本發(fā)明涉及一種工程菌株以及針對(duì)該工程菌株的發(fā)酵工藝，具體涉及一種高效表達(dá)MicrocinJ25的工程菌株以及針對(duì)該工程菌株的MicrocinJ25發(fā)酵工藝，屬于基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
和發(fā)酵優(yōu)化
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：大腸桿菌容易產(chǎn)生耐藥性，由其引起的疾病給畜牧養(yǎng)殖造成了巨大損失，目前迫切需要解決這個(gè)問題。MicrocinJ25(MccJ25)是大腸桿菌素的縮寫，其表達(dá)菌是大腸桿菌。成熟的MccJ25是由21個(gè)氨基酸組成的套索肽，其中N端的第1個(gè)氨基酸至第8個(gè)氨基酸形成一個(gè)圓形環(huán)狀結(jié)構(gòu)，第9個(gè)氨基酸至第21個(gè)氨基酸形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，發(fā)夾結(jié)構(gòu)貫穿圓形環(huán)狀結(jié)構(gòu)，并通過非共價(jià)作用將這個(gè)尾部固定，理論上這個(gè)結(jié)構(gòu)的理化性質(zhì)非常穩(wěn)定，能抵御強(qiáng)烈的變性條件，對(duì)溫度、蛋白酶、酸堿等有良好的耐受性。通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，MccJ25能耐受121℃高溫高壓，模擬胃腸液處理后仍具有活性，可見MccJ25適合工業(yè)放大生產(chǎn)，并能到達(dá)動(dòng)物腸道后端發(fā)揮作用。此外，通過體外抑菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MccJ25能殺滅多種致病性大腸桿菌。綜上，MccJ25可作為飼料添加劑使用，并具有開發(fā)為新獸藥的潛力。MccJ25的表達(dá)菌是大腸桿菌，但是MccJ25野生基因簇的表達(dá)在實(shí)際應(yīng)用中受限，主要體現(xiàn)在以下幾方面：一、MccJ25野生基因簇的表達(dá)對(duì)有機(jī)氮源有較強(qiáng)的選擇性，而有機(jī)氮是發(fā)酵成本的主要占用者。二、MccJ25的表達(dá)受鐵離子影響較大，雖然可以通過加入螯合劑減輕鐵離子的影響，但工業(yè)生產(chǎn)的各個(gè)環(huán)節(jié)均可產(chǎn)生鐵離子，最終將導(dǎo)致加入的螯合劑超標(biāo)，抑制菌體生長，因此工業(yè)生產(chǎn)中除鐵不適用。三、現(xiàn)代追求高密度發(fā)酵，曲線的方式提高目標(biāo)產(chǎn)物表達(dá)量，MccJ25野生基因簇的表達(dá)不依賴于細(xì)胞密度，但強(qiáng)烈依賴菌體生長狀態(tài)，在平臺(tái)期后期大量表達(dá)，不適合高密度發(fā)酵。四、工業(yè)生產(chǎn)追求穩(wěn)定、高效和低成本，MccJ25野生基因簇的上述特點(diǎn)極易導(dǎo)致生產(chǎn)水平波動(dòng)，造成生產(chǎn)成本提高。綜上，有必要發(fā)展一套不依賴于氮源和生長狀態(tài)的表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)MccJ25。目前，大腸桿菌商業(yè)化表達(dá)系統(tǒng)主要涉及單基因、單載體誘導(dǎo)表達(dá)，不適合多基因、多載體協(xié)同表達(dá)。合成生物學(xué)是近年發(fā)展起來的針對(duì)多基因協(xié)同表達(dá)技術(shù)，它結(jié)合生物信息手段，利用標(biāo)準(zhǔn)的生物學(xué)原件，例如啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、終止子等，控制多基因的協(xié)同表達(dá)。中心法則已闡明，基因轉(zhuǎn)錄成mRNA，再翻譯成蛋白質(zhì)。這個(gè)過程受到各種調(diào)控，例如DNA甲基化、乙?；?、小RNA、啟動(dòng)子強(qiáng)度、RBS翻譯效率、酶的濃度和活性、分裂周期等。對(duì)于大腸桿菌而言，啟動(dòng)子、RBS、酶濃度和細(xì)菌生長狀態(tài)是影響目標(biāo)蛋白表達(dá)量的主要因素。本發(fā)明擬結(jié)合傳統(tǒng)生物技術(shù)和合成生物學(xué)的理論及提供的信息，利用大腸桿菌作為宿主菌，高效表達(dá)MccJ25。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種高效表達(dá)MccJ25的工程菌株。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種針對(duì)上述工程菌株的MccJ25發(fā)酵工藝。