本發(fā)明涉及一種利用唾液DNA進(jìn)行老年性黃斑病變患病風(fēng)險評估的檢測試劑盒。屬生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：老年性黃斑病變(AMD)也叫年齡相關(guān)性黃斑病變，是西方國家50歲及其以上人群中首要致盲眼病，隨著人口老齡化的逐漸發(fā)展，我國AMD的患病率亦呈逐漸增多的趨勢。老年性黃斑病變又稱年齡相關(guān)性黃斑病變，是一種由多種因素共同作用的疾病，有研究表明75％-85％的黃斑病變是由遺傳基因缺陷導(dǎo)致，此外也受非遺傳/環(huán)境因素影響，如吸煙、年齡、飲食等。黃斑病變還是糖尿病的并發(fā)癥之一，大大提高了黃斑病變的發(fā)病率。老年性黃斑病變是由于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞老化，吞噬代謝功能衰退，玻璃膜液沉積形成玻璃膜疣，或脈絡(luò)膜新生血管增多，從而引發(fā)的黃斑區(qū)病理改變，嚴(yán)重者會導(dǎo)致不可逆性致盲。老年性黃斑病變雖然危害嚴(yán)重，但是該疾病的高危人群可以通過早期預(yù)防，早期干預(yù)明顯的降低疾病的發(fā)生率。由于該疾病與遺傳基因缺陷有很大的關(guān)聯(lián)，目前基因檢測技術(shù)發(fā)展迅速，我們將結(jié)合基因檢測的方法評估個人患病風(fēng)險，根據(jù)不同患病風(fēng)險給予不同健康指導(dǎo)。老年性黃斑病變由于早期癥狀并不明顯且病變之后會嚴(yán)重者可造成不可逆轉(zhuǎn)性致盲的后果，而目前老年性黃斑病變的常規(guī)檢測手段只能在黃斑病變有明顯癥狀后作出診斷，可能會延誤最佳治療時機(jī)。本發(fā)明提供的一種試劑盒，可通過基于檢測發(fā)現(xiàn)個人是否攜帶有致病基于缺陷，并結(jié)合包括教育程度，BMI，年齡，吸煙史等影響因子，來總體評估個體的患病風(fēng)險，快速準(zhǔn)確的鑒別不同風(fēng)險人群，對于老年性黃斑病早期預(yù)警的篩查具有重大的指導(dǎo)意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方案，提供了一種用于檢測如下19個SNP位點(diǎn)的物質(zhì)的新用途，以及提供了一種用于評價或輔助評價(特別是早期的評價或輔助評價)待測人患老年性黃斑病變的風(fēng)險性的產(chǎn)品：rs10490924位點(diǎn)、rs10737680位點(diǎn)、rs13081855位點(diǎn)、rs13278062位點(diǎn)、rs1864163位點(diǎn)、rs2230199位點(diǎn)、rs3130783位點(diǎn)、rs334353位點(diǎn)、rs3812111位點(diǎn)、rs429608位點(diǎn)、rs4420638位點(diǎn)、rs4698775位點(diǎn)、rs5749482位點(diǎn)、rs6795735位點(diǎn)、rs8017304位點(diǎn)、rs8135665位點(diǎn)、rs920915位點(diǎn)、rs943080位點(diǎn)和rs9542236位點(diǎn)。本發(fā)明所提供的新用途具體為：用于檢測所示19個SNP位點(diǎn)的物質(zhì)在制備評價或輔助評價特別是早期的評價或輔助評價)待測人患老年性黃斑病變的風(fēng)險性的產(chǎn)品中的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方案，提供了一組特異性強(qiáng)、靈敏度高的用于檢測老年性黃斑病變風(fēng)險的寡核苷酸。所述寡核苷酸由序列表SEQIDNo.1至序列表SEQIDNo.38所示堿基序列的寡核苷酸組成，其中SEQIDNo.1和SEQIDNo.2分別為擴(kuò)增rs10737680基因的上、下游引物，SEQIDNo.3和SEQIDNo.4分別為擴(kuò)增rs4420638基因的上、下游引物，SEQIDNo.5和SEQIDNo.6分別為擴(kuò)增rs1864163基因的上、下游引物，SEQIDNo.7和SEQIDNo.8分別為擴(kuò)增rs3130783基因的上、下游引物，SEQIDNo.9和SEQIDNo.10分別為擴(kuò)增rs429608基因的上、下游引物，SEQIDNo.11和SEQIDNo.12分別為擴(kuò)增rs8017304基因的上、下游引物，SEQIDNo.13和SEQIDNo.14分別為擴(kuò)增rs6795735基因的上、下游引物SEQIDNo.15和SEQIDNo.16分別為擴(kuò)增rs8135665基因的上、下游引物，SEQIDNo.17和SEQIDNo.18分別為擴(kuò)增rs943080基因的上、下游引物，SEQIDNo.19和SEQIDNo.20分別為擴(kuò)增rs9542236