本發(fā)明屬于分子生物學(xué)DNA分子標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及大瀧六線魚SSR分子標(biāo)記的開發(fā)及遺傳多樣性以及種群間的親緣關(guān)系的鑒定。
背景技術(shù)：
大瀧六線魚(學(xué)名：Hexagrammos otakii)為六線魚科六線魚屬的魚類。分布于朝鮮、日本以及中國(guó)東海、黃海、渤海等海域，系冷溫性近海底層魚類。大瀧六線魚的食性很廣，以底棲生物為主，也攝食小蝦、小魚。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)大瀧六線魚的研究報(bào)道還比較少，主要集中在生物學(xué)地位、生態(tài)分布以及種群資源量，還有一些學(xué)者對(duì)其生理、生化等方面進(jìn)行了研究，但目前對(duì)于大瀧六線魚微衛(wèi)星方面的研究則不多。這在一定程度上限制了大瀧六線魚的遺傳育種和品質(zhì)改良。
微衛(wèi)星標(biāo)記(SSRs：simple sequence repeats)或短串聯(lián)重復(fù)(Short tandem repeats，STRS)，是由2～6個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)片段構(gòu)成的且均勻，分布于真核生物基因組中的簡(jiǎn)單重復(fù)序列，是一種廣泛應(yīng)用的遺傳學(xué)領(lǐng)域的DNA分子標(biāo)記。每個(gè)微衛(wèi)星DNA都包括核心序列和側(cè)翼序列，核心序列即為重復(fù)序列，而側(cè)翼DNA序列是保守的特異單拷貝序列，但是側(cè)翼序列卻很保守，為分析微衛(wèi)星序列多態(tài)性提供了可能性。通過(guò)側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物對(duì)基因組進(jìn)行擴(kuò)增，然后對(duì)PCR產(chǎn)物即特異位點(diǎn)的微衛(wèi)星序列進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)。微衛(wèi)星具有多態(tài)性高，提供的遺傳信息多，PCR擴(kuò)增效果重復(fù)性好，以及在基因組中分散分布等優(yōu)點(diǎn)，常用于生物的遺傳多樣性分析，遺傳圖譜和雜交育種等。由于微衛(wèi)星研究所用DNA的數(shù)量少，對(duì)樣品要求低，因此，微衛(wèi)星分析在遺傳學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明第一方面提供一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸具有選自序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.15任一所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供所述多核苷酸的用途，作為微衛(wèi)星標(biāo)志物用于大瀧六線魚群體遺傳學(xué)分析，遺傳多樣性檢測(cè)，數(shù)量性狀遺傳圖譜，遺傳連鎖作圖，家系和個(gè)體鑒定，分子輔助育種。
本發(fā)明第二方面提供大瀧六線魚微衛(wèi)星位點(diǎn)，所述位點(diǎn)選自序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.15任一所示的核苷酸序列，或選自任一在嚴(yán)格條件下與權(quán)利要求1中的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。本發(fā)明還提供所述大瀧六線魚微衛(wèi)星位點(diǎn)的組合，選自所述大瀧六線魚微衛(wèi)星位點(diǎn)的兩種或多種。
本發(fā)明第三方面提供選自SEQ ID NO：1-15任一所述的微衛(wèi)星位點(diǎn)兩端的側(cè)翼序列上設(shè)計(jì)的大瀧六線魚微衛(wèi)星引物。本發(fā)明提供的引物是引物對(duì)，所述的引物對(duì)具有選自以下序列對(duì)所示的序列：SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23；SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25；SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27；SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：29；SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：31；SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：33；SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：35；SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37；SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39；SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41；SEQ ID NO：42和SEQ ID NO：43；SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：45。
本發(fā)明第四方面提供大瀧六線魚微衛(wèi)星引物或其組合在大瀧六線魚群體遺傳學(xué)分析，遺傳多樣性檢測(cè)，數(shù)量性狀遺傳圖譜，遺傳連鎖作圖，家系和個(gè)體鑒定，分子輔助育種的用途。
本發(fā)明第五方面提供一種用于大瀧六線魚遺傳多樣性檢測(cè)的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中含有選自本發(fā)明提供的任一所示的引物。
本發(fā)明第六方面提供一種大瀧六線魚遺傳多樣性檢測(cè)的方法，包括以下步驟：
1)基因組DNA的提取：
2)微衛(wèi)星PCR擴(kuò)增：采用FAM熒光標(biāo)記的微衛(wèi)星引物擴(kuò)增大瀧六線魚基因組DNA，獲得其擴(kuò)增產(chǎn)物；
3)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳：在毛細(xì)管電泳基因分析儀上電泳，用GS500LIZ作分子量?jī)?nèi)標(biāo)，個(gè)體擴(kuò)增產(chǎn)物用peak Scanner Software(v1.0)對(duì)毛細(xì)管電泳數(shù)據(jù)初步處理。
4)遺傳多樣性分析：根據(jù)每個(gè)個(gè)體微衛(wèi)星擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量的大小取定基因型，利用PopGene 32計(jì)算遺傳多樣性參數(shù)。