為了實(shí)現(xiàn)上述兩個(gè)目標(biāo)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：一種高效表達(dá)MicrocinJ25的工程菌株，其特征在于，通過下述方法構(gòu)建而成：分別將MicrocinJ25野生型基因簇的McjA、McjB+McjC+McjD基因構(gòu)建到2個(gè)質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC41OO，從而產(chǎn)生出一株高效表達(dá)MicrocinJ25的工程菌，該工程菌已于2016年08月23日保藏在了中國普通微生物菌種保藏中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏編號(hào)為CGMCCNo.12902，分類名稱為大腸埃希氏菌Escherichiacoli。一種利用前述的高效表達(dá)MicrocinJ25的工程菌株發(fā)酵生產(chǎn)MicrocinJ25的工藝，其特征在于，包括以下步驟：Step1：準(zhǔn)備種子罐，罐內(nèi)培養(yǎng)基的組成為10g/L蔗糖+45g/L酵母浸粉+3g/L磷酸氫二鉀+2g/L磷酸二氫鉀+0.5g/L硫酸鎂，初始pH≥6.2；Step2：將菌種接種于種子罐內(nèi)，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；Step3：準(zhǔn)備發(fā)酵罐，罐內(nèi)培養(yǎng)基的組成為10g/L蔗糖+50g/L酵母浸粉+3g/L磷酸氫二鉀+0.5g/L硫酸鎂，初始pH6.2-6.5；Step4：將種液接種于發(fā)酵罐內(nèi)，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。前述的工藝，其特征在于，在Step2中，培養(yǎng)的條件為：35℃-37℃，120rpm，通氣20m3/h。前述的工藝，其特征在于，在Step2中，培養(yǎng)的時(shí)間為：8-10h。前述的工藝，其特征在于，在Step2中，培養(yǎng)過程中適當(dāng)調(diào)整培養(yǎng)基的pH值，使pH≤7.0。前述的工藝，其特征在于，在Step4中，培養(yǎng)的條件為：35℃-37℃，80rpm，通氣200m3/h。前述的工藝，其特征在于，在Step4中，培養(yǎng)的時(shí)間為：17-19h。前述的工藝，其特征在于，在Step4中，培養(yǎng)過程中前12h控制培養(yǎng)基的pH≤7.0。本發(fā)明的有益之處在于：(1)本發(fā)明通過對(duì)MccJ25野生型基因簇進(jìn)行改造，使McjABCD基因位于不同質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC4100所構(gòu)建的工程菌株能夠高效表達(dá)MccJ25，實(shí)驗(yàn)室50L罐表達(dá)量達(dá)到600mg/L以上水平，工業(yè)生產(chǎn)30T罐表達(dá)量達(dá)到500mg/L水平。(2)發(fā)酵工藝：通過調(diào)整培養(yǎng)基碳氮源比例和發(fā)酵過程溶氧、pH等參數(shù)，獲得了最優(yōu)發(fā)酵效果，經(jīng)上述工藝工程菌株能夠高效表達(dá)MicrocinJ25，1T罐表達(dá)量達(dá)到600mg/L，30T罐表達(dá)量達(dá)到500mg/L，改善生產(chǎn)環(huán)境和設(shè)備后30T罐表達(dá)量達(dá)到600mg/L，現(xiàn)已是正常的生產(chǎn)水平。附圖說明圖1是DAB顯色結(jié)果圖；圖2是化學(xué)發(fā)光顯色結(jié)果圖；圖3是不同宿主菌中質(zhì)粒pACYCJ252的表達(dá)量圖；具體實(shí)施方式以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作具體的介紹。第一部分：構(gòu)建高效表達(dá)MicrocinJ25的工程菌株該工程菌株通過下述方法構(gòu)建而成：分別將MicrocinJ25野生型基因簇的McjA、McjB+McjC+McjD基因構(gòu)建到2個(gè)質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC41OO，從而產(chǎn)生出一株高效表達(dá)MicrocinJ25的工程菌。下面詳細(xì)介紹該工程菌株的構(gòu)建過程。一、全基因合成MicrocinJ25基因簇根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，參考NCBI基因庫中的序列JX077110(MicrocinJ25基因簇序列包含于此序列)，全基因合成MicrocinJ25基因簇。經(jīng)重新測序，所合成的MicrocinJ25基因簇的序列為SEQIDNO:1。