基因的上、下游引物，SEQIDNo.21和SEQIDNo.22分別為擴(kuò)增rs10490924基因的上、下游引物，SEQIDNo.23和SEQIDNo.24分別為擴(kuò)增rs3812111基因的上、下游引物，SEQIDNo.25和SEQIDNo.26分別為擴(kuò)增rs920915基因的上、下游引物，SEQIDNo.27和SEQIDNo.28分別為擴(kuò)增rs2230199基因的上、下游引物，SEQIDNo.29和SEQIDNo.30分別為擴(kuò)增rs5749482基因的上、下游引物，SEQIDNo.31和SEQIDNo.32分別為擴(kuò)增rs13081855基因的上、下游引物，SEQIDNo.33和SEQIDNo.34分別為擴(kuò)增rs13278062基因的上、下游引物，SEQIDNo.35和SEQIDNo.36分別為擴(kuò)增rs4698775基因的上、下游引物，SEQIDNo.37和SEQIDNo.38分別為擴(kuò)增rs334353基因的上、下游引物。根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，提供了一種檢測老年性黃斑病變風(fēng)險的試劑盒。所述試劑盒包括有用于擴(kuò)增如下基因的引物組：rs10490924、rs10737680、rs13081855、rs13278062、rs1864163、rs2230199、rs3130783、rs334353、rs3812111、rs429608、rs4420638、rs4698775、rs5749482、rs6795735、rs8017304、rs8135665、rs920915、rs943080、rs9542236。進(jìn)一步地，所述的引物組是由如下的引物對所組成：用于擴(kuò)增rs10737680基因的引物對：SEQIDNo.1和SEQIDNo.2；用于擴(kuò)增rs4420638基因的引物對：SEQIDNo.3和SEQIDNo.4；用于擴(kuò)增rs1864163基因的引物對：SEQIDNo.5和SEQIDNo.6；用于擴(kuò)增rs3130783基因的引物對：SEQIDNo.7和SEQIDNo.8；用于擴(kuò)增rs429608基因的引物對：SEQIDNo.9和SEQIDNo.10；用于擴(kuò)增rs8017304基因的引物對：SEQIDNo.11和SEQIDNo.12；用于擴(kuò)增rs6795735基因的引物對：SEQIDNo.13和SEQIDNo.14；用于擴(kuò)增rs8135665基因的引物對：SEQIDNo.15和SEQIDNo.16；用于擴(kuò)增rs943080基因的引物對：SEQIDNo.17和SEQIDNo.18；用于擴(kuò)增rs9542236基因的引物對：SEQIDNo.19和SEQIDNo.20；用于擴(kuò)增rs10490924基因的引物對：SEQIDNo.21和SEQIDNo.22；用于擴(kuò)增rs3812111基因的引物對：SEQIDNo.23和SEQIDNo.24；用于擴(kuò)增rs920915基因的引物對：SEQIDNo.25和SEQIDNo.26；用于擴(kuò)增rs2230199基因的引物對：SEQIDNo.27和SEQIDNo.28；用于擴(kuò)增rs5749482基因的引物對：SEQIDNo.29和SEQIDNo.30；用于擴(kuò)增rs13081855基因的引物對：SEQIDNo.31和SEQIDNo.32；用于擴(kuò)增rs13278062基因的引物對：SEQIDNo.33和SEQIDNo.34；用于擴(kuò)增rs4698775基因的引物對：SEQIDNo.35和SEQIDNo.36；用于擴(kuò)增rs334353基因的引物對：SEQIDNo.37和SEQIDNo.38；進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括如下物質(zhì)中的至少一種：TaqDNA聚合酶，10×buffer，dNTP，Mg2+和ddH2O。進(jìn)一步地，所述試劑盒中還含有記載有如下內(nèi)容的可讀性載體：(1)根據(jù)待測個體的基因測序結(jié)果，生成了基因分?jǐn)?shù)(Geneticscore)如下，其中βi是每個位點(diǎn)的權(quán)重，Gi是每個位點(diǎn)的基因型。