以為大腸桿菌rosetta2(de3)plyss，但并不限定于此。就本發(fā)明的將載體搬運至宿主細(xì)胞內(nèi)的方法而言，當(dāng)宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞的情況下，可以通過cacl2方法、hanahan方法(hanahan，d.，1983分子生物學(xué)雜志(j.mol.biol.)166，557-580)及電穿孔方法等來進(jìn)行。另外，當(dāng)宿主細(xì)胞為真核細(xì)胞的情況下，可以通過顯微注射法、磷酸鈣沉淀法、電穿孔法、脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法、deae-葡聚糖處理法及基因轟擊等，將載體引入宿主細(xì)胞內(nèi)。另外，本發(fā)明提供一種用本發(fā)明的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在宿主細(xì)胞中生產(chǎn)sv82多肽的方法。本發(fā)明一實施方案的方法中，所述宿主細(xì)胞可以優(yōu)選為大腸桿菌，更優(yōu)選為大腸桿菌rosetta2(de3)plyss，但并不限定于此。另外，本發(fā)明提供一種用于改善皮膚皺紋及保持皮膚彈性的化妝品組合物，所述化妝品組合物包含由seqidno:2的氨基酸序列組成的sv82多肽作為有效成分。本發(fā)明的所述化妝品組合物包含sv82多肽作為有效成分，并且所述sv82多肽通過刺激皮膚內(nèi)的末梢神經(jīng)來誘導(dǎo)細(xì)胞的持續(xù)勃起，從而能夠顯示出皮膚皺紋改善及皮膚彈性保持效果。本發(fā)明一實施方案的化妝品組合物中，相對于化妝品組合物總重量，優(yōu)選包含0.000001至0.0001重量％的所述sv82多肽。當(dāng)所述sv82多肽的含量少于0.000001重量％時，皮膚皺紋改善及皮膚彈性保持效果甚微，當(dāng)所述sv82多肽的含量為0.0001重量％以上時，會存在劑型上的安全及穩(wěn)定性方面的問題。本發(fā)明的化妝品組合物中，除了所述有效成分以外，還包含通常在化妝品組合物中利用的成分，例如包含脂肪物質(zhì)、有機溶劑、增溶劑、濃縮劑及膠凝劑、軟化劑、抗氧化劑、懸浮劑、穩(wěn)定劑、發(fā)泡劑(foamingagent)、芳香劑、表面活性劑、水、離子型或非離子型乳化劑、填充劑、掩蔽劑及螯合劑、保存劑、維生素、阻斷劑、濕潤劑、精油、染料、顏料、親水性或親油性活性劑、脂質(zhì)小囊等常規(guī)的輔助劑，而且還包含載體。本發(fā)明的組合物可以制成本領(lǐng)域中通常制備的任意劑型，例如可以以溶液、懸浮液、乳狀液、膏、凝膠、霜、乳液、粉末,油、粉狀粉底、乳狀液粉底、蠟狀粉底及噴霧劑等來進(jìn)行劑型化，但并不限定于此。更加詳細(xì)地，可以制成化妝水、柔膚水、爽膚水、收斂劑、乳液、牛奶乳液、保濕乳液、營養(yǎng)乳液、按摩霜、營養(yǎng)霜、眼霜、保濕霜、護(hù)手霜、精華液、營養(yǎng)精華液、面膜、潔面泡沫、潔膚水、潔膚乳、潔膚霜、潤膚露、身體潔膚露、香皂及粉末的化妝品劑型。當(dāng)本發(fā)明的化妝品組合物的劑型是膏、霜或凝膠時，可以將動物油、植物油、蠟、石蠟、淀粉、黃芪膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、硅膠、皂土、硅石、滑石或氧化鋅等用作載體成分。當(dāng)本發(fā)明的化妝品組合物的劑型是粉末或噴霧劑時，可以將乳糖、滑石、硅石、氫氧化鋁、硅酸鈣或聚酰胺粉用作載體成分，尤其，當(dāng)劑型是噴霧劑時，可以進(jìn)一步包含氯氟烴、丙烷/丁烷或二甲醚等推進(jìn)劑。當(dāng)本發(fā)明的化妝品組合物的劑型是溶液或乳狀液時，將溶劑、溶劑化劑或乳化劑用作載體成分，可列舉如水、乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1,3-丁基乙二醇油、甘油脂肪酯、聚乙二醇或脫水山梨糖醇的脂肪酸酯。