結(jié)論：所合成的MicrocinJ25基因簇序列完全正確。將合成的MicrocinJ25基因構(gòu)建到常規(guī)載體中，看其是否表達(dá)；另外，將合成的MicrocinJ25基因作為后續(xù)研究的基因材料。二、構(gòu)建表達(dá)載體采用分子克隆常規(guī)方法，將McjA基因、McjB基因、McjC基因、McjD基因分別與GFP融合，通過WesternBlot測定各基因的表達(dá)強(qiáng)度。DAB顯色結(jié)果見圖1。DAB顯色法只檢測到了“A-GFP”融合蛋白表達(dá)，表明McjA基因的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于McjB基因、McjC基因和McjD基因?；瘜W(xué)發(fā)光顯色結(jié)果見圖2。根據(jù)GFP標(biāo)準(zhǔn)品的含量，估算出McjB基因、McjC基因和McjD基因的表達(dá)量分別為0.76mg/L、0.97mg/L、0.39mg/L。基于此，我們設(shè)計(jì)構(gòu)建BCD基因組成型表達(dá)載體和最優(yōu)RBS+A基因組成型表達(dá)載體兩種載體。1、構(gòu)建BCD基因組成型表達(dá)載體(1)引物引物編號(hào)引物序列840f5’-CTTCTGACTATAATAGTCAGGGTAATTGAGTGTAAAGGCATAA-3’840f15’-AGGGGATCCTCTTTTTGATGCAATCCGCTTTGCTTCTGACTATAATAGT-3’534r5’-TGACTGTTTTATTGTATTCACTAG-3’(2)啟動(dòng)子啟動(dòng)子來源于iGEM(InternationalGeneticallyEngineeredMachine)。通過比較相對(duì)活性，我們最終確定的最優(yōu)啟動(dòng)子為：aattctctttttgatgcaatccgctttgcttctgactataatagtcagggtaag(編號(hào)為BBa_M13110，相對(duì)活性達(dá)到0.91)。(3)構(gòu)建BCD基因組成型表達(dá)載體用編號(hào)為840f、840f1、534r的引物將啟動(dòng)子BBa_M13110同McjB基因、McjC基因、McjD基因拼接，BamHI/SpeI雙切后插入質(zhì)粒pACYCJ252相應(yīng)的酶切位點(diǎn)中，構(gòu)建BCD基因組成型表達(dá)載體，記為載體pDZ138。質(zhì)粒pACYCJ252的構(gòu)建方法如下：MicrocinJ25插入到pACYC177載體的BamHI和SphI酶切位點(diǎn)中，即得到pACYCJ252載體。2、構(gòu)建最優(yōu)RBS+A基因組成型表達(dá)載體(1)設(shè)計(jì)RBS根據(jù)網(wǎng)站(https://www.denovodna.com/software/)預(yù)測不同翻譯起始效率的RBS，由引物公司合成。以合成的RBS作為上游引物，下游引物為738r(5’-CTCGTCGACGCCATAGAAAGATATAGGT-3’)，反應(yīng)體系(50μL)為：反應(yīng)buffer10μL、2.5mMdNTPs4μL、上下游引物各1μL、phusionDNA聚合酶0.5μL、模板pACYCJ2521μL和無菌水32.5μL。反應(yīng)結(jié)束后切膠回收，BglII/SalI雙切后插入質(zhì)粒pDZ130(含有野生McjA基因的質(zhì)粒)相應(yīng)位點(diǎn)中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，挑取陽性克隆，測序驗(yàn)證序列，質(zhì)粒以pDZ13xx命名。將質(zhì)粒pDZ13xx同質(zhì)粒pACYCJ252共轉(zhuǎn)大腸桿菌DH5α菌株，氨芐青霉素和卡那霉素雙卡選擇，挑取單克隆提質(zhì)粒酶切鑒定，陽性克隆用于RBS篩選。陽性克隆劃線氨芐青霉素、卡那霉素雙抗平板，37℃過夜培養(yǎng)，第二天挑單克隆于10ml試管中，裝3mlLB，37℃、220rpm震蕩培養(yǎng)12h，1％接種于250ml三角瓶中，裝50mlLB，37℃、220rpm震蕩培養(yǎng)20-24h，取上清進(jìn)行HPLC測定。預(yù)測的RBS序列及其翻譯起始效率以及HPLC測定結(jié)果見下表：測定結(jié)果表明：質(zhì)粒pDZ1307表達(dá)量略高于質(zhì)粒pDZ130，但是菌體生長滯后，不利于發(fā)酵工作；質(zhì)粒pDZ1314、質(zhì)粒pDZ1335和質(zhì)粒pDZ1340菌體生長不良，主要表現(xiàn)為轉(zhuǎn)化難生長，轉(zhuǎn)化成功克隆OD值偏低，推測原因是它們的RBS結(jié)合能力較強(qiáng)，使包內(nèi)RBS水平不足，干擾了其他代謝基因的表達(dá)。