(2)根據(jù)待測者的基因分?jǐn)?shù)以及其他相關(guān)風(fēng)險因子建立風(fēng)險回歸模型如下：Y'i＝b0+b1GSi+b2X1i+…+bkXki根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方案，提供了一種檢測老年性黃斑病變風(fēng)險的方法，包括以下步驟：1)提取樣品DNA；2)進(jìn)行實(shí)時熒光PCR定量擴(kuò)增并純化，其中，使用的引物為用于擴(kuò)增rs10737680基因的引物對：SEQIDNo.1和SEQIDNo.2；用于擴(kuò)增rs4420638基因的引物對：SEQIDNo.3和SEQIDNo.4；用于擴(kuò)增rs1864163基因的引物對：SEQIDNo.5和SEQIDNo.6；用于擴(kuò)增rs3130783基因的引物對：SEQIDNo.7和SEQIDNo.8；用于擴(kuò)增rs429608基因的引物對：SEQIDNo.9和SEQIDNo.10；用于擴(kuò)增rs8017304基因的引物對：SEQIDNo.11和SEQIDNo.12；用于擴(kuò)增rs6795735基因的引物對：SEQIDNo.13和SEQIDNo.14；用于擴(kuò)增rs8135665基因的引物對：SEQIDNo.15和SEQIDNo.16；用于擴(kuò)增rs943080基因的引物對：SEQIDNo.17和SEQIDNo.18；用于擴(kuò)增rs9542236基因的引物對：SEQIDNo.19和SEQIDNo.20；用于擴(kuò)增rs10490924基因的引物對：SEQIDNo.21和SEQIDNo.22；用于擴(kuò)增rs3812111基因的引物對：SEQIDNo.23和SEQIDNo.24；用于擴(kuò)增rs920915基因的引物對：SEQIDNo.25和SEQIDNo.26；用于擴(kuò)增rs2230199基因的引物對：SEQIDNo.27和SEQIDNo.28；用于擴(kuò)增rs5749482基因的引物對：SEQIDNo.29和SEQIDNo.30；用于擴(kuò)增rs13081855基因的引物對：SEQIDNo.31和SEQIDNo.32；用于擴(kuò)增rs13278062基因的引物對：SEQIDNo.33和SEQIDNo.34；用于擴(kuò)增rs4698775基因的引物對：SEQIDNo.35和SEQIDNo.36；用于擴(kuò)增rs334353基因的引物對：SEQIDNo.37和SEQIDNo.38；3)以純化后的PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行SnapshotPCR，其中，使用的引物為用于擴(kuò)增rs10737680基因的引物對：SEQIDNo.1和SEQIDNo.2；用于擴(kuò)增rs4420638基因的引物對：SEQIDNo.3和SEQIDNo.4；用于擴(kuò)增rs1864163基因的引物對：SEQIDNo.5和SEQIDNo.6；用于擴(kuò)增rs3130783基因的引物對：SEQIDNo.7和SEQIDNo.8；用于擴(kuò)增rs429608基因的引物對：SEQIDNo.9和SEQIDNo.10；用于擴(kuò)增rs8017304基因的引物對：SEQIDNo.11和SEQIDNo.12；用于擴(kuò)增rs6795735基因的引物對：SEQIDNo.13和SEQIDNo.14；用于擴(kuò)增rs8135665基因的引物對：SEQIDNo.15和SEQIDNo.16；用于擴(kuò)增rs943080基因的引物對：SEQIDNo.17和SEQIDNo.18；用于擴(kuò)增rs9542236基因的引物對：SEQIDNo.19和SEQIDNo.20；用于擴(kuò)增rs10490924基因的引物對：SEQIDNo.21和SEQIDNo.22；用于擴(kuò)增rs3812111基因的引物對：SEQIDNo.23和SEQIDNo.24；用于擴(kuò)增rs920915基因的引物對：SEQIDNo.25和SEQIDNo.26；用于擴(kuò)增rs2230199基因的引物對：SEQIDNo.27和SEQIDNo.28；用于擴(kuò)增rs5749482基因的引物對：SEQIDNo.29和SEQIDNo.30；用于擴(kuò)增rs13081855基因的引物對：SEQIDNo.31和SEQIDNo.32；用于擴(kuò)增rs13278062基因的引物對：SEQIDNo.33和SEQIDNo.34；用于擴(kuò)增rs4698775基因的引物對：SEQIDNo.35和SEQIDNo.36；用于擴(kuò)增rs334353基因的引物對：SEQIDNo.37和SEQIDNo.38；4)結(jié)果分析，根據(jù)基因突變情況，以及與老年性黃斑病變相關(guān)的風(fēng)險因子進(jìn)行分析，評估患病風(fēng)險。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下特點(diǎn)：本發(fā)明的試劑盒可快速準(zhǔn)確的鑒別不同的風(fēng)險人群，做到早期檢測，早期預(yù)防，對于老年性黃斑病早期預(yù)警的篩查具有重大的指導(dǎo)意義。附圖說明圖1為PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測圖譜。