當(dāng)本發(fā)明的化妝品組合物的劑型是懸浮液時，可以將水、乙醇或丙二醇等液態(tài)稀釋劑，乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯及聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯等懸浮劑，微晶纖維素、偏氫氧化鋁()、皂土、瓊脂或黃芪膠等用作載體成分。下面，通過實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明。但是下述實施例僅是例示本發(fā)明，本發(fā)明的內(nèi)容并不限定于下述實施例。實施例1：用于生產(chǎn)蜘蛛毒sv82多肽的用于表達(dá)大腸桿菌的重組表達(dá)載體及轉(zhuǎn)化的重組微生物的制備用下述方法制備編碼蜘蛛毒sv82多肽的大腸桿菌優(yōu)化的基因、重組表達(dá)載體及轉(zhuǎn)化的重組微生物。使用編碼蜘蛛毒sv82多肽的基因為模板，制備及合成能夠在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)而被優(yōu)化的、編碼79個氨基酸的、編碼蜘蛛毒sv82多肽的基因(seqidno:1)片段。合成中使用的引物如下所示。正向引物：5'-cagccatgcaaagaaacgtg-3'(下劃線，ncoⅰ限制酶的位置；seqidno:3)反向引物：5'-ggtgctcgagtttcttgcag-3'(下劃線，xhoⅰ限制酶的位置；seqidno:4)用相同的限制酶(5'末端ncoi及3'末端xhoi)切割并插入所述基因片段和重組質(zhì)粒，從而制備重組質(zhì)粒(pet22b::sv82)(圖1)。用制備的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10(e.colitop10)，從而從宿主微生物中得到了大量的基因構(gòu)建體。之后，用制備的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌rosetta2(de3)plyss(novagen，德國)，從而制備了用于生產(chǎn)蜘蛛毒sv82多肽的重組微生物。實施例2：蜘蛛毒sv82多肽的大量生產(chǎn)及分離當(dāng)使用1l的lb培養(yǎng)基(10％色氨酸、10％氯化鈉及5％酵母提取物)或bsb培養(yǎng)基(1％色氨酸、0.5％酵母提取物、1％葡萄糖及0.1％hepes(ph7.0)，納絲真生命工學(xué)株式會社)，對實施例1中制備的大腸桿菌rosetta2(de3)plyss分別進(jìn)行分批(batch)培養(yǎng)時，培養(yǎng)到od600＝0.6～0.8，當(dāng)使用20l發(fā)酵罐進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)時，培養(yǎng)到od600＝20～25。之后，在其中分別添加1～5mm的異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)或2～3％乳糖，從而誘導(dǎo)克隆內(nèi)基因的表達(dá)。誘導(dǎo)基因的表達(dá)后，進(jìn)一步培養(yǎng)大腸桿菌3～4小時，然后，通過離心分離回收細(xì)胞。將這些細(xì)胞完全懸浮在緩沖溶液(磷酸鹽緩沖鹽水、8g氯化鈉、0.2g氯化鉀、1.44g磷酸氫二鈉(na2hpo4)、0.24g磷酸二氫鉀(kh2po4)/l、ph7.4)中后，使用超聲波粉碎機粉碎細(xì)胞，并分離出細(xì)胞內(nèi)包含蛋白質(zhì)的溶液。通過15％的sds-page電泳來確認(rèn)根據(jù)誘導(dǎo)表達(dá)的sv82多肽的表達(dá)程度。