綜合考慮，我們最終選擇質(zhì)粒pDZ130的RBS開展后續(xù)工作，最優(yōu)RBS的序列為：TTCCATCAAATAAGGAACGTAAAAAGATCTACGAGAAAAAATAGCCCGCATAAGGAGGTCCCCA(859f)。(2)啟動(dòng)子對(duì)來源于iGEM(InternationalGeneticallyEngineeredMachine)的40個(gè)啟動(dòng)子對(duì)數(shù)期活性與啟動(dòng)子J23101(gatccgctagcataatacctaggactgagctagctgtaaag)比較，得到相對(duì)啟動(dòng)子活性(RPU)強(qiáng)弱排序，詳見下表。在表中：由上到下，由左到右，RPU依次降低，其中高于啟動(dòng)子J23101的啟動(dòng)子有3個(gè)(啟動(dòng)子J8990、啟動(dòng)子J2930、啟動(dòng)子J8586)，其余均低于它。我們最終確定啟動(dòng)子J8990為最優(yōu)啟動(dòng)子，其序列為：Gatccgctagcattatacctaggactgagctagctgtcaag。(3)引物935f：5’-AGCGGATCCACAGAAGGACGTGAGGT-3’835r：5’-ATAGAGCTCTTAACCGTAGAAACTGA-3’(4)構(gòu)建最優(yōu)RBS+A基因組成型表達(dá)載體以質(zhì)粒pDZ130為模板擴(kuò)增最優(yōu)RBS+A基因，BamHI/SacI雙切后插入質(zhì)粒pDZ174中，啟動(dòng)子BBa_J8990插入質(zhì)粒pDZ174的EcoRI/BamHI位點(diǎn)，構(gòu)建最優(yōu)RBS+A基因組成型表達(dá)載體，記為載體pDZ177。3、驗(yàn)證表達(dá)載體PCR反應(yīng)體系：PCR反應(yīng)程序：98℃×1min，98℃×15s、55℃×20s、72℃×30s，重復(fù)30個(gè)循環(huán)，72℃×2min。電泳檢測，切膠回收連接載體。酶切反應(yīng)體系：連接反應(yīng)體系：連接反應(yīng)條件：22℃反應(yīng)1h，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株。挑取單克隆，提質(zhì)粒測序驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果顯示：BCD基因組成型表達(dá)載體和最優(yōu)RBS+A基因組成型表達(dá)載體均構(gòu)建成功。三、雙質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞1、篩選最佳宿主菌我們將單質(zhì)粒pACYCJ252分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α菌株、MG1655菌株、MC4100菌株、MC1061菌株、BL21菌株、JM109菌株、TOP10菌株和AB1133菌株中，相同條件下培養(yǎng)相同時(shí)間后，分別檢測不同宿主菌中質(zhì)粒pACYCJ252的表達(dá)量，檢測結(jié)果見圖3。所以，我們最終確定大腸桿菌MC4100菌株為最佳的宿主菌。2、雙質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC4100菌株將構(gòu)建成功的BCD基因組成型表達(dá)載體(即載體pDZ138)和最優(yōu)RBS+A基因組成型表達(dá)載體(即載體pDZ177)共轉(zhuǎn)到感受態(tài)細(xì)胞-大腸桿菌MC4100菌株中，具體的步驟為：(1)50ml宿主菌培養(yǎng)液(OD600≈0.2-0.3)倒入50ml離心管，冰浴10min；4℃，6000g離心8min；棄上清，加入50ml預(yù)冷無菌水，用5ml槍頭吹打均勻，4℃，6000g離心10min；棄上清，加入40ml預(yù)冷10％甘油，用5ml槍頭吹打均勻，4℃，6000g離心10min；加入30ml預(yù)冷10％甘油，用5ml槍頭吹打均勻，4℃，6000g離心10min；棄上清，加入500μl預(yù)冷10％甘油，吹打均勻，90μl每管進(jìn)行分裝；(2)根據(jù)質(zhì)粒濃度，將兩種質(zhì)粒(載體pDZ138和載體pDZ177)加入到感受態(tài)細(xì)胞中，1200v電壓進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化；(3)加入900ulLB培養(yǎng)基，37℃復(fù)蘇培養(yǎng)1h，4000rpm離心3min，涂抗性平板；(4)次日挑取單克隆到LB中培養(yǎng)，提質(zhì)粒，酶切鑒定。鑒定結(jié)論：雙質(zhì)粒成功電轉(zhuǎn)化到了大腸桿菌MC4100菌株中。