其中，M為marker標(biāo)準(zhǔn)品，1-15為待測唾液樣本；圖2為不同樣本多重SNAPSHOT電泳結(jié)果；圖3為同一SNP位點(diǎn)不同樣本的基因型結(jié)果；圖4為ROC曲線。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1引物設(shè)計(jì)本發(fā)明試劑盒中使用Snapshot，可以檢測多重的SNP，通常選擇6－12個位點(diǎn)做一個組合。對目的SNP進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)。每個SNP設(shè)計(jì)2條引物，其中一條是目的片段的擴(kuò)增，長度在19－37bp左右，Tm值在60度左右。另外一條的引物的是延伸ddNTP，設(shè)計(jì)在SNP位點(diǎn)的上游或者是反向的下游。本實(shí)施例所用的目的SNP位點(diǎn)及引物如表1所示。本發(fā)明所使用的引物是由上海南方基因科技有限公司合成。表1PCR引物序列實(shí)施例2用于檢測老年黃斑病變風(fēng)險的試劑盒的組成(保存于-20℃)1)多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)液，其包括：TaqDNA聚合酶，10×buffer(15MmMg2+)，dNTP，Mg2+(25Mm)，ddH2O，和用于擴(kuò)增如下基因的引物組：rs10490924、rs10737680、rs13081855、rs13278062、rs1864163、rs2230199、rs3130783、rs334353、rs3812111、rs429608、rs4420638、rs4698775、rs5749482、rs6795735、rs8017304、rs8135665、rs920915、rs943080、rs9542236；。2)SnapshotPCR反應(yīng)液，其包括：用于擴(kuò)增如下基因的引物組：rs10490924、rs10737680、rs13081855、rs13278062、rs1864163、rs2230199、rs3130783、rs334353、rs3812111、rs429608、rs4420638、rs4698775、rs5749482、rs6795735、rs8017304、rs8135665、rs920915、rs943080、rs9542236；其中，用于擴(kuò)增rs10737680基因的上游引物和下游引物分別是SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；用于擴(kuò)增rs4420638基因的上游引物和下游引物分別是SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示的核苷酸序列；用于擴(kuò)增rs1864163基因的上游引物和下游引物分別是SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示的核苷酸序列；用于擴(kuò)增rs3130783基因的上游引物和下游引物分別是SEQIDNo.7和SEQIDNo.8所示的核苷酸序列；用于擴(kuò)增rs429608基因的上游引物和下游引物分別是SEQIDNo.9和SEQIDNo.10所示的核苷酸序列；用于擴(kuò)增rs8017304基因的上游引物和下游引物分別是SEQIDNo.11和SEQIDNo.12所示的核苷酸序列；用于擴(kuò)增rs6795735基因的上游引物和下游引物分別是：SEQIDNo.13和SEQIDNo.14所示的核苷酸序列；用于擴(kuò)增rs8135665基因的上游引物和下游引物分別是SEQIDNo.15和SEQIDNo.16所示的核苷酸序列；用于擴(kuò)增rs943080基因的上游引物和下游引物分別是SEQIDNo.17和SEQIDNo.18所示的核苷酸序列；用于擴(kuò)增rs9542236基因的上游引物和下游引物分別是SEQIDNo.19和SEQIDNo.20所示的核苷酸序列；用于擴(kuò)增rs10490924基因的上游引物和下游引物分別是SEQIDNo.21和SEQIDNo.22所示的核苷酸序列；用于擴(kuò)增rs3812111基因的上游引物和下游引物分別是SEQIDNo.23和SEQIDNo.24所示的核苷酸序列；用于擴(kuò)增rs920915基因的上游引物和下游引物分別是SEQIDNo.25和SEQIDNo.26所示的核苷酸序列；用于擴(kuò)增rs2230199基因的上游引物和下游引物分別是SEQIDNo.27和SEQIDNo.28所示的核苷酸序列；用于擴(kuò)增rs5749482基因的上游引物和下游引物分別是SEQIDNo.29和SEQIDNo.30所示的核苷酸序列；用于擴(kuò)增rs13081855基因的上游引物和下游引物分別是SEQIDNo.31和SEQIDNo.32所示的核苷酸序列；用于擴(kuò)增rs13278062基因的上游引物和下游引物分別是SEQIDNo.33和SEQIDNo.34所示的核苷酸序列；用于擴(kuò)增rs4698775基因的上游引物和下游引物分別是SEQIDNo.35和SEQIDNo.36所示的核苷酸序列；用于擴(kuò)增rs334353基因的上游引物和下游引物分別是SEQIDNo.37和SEQIDNo.38所示的核苷酸序列。