其結(jié)果，在1l分批培養(yǎng)(圖2a)或20l連續(xù)培養(yǎng)(圖2b)中，均可以確認(rèn)很多蜘蛛毒sv82多肽以包涵體(inclusionbody)形態(tài)表達(dá)。為了精制通過所述培養(yǎng)表達(dá)的sv82多肽，用增溶化緩沖溶液(5m尿素(urea)，ph為11)增溶含有sv82多肽的包涵體之后，利用超細(xì)過濾方法(0.45μm微濾膜和1k超細(xì)濾膜)實施重折疊(refolding)過程，并使用用于儲存的緩沖溶液(磷酸鹽緩沖液，pbs)，最終分離、精制蜘蛛毒sv82多肽。之后，將經(jīng)過分離精制的sv82多肽以3～5ml/分鐘的速度通過鎳-瓊脂糖柱。接著，使用結(jié)合用緩沖溶液多次洗滌柱后，將50、80及300mm的咪唑溶液(ph為7.4)適用于柱，并在柱中，每次將sv82多肽以20ml的量通過柱進(jìn)行分級洗脫后，使用10mm的磷酸鉀(potassiumphosphate)緩沖液去除緩沖液中的咪唑，最終分離及精制sv82多肽。圖3為示出精制蜘蛛毒sv82多肽的過程的模式圖。在分離蜘蛛毒sv82多肽的過程中，為了確認(rèn)蛋白質(zhì)的分離程度，進(jìn)行15％的sds-page電泳。其結(jié)果，可以確認(rèn)最終通過鎳-瓊脂糖柱，使蜘蛛毒sv82多肽(seqidno:2)得到精制。實施例3：蜘蛛毒sv82多肽的活性測定為了測定在實施例2中經(jīng)過分離、精制的蜘蛛毒sv82多肽的活性，分別用0、0.02ppm、0.2ppm濃度的sv82多肽處理所培養(yǎng)的人真皮成纖維細(xì)胞(humandermalfibroblastsadult，hdfacell)后，在37℃下培養(yǎng)3天。之后，用結(jié)晶紫染色法對細(xì)胞進(jìn)行染色，并確認(rèn)細(xì)胞增殖情況。結(jié)果如圖5所示，可以確認(rèn)，與對照組相比，隨著蜘蛛毒sv82多肽的處理濃度(0.02～0.2ppm)的增加，人真皮成纖維細(xì)胞的細(xì)胞增殖程度也會高。實驗例1：涉及皮膚皺紋改善及皮膚彈性保持效果的皮膚刺激感官試驗以所述經(jīng)過分離、精制的蜘蛛毒sv82多肽作為有效成分，制備了制備例1、2、3及4與比較例1、2、3及4的化妝品組合物，并進(jìn)行了感官試驗。具體地，為了確認(rèn)皺紋改善及彈性的情況，以30歲以上且小于60歲的女性和男性總計30名(30歲年齡段10名、40歲年齡段10名、50～60歲年齡段10名)為對象，在皺紋較多的臉部左眼角部位或左嘴唇周圍使用比較例(對照組)，在皺紋較多的臉部右眼角部位或右嘴唇周圍使用制備例(試驗組)，均1天使用1次并連續(xù)使用2周。以眼睛或嘴唇周圍部分的皺紋改善現(xiàn)象為基準(zhǔn)進(jìn)行評價。另外，對于所述功能項目中的一種的皮膚彈性保持效果也通過相同的方法來評價了皮膚彈性保持天數(shù)。對于皮膚刺激項目也通過相同的方法對皮膚的瘙癢、刺激及發(fā)紅等現(xiàn)象進(jìn)行了感官試驗。評價基準(zhǔn)是根據(jù)5分制評分進(jìn)行的，即非常優(yōu)異(5分)、優(yōu)異(4分)、普通(3分)、差(2分)及非常差(1分)。<制備例1及比較例1>添加蜘蛛毒sv82多肽作為有效成分，并以下述表1中記載的成分和含量制備了制備例1的化妝水。另外，沒有以添加蜘蛛毒sv82多肽作為有效成分，并以下述表1中記載的成分和含量制備了比較例1的化妝水。表1化妝水組合物成分制備例1(重量％)比較例1(重量％)蜘蛛毒sv82多肽0.00002-氨基酸原料0.10.1礦物質(zhì)混合物0.00070.0007精制水余量余量涉及所述制備例1及比較例1的皮膚皺紋改善及皮膚彈性保持效果的皮膚刺激感官試驗結(jié)果如下述表2所示。表2制備例1的感官試驗結(jié)果<制備例2及比較例2>添加蜘蛛毒sv82多肽作為有效成分，并以下述表3中記載的成分和含量制備了制備例2的精華液。另外，沒有以添加蜘蛛毒sv82多肽作為有效成分，并以下述表3中記載的成分和含量制備了比較例2的精華液。