3、用氨芐青霉素和卡那青霉素雙抗篩選BCD基因組成型表達(dá)載體(載體pDZ138)：氨芐青霉素抗性最優(yōu)RBS+A基因組成型表達(dá)載體(載體pDZ177)：卡那霉素抗性用氨芐青霉素和卡那霉素雙抗篩選菌株。4、HPLC檢測MccJ25表達(dá)量將鑒定正確菌株過夜活化，次日轉(zhuǎn)接到50ml培養(yǎng)基中，每種菌3個(gè)平行。37℃培養(yǎng)20-24h，各取1ml，12000rpm離心3min，取上清。用0.22um濾膜過濾上清，置于高效液相色譜儀進(jìn)樣瓶，檢測。檢測結(jié)果見見下表：載體pDZ171+載體pDZ138載體pDZ177+載體pDZ1381#2802652#2463843#218403平均2483516、小結(jié)將外源基因插入載體中進(jìn)行表達(dá)是現(xiàn)有技術(shù)，外源基因要有啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，終止子終止轉(zhuǎn)錄，核糖體結(jié)合位點(diǎn)啟示翻譯。在本發(fā)明中，我們將MicrocinJ25基因簇自身誘導(dǎo)型啟動(dòng)子替換為不受外界條件限制的組成型啟動(dòng)子，而且啟動(dòng)活性是在所篩選啟動(dòng)子中活性最高。同時(shí)，本發(fā)明也對(duì)McjA的RBS區(qū)進(jìn)行了優(yōu)化，提高了翻譯效率，進(jìn)而提高J25表達(dá)量。復(fù)制子不同質(zhì)粒共轉(zhuǎn)同一宿主菌是現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明中將McjA構(gòu)建到高拷貝質(zhì)粒中，其復(fù)制子為ColE1，McjB+McjC+McjD構(gòu)建到低拷貝質(zhì)粒中，其復(fù)制子為p15A。共轉(zhuǎn)方法有化學(xué)轉(zhuǎn)化和電擊轉(zhuǎn)化，為提高轉(zhuǎn)化效率，本發(fā)明采用電擊方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。本發(fā)明中所用到載體骨架均來自常規(guī)基因工程載體，根據(jù)實(shí)驗(yàn)中對(duì)拷貝數(shù)要求和載體抗性而進(jìn)行改造。本發(fā)明所用宿主可以為常用克隆和表達(dá)大腸桿菌宿主，通過共轉(zhuǎn)后檢測MicrocinJ25表達(dá)量，選擇最優(yōu)作為本發(fā)明宿主，即MC4100。2016年08月23日，我們將構(gòu)建成功的菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏編號(hào)為CGMCCNo.12902，分類名稱為大腸埃希氏菌Escherichiacoli。第二部分：工程菌株發(fā)酵條件的優(yōu)化一、實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)1：挑取菌株(保藏編號(hào)CGMCCNo.12902)單菌落于100ml三角瓶(裝有20mlLB)，37℃、220rpm培養(yǎng)12-16小時(shí)，1％接種于250ml三角瓶中(裝培養(yǎng)基50ml)于37℃、220rpm培養(yǎng)24小時(shí)，取適量培養(yǎng)液離心(12000rpm，5min)，取上清HPLC測定MccJ25表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)2：挑取菌株(保藏編號(hào)CGMCCNo.12902)單菌落于100ml三角瓶(裝有20mlLB)，37℃、220rpm培養(yǎng)12-16小時(shí)，1％接種于250ml三角瓶中(裝培養(yǎng)基50ml)于37℃、220rpm培養(yǎng)8-10小時(shí)，火焰接種法接入發(fā)酵罐中，在發(fā)酵過程中每隔一定時(shí)間取樣，離心(12000rpm，5min)，取上清HPLC測定MccJ25表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)3：挑取菌株(保藏編號(hào)CGMCCNo.12902)單菌落于100ml三角瓶(裝有20mlLB)，37℃、220rpm培養(yǎng)12-16小時(shí)，1％接種于250ml三角瓶中(裝培養(yǎng)基50ml)于37℃、220rpm培養(yǎng)8-10小時(shí)，火焰接種法接入1噸種子罐中，種子罐培養(yǎng)6-8h，移種入30噸發(fā)酵罐，在發(fā)酵過程中每隔一定時(shí)間取樣，離心(12000rpm，5min)，取上清HPLC測定MccJ25表達(dá)量。二、碳源篩選試驗(yàn)結(jié)果表明：(1)葡萄糖、果糖作碳源會(huì)使培養(yǎng)基迅速酸化，沒有表達(dá)量；(2)甘油作為培養(yǎng)大腸桿菌(特別是工程菌)常用碳源在本實(shí)驗(yàn)中不適用，沒有表達(dá)量；(3)蔗糖在比較中表現(xiàn)出優(yōu)勢。