下述實(shí)施例將具體描述使用本發(fā)明試劑盒對老年黃斑病變風(fēng)險風(fēng)險進(jìn)行分析評估。實(shí)施例3樣品采集1.樣品來源本實(shí)施例病例樣本均來自于武警總醫(yī)院，已初步確診為老年性黃斑病變患者；此外還使用正常人的唾液樣本作為參照。2.采集唾液樣本本發(fā)明使用江蘇健康云生物科技有限公司的型號為JKY-B的唾液采集器采集人的唾液，具體步驟如下：1)將唾液吐進(jìn)漏斗，直至液體唾液(而非氣泡)的量達(dá)到刻度線(2毫升)處。2)單手持采集器，令其處于直立狀態(tài)，另一只手逆時針小心擰下整個漏斗部分(丟棄即可)，待唾液完全流入下面的采樣管即可。3)用藍(lán)色的管蓋將采樣管順時針蓋好并旋緊，搖晃5秒鐘，使唾液與保存液充分混合。4)將充分混合后的采樣管保存用于后續(xù)處理。實(shí)施例4提取樣本中DNA本發(fā)明采用鹽析法來提取唾液脫落空腔細(xì)胞中的DNA，所采用的試劑配置方法如下：1)細(xì)胞核裂解液：2)TE緩沖液：組分規(guī)格Tris-HCl10mmol/LEDTA1mmol/LpH8.0提取DNA的具體方法如下：1)將唾液樣本置于1.5mL離心管中；2)向離心管中加入細(xì)胞核裂解液400μl，蛋白酶K20μl震蕩之后將離心管置于65℃環(huán)境中30min，期間震蕩2次；3)取出離心管，4000r/min離心20min；4)向離心管中加入200μl5mol/LNaCl混合均勻，將離心管中的液體盡量轉(zhuǎn)移到新的標(biāo)記好的相應(yīng)的離心管中；5)將離心管15106×g離心5min之后，將上清液轉(zhuǎn)移到新的標(biāo)記好的相應(yīng)離心管中；6)加入等體積的異丙醇，充分混勻，15106×g離心5min之后，棄上清；7)瞬時離心，將離心管管底乙醇吸出，振蕩培養(yǎng)箱37℃放置5min，加入TE緩沖液50μl，即最終得到個人的基因組DNA。隨后，為評估驗(yàn)證采用鹽析法提取利用唾液中的DNA進(jìn)行基因檢測的可行性，對提取的基因組DNA進(jìn)行了濃度和純度檢測，用PUEX紫外分光光度計(jì)檢測DNA的紫外吸收值，計(jì)算DNA的量和純度。根據(jù)計(jì)算結(jié)果將DNA稀釋為10ng/μl。紫外吸收值測定結(jié)果顯示，A260/A280比值在1.54-1.96之間，均值為1.79，A260/A230比值在0.55-1.8之間，均值為1.14?？傮w來說，當(dāng)A260和A280的比值為1.6-2.0時，可以認(rèn)為獲得了純的DNA。并進(jìn)行DNA分子質(zhì)量檢測，4μlDNA與2μl上樣緩沖液混合，0.8％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像系統(tǒng)照相。實(shí)施例5SnapshotPCR1.片段擴(kuò)增將引物稀釋到100mM，加入的TE緩沖液的量為660000/MW，如分子量為7003，則加入660000/7003＝94.2ul。做試驗(yàn)前將一組的引物加雙蒸水稀釋成10mM。所使用的反應(yīng)體系如下：表2多重PCR擴(kuò)增體系組分用量10×緩沖液(15MmMg2+)1μL引物(10Mm)0.4μL脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP)(10Mm)0.3μLTaqDNA聚合酶(5u/ul)0.1μL模板DNA1μLMg2+(25Mm)0.52μL雙蒸水(ddH2O)6.68μL總用量10μL多重PCR反應(yīng)采用Touch－down的PCR反應(yīng)程序:95℃15min；94℃40s，63℃1min，每個循環(huán)下降0.5℃，72℃1.5min，15個循環(huán)；94℃40s，56℃40s，72℃1.5min，25個循環(huán)；72℃8min；結(jié)束后4℃保存。隨后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結(jié)果如圖1所示。2.PCR產(chǎn)物的純化采用SAP和ExoI純化酶，其中SAP去除多余的dNTP和引物，ExoI去除單鏈引物和其他單鏈DNA產(chǎn)物。反應(yīng)體系如下：PCR產(chǎn)物6μL+2μL酶混合液(含2USAP和2UExoI)，振蕩混勻；反應(yīng)條件如下：37℃孵育保溫1hr，然后75℃保溫15min以滅活SAP和ExoI酶。