本發(fā)明中微衛(wèi)星位點(diǎn)，位點(diǎn)序列和對(duì)應(yīng)的引物信息如表1：
表1
本發(fā)明的微衛(wèi)星多態(tài)性引物用于大瀧六線魚遺傳多樣性檢測(cè)以及種群間的親緣關(guān)系的鑒定，包括以下步驟：
1)基因組DNA的提?。翰捎肙mega公司的組織DNA提取試劑盒。
2)微衛(wèi)星PCR擴(kuò)增：采用FAM熒光標(biāo)記的微衛(wèi)星引物擴(kuò)增大瀧六線魚基因組DNA，獲得其擴(kuò)增產(chǎn)物。
3)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳：在毛細(xì)管電泳基因分析儀上電泳，用GS500LIZ作分子量?jī)?nèi)標(biāo)，個(gè)體擴(kuò)增產(chǎn)物用peak Scanner Software(v1.0)對(duì)毛細(xì)管電泳數(shù)據(jù)初步處理。
4)遺傳多樣性分析：根據(jù)每個(gè)個(gè)體微衛(wèi)星擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量的大小確定基因型，利用PopGene 32計(jì)算遺傳多樣性參數(shù)。
本發(fā)明從大瀧六線魚基因組DNA中篩選出15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，并根據(jù)這些位點(diǎn)在微衛(wèi)星位點(diǎn)兩端的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)特異性引物，使所獲得引物的擴(kuò)增結(jié)果具有多態(tài)性和穩(wěn)定性，可適用于大瀧六線魚種群遺傳學(xué)分析，種群遺傳多樣性檢測(cè)，數(shù)量性狀遺傳圖譜，遺傳連鎖作圖個(gè)體鑒定以及分子輔助育種領(lǐng)域。
具體實(shí)施方式
一、微衛(wèi)星分子標(biāo)記的篩選
本發(fā)明根據(jù)基于簡(jiǎn)化基因組測(cè)序(RAD)利用二代測(cè)序技術(shù)所開發(fā)出的SSR文庫(kù)，根據(jù)ncbi中與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的堿基序列的比對(duì)結(jié)果，并根據(jù)相關(guān)位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了60對(duì)的篩選引物，在大瀧六線魚的20個(gè)個(gè)體中進(jìn)行驗(yàn)證。
微衛(wèi)星引物的驗(yàn)證
以大瀧六線魚基因組為模板，用60對(duì)引物進(jìn)行溫度梯度PCR以摸索出最佳退火溫度，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果。在已摸索出最佳退火溫度的引物中挑選出15對(duì)重新合成FAM標(biāo)記的熒光標(biāo)記引物。20μL體系PCR：ddH2O 7.5μL；上游引物(10mM)1μL；下游引物(10mM)1μL；DNA模板0.5μL；Premix Taq(TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye)10μL。PCR程序：94℃3min，(94℃30s，Tm 30s，72℃1min)x32 cycle，72℃10min.用ABI3730xl全自動(dòng)DNA測(cè)序儀(上海生物工程股份有限公司)測(cè)序。用Peak Scanner Software(v1.0)對(duì)毛細(xì)管電泳數(shù)據(jù)初步處理。軟件PopGene 32進(jìn)行遺傳指標(biāo)(等位基因(na：Observed number of alleles)、有效等位基因(ne：Effective number of alleles)、觀測(cè)雜合度(Observed heterozygosity)、期望雜合度(Expected heterozygosity)、香農(nóng)遺傳指數(shù)(Shannon’s Information index(I))、Nei氏多樣性指數(shù)(Nei’s gene diversity index(Nei))、多態(tài)信息含量(polymorphism information content(PIC)))計(jì)算。
大瀧六線魚微衛(wèi)星引物在不同地理群體中的遺傳多樣性的應(yīng)用
1.首先，采用Omega公司的組織DNA提取試劑盒提取大瀧六線魚的基因組DNA。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的濃度和質(zhì)量。
2.用FAM熒光標(biāo)記的引物PCR擴(kuò)增，20μL體系PCR：ddH2O 7.5μL；上游引物(10mM)1μL；下游引物(10mM)1μL；DNA模板0.5μL；Premix Taq(TaKaRa Taq Version 2.0 plus dye)10μL。PCR程序：94℃3min，(94℃30s，Tm 30s，72℃1min)x32 cycle，72℃10min.用毛細(xì)管電泳(上海生物工程股份有限公司)檢測(cè)。
3.用Peak Scanner Software(v1.0)對(duì)毛細(xì)管電泳數(shù)據(jù)初步處理。軟件PopGene 32進(jìn)行遺傳指標(biāo)測(cè)定。(等位基因(na：Observed number of alleles)、有效等位基因(ne：Effective number of alleles)、觀測(cè)雜合度(Observed heterozygosity)、期望雜合度(Expected heterozygosity)、香農(nóng)遺傳指數(shù)(Shannon’s Information index(I))、Nei氏多樣性指數(shù)(Nei’s gene diversity index(Nei))、多態(tài)信息含量(polymorphism information content(PIC)))計(jì)算。
表2：15個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的重復(fù)單位、引物的相關(guān)信息
其中Tm是微衛(wèi)星的退火溫度，na為等位基因數(shù)，ne為有效等位基因數(shù)，Obs_Het觀望雜合度，Exp-Het為期望雜合度。PIC為多態(tài)信息含量，I是香農(nóng)指數(shù)，Nei為Nei氏多樣性指數(shù)，PIC為多態(tài)信息含量。
本發(fā)明的15對(duì)引物對(duì)20個(gè)大瀧六線魚基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，遺傳多樣性分析結(jié)果表明每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)平均等位基因數(shù)為16.0667，平均有效等位基因數(shù)是6.7202，平均觀望雜合度0.6323，平均期望雜合度為0.8075。
本發(fā)明的微衛(wèi)星引物可用于大瀧六線魚遺傳多樣性檢測(cè)，數(shù)量性狀遺傳圖譜，遺傳連鎖作圖、以及家系和個(gè)體鑒定。