三、氮源篩選試驗(yàn)結(jié)果表明：有機(jī)氮源較無機(jī)氮源更有利于菌體生產(chǎn)，無機(jī)氮源培養(yǎng)菌體生長很差，酵母浸粉是最適合氮源。四、適合菌體生長碳氮比試驗(yàn)結(jié)果表明：隨著碳氮比的下降，生物量逐漸上升后下降，但是MccJ25的表達(dá)量逐漸上升，這表明生物量與MccJ25表達(dá)量之間存在非線性關(guān)系，MccJ25表達(dá)需要一定的生物量但是生物量與表達(dá)量之間存在相互影響關(guān)系，應(yīng)以MccJ25表達(dá)量作為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)。五、利于MccJ25表達(dá)碳氮比試驗(yàn)結(jié)果表明：適合的碳氮組合為10g/L蔗糖，40g/L酵母浸粉，搖瓶表達(dá)量可達(dá)235mg/L，以此為發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)表達(dá)MccJ25培養(yǎng)基。六、發(fā)酵罐培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果顯示：10L罐培養(yǎng)的適合培養(yǎng)條件為37℃，0.4m3/h通氣和250rpm。以此培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對(duì)通過基因改造后對(duì)鐵離子和酵母浸粉不敏感的雙質(zhì)粒工程菌(保藏編號(hào)CGMCCNo.12902)作進(jìn)一步的優(yōu)化試驗(yàn)。七、發(fā)酵罐培養(yǎng)過程控制pH培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)室放大試驗(yàn)室在10L罐和50L罐培養(yǎng)表達(dá)MccJ25表達(dá)量都在600mg/l以上，最高可達(dá)700mg/l以上，達(dá)到預(yù)定目標(biāo)，以此參數(shù)為依據(jù)，可以進(jìn)行中試生產(chǎn)。八、中試生產(chǎn)條件及結(jié)果經(jīng)驗(yàn)證，本發(fā)明所構(gòu)建的工程菌株能夠高效表達(dá)MicrocinJ25，1T罐表達(dá)量達(dá)到600mg/L，30T罐表達(dá)量達(dá)到500mg/L，改善生產(chǎn)環(huán)境和設(shè)備后30T罐表達(dá)量達(dá)到600mg/L以上將是正常的生產(chǎn)水平。九、總結(jié)最優(yōu)發(fā)酵條件種子培養(yǎng)基的組成為：10g/L蔗糖+45g/L酵母浸粉+3g/L磷酸氫二鉀+2g/L磷酸二氫鉀+0.5g/L硫酸鎂，初始pH≥6.2。種子培養(yǎng)的條件為：在35℃-37℃、120rpm、通氣20m3/h條件下培養(yǎng)8-10h，培養(yǎng)過程中適當(dāng)調(diào)整培養(yǎng)基的pH值，使pH≤7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：10g/l蔗糖+50g/l酵母浸粉+3g/l磷酸氫二鉀+0.5g/l硫酸鎂，初始pH6.2-6.5。發(fā)酵培養(yǎng)的條件為：在35℃-37℃、80rpm、通氣200m3/h條件下培養(yǎng)17-19h，培養(yǎng)過程中前12h控制培養(yǎng)基的pH≤7.0。綜上所述，本發(fā)明所構(gòu)建的工程菌株能夠高效表達(dá)MicrocinJ25，在實(shí)驗(yàn)室中30T罐表達(dá)量達(dá)到600mg/L以上，在工業(yè)生產(chǎn)中30T罐表達(dá)量達(dá)到500mg/L以上，改善生產(chǎn)環(huán)境和設(shè)備后30T罐表達(dá)量可以達(dá)到600mg/L，具有非常積極的推廣應(yīng)用價(jià)值。需要說明的是，上述實(shí)施例不以任何形式限制本發(fā)明，凡采用等同替換或等效變換的方式所獲得的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>****（申請(qǐng)人名稱）<120>一種高效表達(dá)MicrocinJ25的工程菌株及其發(fā)酵工藝<160>1<210>1<211>4440<212>DNA<213><220><221><222><400>1TCAGAATATCAGCCATAGAAAGATATAGGTGTACCAATCCCCACAAAATACTCAGGCACATGTCCTGCACCACCTTTTGTGAGTTGCGATGCTGATTTTT100TTATTTGTATAACCCCCTTTGCAGGAGATGGAACATTATTTTTTTTACCAGAAGACAGTTTATTAAAATGAAAATGCTTAATCATTTTTACGTTCCTTAT200TTGATGAAAATAGTATGATGATTTTTACAGAGGAACCTCACGTCCTTCTGTTAGAATTTTATTAGCACAAAATAAAATTGAGATCAATAATCATTACGCT300TTAGTAATTTATCAATAAAATTATTTAGATACAAACATCCATAAACTAATCAATCTGCAAAAGTGGTCAAATTTAGTACAATATTTTGGATTTTTATACA400TTTTTCTAATTATTTCAGAATATTTAGCCATCAATTAAGAAAAAAATTTAGCTTGTAGATAAATTCAGAAGTTTTATTATTCCAATTGAGTGTAAAGGCA500TAACTACAGGAGGGAGTGTGCAAAATGATCCGTTACTGCTTAACCAGTTATAGAGAGGATCTTGTTATCCTGGATATAATTAATGATAGTTTCAGCATAG600TGCCTGACGCAGGTAGCTTGCTAAAAGAAAGAGATAAATTGCTTAAAGAATTCCCACAACTATCTTACTTTTTTGACAGTGAATATCATATTGGAAGTGT700TTCTCGTAATAGTGACACTTCTTTTCTTGAAGAACGCTGGTTTCTACCAGAACCTGACAAAACATTATATAAGTGTTCTCTATTTAAACGATTTATATTA800TTACTCAAAGTCTTTTACTATAGCTGGAATATTGAAAAAAAAGGGATGGCATGGATTTTCATAAGTAATAAAAAAGAGAATAGGCTATACTCCTTGAATG900AAGAGCATCTTATCCGGAAAGAAATTAGTAATCTTTCCATTATCTTTCATCTTAATATTTTTAAATCTGACTGTCTTACCTATTCATACGCACTAAAAAG1000AATTCTTAATTCCAGAAATATTGATGCTCATCTTGTTATTGGTGTAAGGACACAACCTTTTTATAGCCACTCTTGGGTGGAGGTTGGGGGACAAGTTATC1100AATGATGCTCCCAATATGCGGGATAAATTATCTGTTATTGCAGAGATATAGTTATGGAAATATTTAATGTCAAGTTAAATGATACTTCAATTAGAATTAT1200TTTCTGTAAAACGCTTTCTGCCTTCCGGACAGAAAATACCATCGTTATGCTCAAAGGAAAAGCAGTTTCAAATGGCAAACCTGTATCCACAGAGGAGATT1300GCCAGAGTAGTGGAAGAAAAAGGTGTTTCAGAAGTAATAGAAAATTTAGATGGTGTTTTCTGTATCCTAATTTATCATTTTAATGATCTCCTTATAGGGA1400AAAGCATTCAATCAGGCCCCGCTCTATTTTATTGTAAAAAGAATATGGATATTTTTGTTTCGGATAAAATTTCTGATATCAAATTTTTGAATCCAGATAT1500GACATTCAGTCTAAATATAAAAATGGCAGAACATTATCTGTCAGGAAATCGAATAGCAACCCAGGAATCACTAATCACTGGCATTTACAAAGTAAATAAT1600GGTGAGTTTATAAAATTTAATAATCAGTTGAAACCTGTGCTACTTCGTGATGAGTTTAGTATTACCAAAAAGAACAATTCAACTATCGACAGTATCATTG1700ATAATATTGAGATGATGCGGGATAATAGAAAAATAGCCCTATTATTCTCCGGAGGATTGGATTCTGCATTAATTTTTCACACACTTAAAGAATCAGGTAA1800CAAATTCTGCGCTTATCATTTTTTTTCTGATGAATCTGATGACAGTGAAAAGTATTTTGCTAAGGAATACTGTTCAAAATATGGAGTTGATTTTATATCT1900GTTAATAAAAACATCAACTTTAATGAAAAACTTTATTTCAATTTAAATCCTAATAGTCCGGACGAAATCCCTTTGATATTTGAACAGACAGATGAAGAAG2000GTGAAGGTCAGCCCCCCATAGACGATGATTTATTATATCTATGTGGTCACGGTGGAGATCATATTTTCGGACAAAATCCTTCAGAACTTTTTGGCATTGA2100TGCATATCGAAGTCATGGCTTGATGTTTATGCATAAAAAAATAGTAGAATTTTCCAATCTCAAGGGAAAGAGATATAAAGATATCATATTTTCAAATATT2200TCCGCATTCATTAATACATCCAACGGATGTTCTCCAGCAAAGCAAGAGCACGTATCAGATATGAAACTTGCCTCTGCTCAGTTTTTTGCAACTGATTATA2300CAGGAAAAATTAATAAACTAACTCCATTCCTGCATAAAAATATTATCCAGCATTATGCTGGCTTACCAGTTTTTAGTCTATTTAACCAGCACTTTGATCG2400TTATCCCGTTCGTTATGAAGCGTTTCAACGATTTGGTTCAGATATTTTCTGGAAAAAAACCAAACGGTCATCTTCACAGCTAATATTCAGAATTCTATCC2500GGTAAAAAGGATGAACTAGTGAATACAATAAAACAGTCAGGATTAATTGAAATATTAGGCATTAACCATATTGAATTAGAAAGCATTTTGTATGAAAATA2600CGACTACACGTCTGACAACGGAACTACCATATATACTTAACTTATACCGTCTGGCAAAATTCATTCAACTTCAATCCATTGATTATAAAGGTTAATTATG2700GAAAGAAAACAGAAAAACTCATTATTTAATTATATTTATTCATTAATGGATGCAAGAGGTAAATTTTTATTCTTTTCCATGTTATTCATTACATCATTAT2800CATCGATAATCATATCTATTTCACCATTGATTCTTGCAAAGATTACAGATTTACTGTCTGGCTCATTGTCAAATTTTAGTTATGAATATCTGGTTTTACT2900TGCCTGTTTATACATGTTTTGCGTTATATCTAATAAAGCAAGTGTTTTTTTATTTATGATACTGCAAAGTAGTCTACGTATTAACATGCAGAAAAAAATG3000TCGCTAAAATATTTGAGAGAATTGTATAACGAAAATATAACTAACTTGAGTAAAAATAATGCTGGATATACAACGCAAAGTCTTAACCAGGCTTCAAATG3100ACATTTATATTCTTGTGAGAAATGTTTCCCAGAATATCCTGTCACCTGTTATACAACTTATTTCTACTATTGTTGTTGTTTTATCTACGAAGGACTGGTT3200TTCTGCCGGTGTGTTTTTTCTCTATATTCTGGTATTTGTAATTTTTAATACCAGACTGACTGGCAGTTTAGCGTCACTCAGAAAACACAGCATGGATATC3300ACTCTTAACTCTTATAGTCTGTTATCTGATACTGTTGATAACATGATAGCAGCTAAAAAGAATAATGCATTAAGACTTATTTCTGAACGTTATGAAGATG3400CTCTCACTCAGGAAAACAATGCTCAGAAAAAATACTGGTTACTCAGTTCTAAAGTTCTTTTATTGAACTCTTTACTTGCTGTAATATTATTTGGTTCTGT3500ATTCATATATAATATTTTAGGTGTGCTGAATGGTGTAGTTAGTATCGGCCACTTCATTATGATTACATCATATATCATTCTTCTTTCAACGCCAGTGGAA3600AATATAGGGGCATTGCTAAGTGAGATCAGGCAGTCAATGTCTAGCCTGGCAGGTTTTATTCAACGTCATGCCGAGAATAAAGCCACATCTCCTTCAATAC3700CTTTTCTCAACATGGAGCGAAAATTAAACCTGTCCATAAGAGAGCTTTCATTTAGCTATAGTGATGATAAAAAAATACTTAATTCAGTCAGTCTTGACCT3800TTTTACCGGAAAAATGTATTCATTAACCGGACCCAGTGGTTCAGGAAAATCCACCCTTGTAAAAATAATATCAGGTTACTATAAAAATTACTTTGGAGAC3900ATTTATCTGAATGATATATCCTTACGTAATATCAGTGATGAGGATTTGAATGATGCTATTTACTACCTAACACAAGATGATTATATTTTTATGGATACAC4000TACGATTTAATCTCCGGCTCGCAAATTACGACGCGTCAGAAAATGAAATGTTTAAAGTTCTTAAACTGGCAAATCTTTCTGTCGTCAACAATGAACCAGT4100GAGTCTGGATACACACCTTATAAACAGAGGCAATAACTATTCAGGAGGGCAAAAACAACGAATTTCGTTAGCGCGACTGTTTTTGAGAAAACCTGCAATA4200ATTATTATTGATGAAGCCACATCGGCTCTGGATTATATTAATGAATCAGAAATTTTATCATCAATAAGAACTCATTTTCCTGATGCGTTAATTATAAATA4300TTAGTCACCGAATAAATCTTCTGGAGTGTTCCGATTGTGTTTATGTATTGAATGAAGGAAATATTGTTGCTTCTGGCCATTTCAGGGATTTGATGGTCAG4400CAATGAATACATATCGGGACTGGCTTCTGTTACTGAATAA4440當(dāng)前第1頁1 2 3