純化好的模板可以在4℃保存24hr或-20℃長期保存。3.SnapshotPCR擴(kuò)增混合模板：以純化后的PCR產(chǎn)物作為SnapshotPCR的模板，每種各取2μL，混合。本發(fā)明也可將質(zhì)粒直接作為模板用于反應(yīng)?；旌蟂napshot的PCR引物：每種引物在反應(yīng)體系中的終濃度分別為0.2μLM。(每個SNP引物加1-2ul到500ulDDH2O中)。SnapshotPCR反應(yīng)體系如下：表3SnapshotPCR反應(yīng)體系組分用量(μL/樣本)標(biāo)準(zhǔn)品(μL)反應(yīng)混合液0.55混合PCR產(chǎn)物22混和引物1.21蒸餾水1.32總體積5μL10μL其中，反應(yīng)混合液包括：DNA模板、引物、DNA聚合酶、脫氧單核苷酸、緩沖體系。PCR循環(huán)條件為：96℃10sec→(96℃10sec→50℃(53℃)5sec→60℃30sec)×25循環(huán)→60℃30sec→4℃4.SnapshotPCR產(chǎn)物的純化在5μL上述SnapshotPCR產(chǎn)物中加入0.5USAP或者1UCIP，震蕩混勻，37℃保溫。1hr，75℃保溫15min以滅活酶，4℃可保存24hr或-20℃長期保存。5.310、3100、3730電泳樣品制備將SnapshotPCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，電泳體系如下：表4電泳反應(yīng)體系試劑用量(μL)Hi-DiFormamide9.25GS-120LIZ0.1SNaPshot產(chǎn)物1總體積10.35μL95℃變性5min→迅速冰冷4min。每個電泳樣本都加入了LIZ－120內(nèi)標(biāo)，使延伸片段的長度大小可以精確定位。6.GeneMapper4.0軟件分析GeneMapper4.0軟件分析結(jié)果見圖2和圖3。其中，圖2為不同樣本多重SNAPSHOT電泳結(jié)果。圖3中結(jié)果顯示1個SNP位點(diǎn)在3個樣本中的基因型結(jié)果，其中第一個樣本在該位點(diǎn)的基因分型為G/A,第二個樣本的基因分型為AA，第三個樣本的基因分型為GG。GeneMapper4.0軟件分析后輸出結(jié)果如表5所示。表5測序后輸出結(jié)果選取兩個樣本作為示例，其分析結(jié)果如表5所示，通過與19個基準(zhǔn)SNP作對比，發(fā)現(xiàn)所述兩個樣本均有約13個基因分型與基準(zhǔn)SNP有變化，會增加或降低疾病的發(fā)生率。實(shí)施例6測序結(jié)果分析1.構(gòu)建模型收集整理與黃斑病變相關(guān)的19個基因位點(diǎn)，所述基因位點(diǎn)為rs10490924、rs10737680、rs13081855、rs13278062、rs1864163、rs2230199、rs3130783、rs334353、rs3812111、rs429608、rs4420638、rs4698775、rs5749482、rs6795735、rs8017304、rs8135665、rs920915、rs943080、rs9542236，并詳細(xì)檢驗(yàn)這些位點(diǎn)及相關(guān)強(qiáng)度，結(jié)果見表6。表6檢測位點(diǎn)列表SNPChr位點(diǎn)RefAlt權(quán)重rs1049092410124214448GT‐1.02rs107376801196679455AC0.89rs13081855399481539GT‐0.21rs13278062823082971GT‐0.14rs18641631656997233GA0.20rs2230199196718387GC‐0.35rs3130783630774357GA0.15rs3343539101908365TG‐0.12rs38121116116443735TA0.10rs429608631930462GA0.55rs44206381945422946AG0.26rs46987754110590479GT‐0.13rs57494822233059665GC‐0.27rs6795735364705365CT0.10rs80173041468785077GA‐0.10rs81356652238476276CT‐0.14rs9209151558688467CG‐0.12rs943080643826627CT0.14rs95422361331819325TC‐0.10根據(jù)待測個體的基因測序結(jié)果，生成了基因分?jǐn)?shù)(Geneticscore)如下，其中βi是每個位點(diǎn)的權(quán)重(見表1)，Gi是每個位點(diǎn)的基因型。