表3精華液組合物成分制備例2(重量％)比較例2(重量％)蜘蛛毒sv82多肽0.00002-氨基酸原料0.050.05礦物質(zhì)混合物0.00070.0007甘油551,3-丁二醇1010卡波普9400.30.3精制水余量余量涉及所述制備例2及比較例2的皮膚皺紋改善及皮膚彈性保持效果的皮膚刺激感官試驗結(jié)果如下述表4所示。表4制備例2的感官試驗結(jié)果<制備例3及比較例3>添加蜘蛛毒sv82多肽作為有效成分，并以下述表5中記載的成分和含量制備了制備例3的乳液。另外，沒有以添加蜘蛛毒sv82多肽作為有效成分，并以下述表5中記載的成分和含量制備了比較例3的乳液。表5乳液組合物成分制備例3(重量％)比較例3(重量％)蜘蛛毒sv82多肽0.00002-氨基酸原料0.050.05礦物質(zhì)混合物0.00070.0007甘油331,3-丁二醇1010礦物油55鯨蠟醇22黃原膠0.50.5精制水余量余量涉及所述制備例3及比較例3的皮膚皺紋改善及皮膚彈性保持效果的皮膚刺激感官試驗結(jié)果如下述表6所示。表6制備例3的感官試驗結(jié)果<制備例4及比較例4>添加蜘蛛毒sv82多肽作為有效成分，并以下述表7中記載的成分和含量制備了制備例4的霜。另外，沒有以添加蜘蛛毒sv82多肽作為有效成分，并以下述表7中記載的成分和含量制備了比較例4的霜。表7霜組合物成分制備例4(重量％)比較例4(重量％)蜘蛛毒sv82多肽0.00002-氨基酸原料0.050.05礦物質(zhì)混合物0.00070.0007甘油22礦物油1010山梨坦橄欖油酸酯33鯨蠟醇22精制水余量余量涉及所述制備例4及比較例4的皮膚皺紋改善及皮膚彈性保持效果的皮膚刺激感官試驗結(jié)果如下述表8所示。表8制備例4的感官試驗結(jié)果通過上述感官試驗結(jié)果，可以確認(rèn)本發(fā)明的包含sv82多肽作為有效成分的制備例1、2、3及4與比較例相比，對皮膚皺紋改善及皮膚彈性保持方面具有效果。序列表<110>納絲真生命工學(xué)株式會社<120>sv82多肽及含有其作為有效成分的用于改善皮膚皺紋及保持皮膚彈性的化妝品組合物<130>khp16212798.6<160>4<170>kopatentin2.0<210>1<211>240<212>dna<213>人工序列<220><223>sv82<400>1atgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcg60atggccagggctacctgtgcagggcaggatcagccatgcaaagaaacgtgcgattgctgt120ggcgaacgtggcgaatgcgtgtgtggtggtccgtgcatttgtcgccaaggctatttctgg180attgcgtggtacaaactggcgaactgcaagaaactcgagcaccaccaccaccaccactga240<210>2<211>79<212>prt<213>人工序列<220><223>sv82<400>2metlystyrleuleuprothralaalaalaglyleuleuleuleuala151015alaglnproalametalaargalathrcysalaglyglnaspglnpro202530cyslysgluthrcysaspcyscysglygluargglyglucysvalcys354045glyglyprocysilecysargglnglytyrphetrpilealatrptyr505560lysleualaasncyslyslysleugluhishishishishishis657075<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>3cagccatgcaaagaaacgtg20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>引物<400>4ggtgctcgagtttcttgcag20當(dāng)前第1頁12