然后根據(jù)待測者的基因分?jǐn)?shù)以及其他相關(guān)風(fēng)險因子建立風(fēng)險回歸模型如下：Y'i＝b0+b1GSi+b2X1i+…+bkXki(2)其中，GS為公式(1)所列的個人基因分?jǐn)?shù)，X1…Xk為相關(guān)的風(fēng)險因子，包括教育程度，BMI，年齡，吸煙史等。整個模型可以利用R統(tǒng)計(jì)軟件“glm”功能獲得最優(yōu)值。對于家族數(shù)據(jù)，必須考慮家族成員之間的相關(guān)性，因此使用R統(tǒng)計(jì)軟件“geepack”功能獲得最優(yōu)值。本發(fā)明的風(fēng)險評估模型是以歐美現(xiàn)有的疾病數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，并根據(jù)收集的中國人的樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行修改與完善，逐漸將其完善為完全適合中國人的風(fēng)險評估模型。其中，本發(fā)明模型的優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在以下幾個方面：1)完善了每個基因突變的在中國人群中的頻率；2)完善各個風(fēng)險因子在適用人群的頻率分布。吸煙，發(fā)病年齡等因素對于模型的估計(jì)有很大的影響，因此我們分別估計(jì)這些環(huán)境因素對于我們特定適用人群的影響，并把這些調(diào)整之后的影響因子加入模型；3)預(yù)測模型的更新與完善。本模型是根據(jù)400個病人對照生成的，隨著未來數(shù)據(jù)量的增加，預(yù)測模型可以根據(jù)更大量的數(shù)據(jù)，利用公式(1)(2)重新進(jìn)行模擬，可以進(jìn)一步提高預(yù)測的準(zhǔn)確度2.患病風(fēng)險評估模型構(gòu)建完成之后，本發(fā)明對模型的功效進(jìn)行了評估。為了兼顧敏感性和特異性，使用受試者工作特征曲線(receiveroperatingcharacteristiccurve，ROC曲線)。每個模型使用10次交叉驗(yàn)證對結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，并使用1000次模擬以獲得穩(wěn)定的交叉驗(yàn)證結(jié)果。利用所建立的模型，對病人樣本進(jìn)行分析以評估個人患病風(fēng)險，從而快速準(zhǔn)確的鑒別不同的風(fēng)險人群。本實(shí)施例檢測了包括ARMS2,HTRA1,CFH在內(nèi)共19個與老年性黃斑病變相關(guān)的基因位點(diǎn)，利用風(fēng)險回歸模型以及米天基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，并得出疾病的患病風(fēng)險。具體結(jié)果參見表7。表7風(fēng)險評估與圖4顯示的ROC曲線結(jié)果相比較，可以看出本發(fā)明的模型預(yù)測結(jié)果經(jīng)過多個樣本的擬合有較高的準(zhǔn)確度。顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對本發(fā)明的實(shí)施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無法對所有的實(shí)施方式予以窮舉。凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。SEQUENCELISTING<110>杭州米天基因科技有限公司<120>老年性黃斑病變的相關(guān)基因的檢測試劑盒<130><160>38<170>PatentInversion3.5<210>1<211>20<212>DNA<213>rs10737680基因上游引物<400>1gatttggaaccagagcctga20<210>2<211>21<212>DNA<213>rs10737680基因下游引物<400>2cccgaaataagacctccatct21<210>3<211>20<212>DNA<213>rs4420638基因上游引物<400>3cccacagggaaaattctcat20<210>4<211>20<212>DNA<213>rs4420638基因下游引物<400>4atacctggctggcagaaatg20<210>5<211>20<212>DNA<213>rs1864163基因上游引物<400>5cgttgtggagagtgtgctgt20<210>6<211>20<212>DNA<213>rs1864163基因下游引物<400>6caactggtcccaaaggagag20<210>7<211>20<212>DNA<213>rs3130783基因上游引物<400>7acctggcccaagagcttaat20<210>8<211>23<212>DNA<213>rs3130783基因下游引物<400>8tctcagacctcctattcatttcc23<210>9<211>21<212>DNA<213>rs429608基因上游引物<400>9gtttgggatttcattcatcct21<210>10<211>21<212>DNA<213>rs429608基因下游引物<400>10ccaaagagggctacaacttgg21<210>11<211>19<212>DNA<213>rs8017304基因上游引物<400>11ccatccatgctgtgccttc19<210>12<211>19<212>DNA<213>rs8017304基因下游引物<400>12gcccacgcctttagaatgg19<210>13<211>20<212>DNA<213>rs6795735基因上游引物<400>13caggacaaactcagcaagcc20<210>14<211>19<212>DNA<213>rs6795735基因下游引物<400>14aagaactcaggcagggcag19<210>15<211>22<212>DNA<213>rs8135665基因上游引物<400>15gatgtgattccttgtttgcact22<210>16<211>23<212>DNA<213>rs8135665基因下游引物<400>16tttcctgggagagattagaagac23<210>17<211>20<212>DNA<213>rs943080基因上游引物<400>17gcctgagatggcaagtctgt20<210>18<211>20<212>DNA<213>rs943080基因下游引物<400>18cagtgtcaggtggtgctgag20<210>19<211>20<212>DNA<213>rs9542236基因上游引物<400>19ttacatctgccatgcctctg20<210>20<211>22<212>DNA<213>rs9542236基因下游引物<400>20tcaggtcaagtgaactcacagc22<210>21<211>22<212>DNA<213>rs10490924基因上游引物<400>21cctgcatgtgtacctttcaaga22<210>22<211>19<212>DNA<213>rs10490924基因下游引物<400>22caggtttggctggctttcg19<210>23<211>19<212>DNA<213>rs3812111基因上游引物<400>23ataatgggcaggcaaggag19<210>24<211>20<212>DNA<213>rs3812111基因下游引物<400>24accaccttctccaccacttg20<210>25<211>20<212>DNA<213>rs920915基因上游引物<400>25cccagtctcgggtatgtctt20<210>26<211>23<212>DNA<213>rs920915基因下游引物<400>26tccttccactatctctctcttga23<210>27<211>20<212>DNA<213>rs2230199基因上游引物<400>27gcatgtgaacatcccattca20<210>28<211>20<212>DNA<213>rs2230199基因下游引物<400>28accctttccagtgtctgcac20<210>29<211>20<212>DNA<213>rs5749482基因上游引物<400>29agtcgttttgccacttggtc20<210>30<211>20<212>DNA<213>rs5749482基因下游引物<400>30aaaggcaggctgaatcactc20<210>31<211>21<212>DNA<213>rs13081855基因上游引物<400>31gcctgctagcaacaaattcac21<210>32<211>20<212>DNA<213>rs13081855基因下游引物<400>32caagcagaacaaatgccaag20<210>33<211>20<212>DNA<213>rs13278062基因上游引物<400>33ggcgtgtttagggtggtatg20<210>34<211>20<212>DNA<213>rs13278062基因下游引物<400>34tgaaaggaagggcacgaata20<210>35<211>20<212>DNA<213>rs4698775基因上游引物<400>35gatttggaaccagagcctga20<210>36<211>21<212>DNA<213>rs4698775基因下游引物<400>36cccgaaataagacctccatct21<210>37<211>20<212>DNA<213>rs334353基因上游引物<400>37cccacagggaaaattctcat20<210>38<211>20<212>DNA<213>rs334353基因下游引物<400>38atacctggctggcagaaatg20當(dāng)前第1頁1 2 3