本發(fā)明屬于遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種改進(jìn)后的小麥花粉管轉(zhuǎn)基因育種方法。

背景技術(shù)：

關(guān)于花粉管通道，王艷杰等人（花粉管通道法轉(zhuǎn)基因技術(shù)的細(xì)胞胚胎學(xué)機(jī)理探討，西北植物學(xué)報(bào)，2006，26(3)：0628-0634）認(rèn)為，花粉管通道是花粉管在相關(guān)組織中生長時(shí)，將周圍組織的細(xì)胞擠壓，從而使花粉管與相應(yīng)組織的細(xì)胞之間形成的縫隙?；ǚ酃芡ǖ婪ǎ╬ollen-tube pathway）就是將供體生物的DNA片段，在受體自花授粉后一定時(shí)期，使其沿著花粉管的通道進(jìn)入胚囊轉(zhuǎn)化受精卵或其前后的細(xì)胞（卵細(xì)胞和早期胚細(xì)胞）而自然發(fā)展成種子。

花粉管通道法自創(chuàng)立以來，在玉米、水稻、棉花等多種農(nóng)作物育種上取得了顯著成績，因?yàn)樵摲ㄊ峭庠碊NA或單基因?qū)胫参锖啽阌行У耐緩?，其成本低廉，因而尤其適合我國廣大育種工作者作為育種的新方法，在國內(nèi)得到了較為快速的推廣和發(fā)展。

關(guān)于花粉管通道法，現(xiàn)有研究一般認(rèn)為，其主要優(yōu)勢有以下幾點(diǎn)：

（1）可直接得到轉(zhuǎn)化種子，不依賴植物組織培養(yǎng)或誘導(dǎo)再生植株等一整套人工培養(yǎng)過程，一般不會形成嵌合體，純合速度快；

（2）由于花粉管通道是天然存在的普通現(xiàn)象，故利用花粉管通道法進(jìn)行外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化，可基本上應(yīng)用于任何開花植物，進(jìn)行任何物種之間包括人工合成基因的轉(zhuǎn)移，從而極大的擴(kuò)大了基因工程的目的基因的來源和受體植物的范圍；

（3）操作簡便、經(jīng)濟(jì)，易于常規(guī)育種者掌握，適合大規(guī)模的農(nóng)作物遺傳轉(zhuǎn)化；由于直接獲得轉(zhuǎn)基因植株，在進(jìn)行轉(zhuǎn)基因目標(biāo)性狀和轉(zhuǎn)基因分子鑒定的同時(shí)，即可針對轉(zhuǎn)基因植株的農(nóng)藝性狀進(jìn)行定向篩選，故能夠與轉(zhuǎn)基因育種直接結(jié)合，使形成轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物新品種的效率得到提高，育種周期大幅縮短；

（4）轉(zhuǎn)化頻率高，效果好，變異廣泛，為育種提供了大量有價(jià)值的種質(zhì)資源；

（5）該方法利用了整體植株的卵細(xì)胞、受精卵或早期胚胎細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，直接獲得的產(chǎn)品即是轉(zhuǎn)基因植株；因此，在轉(zhuǎn)基因表達(dá)的目標(biāo)性狀鑒定上，完全可以直接針對目標(biāo)性狀的表現(xiàn)型進(jìn)行，從而避免在植物組培的鑒定過程中，大量依賴抗生素進(jìn)行篩選的弊端。

但是，花粉管通道法也有一些較為明顯的缺陷，主要有如下幾點(diǎn)：

（1）進(jìn)行外源基因轉(zhuǎn)化目標(biāo)植物的工作時(shí)間受自然花期限制，同時(shí)必須充分了解每一種植物的開花受精的時(shí)間和過程；

（2）花粉管通道法操作的經(jīng)驗(yàn)性較強(qiáng)，需要一定的技術(shù)摸索和技巧；

（3）對單籽粒的小花農(nóng)作物操作難度較大，需要大量的、濃度高的質(zhì)粒，工作量大，成本高，限制其在生產(chǎn)上的規(guī)模化應(yīng)用。

由于上述缺陷，因而一定程度上嚴(yán)重的限制了花粉管通道法在轉(zhuǎn)基因育種尤其是小花植物（例如小麥）育種中的大規(guī)模應(yīng)用，本發(fā)明系統(tǒng)化了小麥花粉管轉(zhuǎn)基因的方法，并對質(zhì)粒提取方法進(jìn)行改進(jìn)，提取質(zhì)粒濃度高且成本低，并成功把外源質(zhì)粒導(dǎo)入小麥中。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種改進(jìn)后的小麥花粉管轉(zhuǎn)基因育種方法，從而為花粉管通道法在農(nóng)作物分子育種中的應(yīng)用提供借鑒和參考。

本發(fā)明所采取的詳細(xì)技術(shù)方案如下所述。

一種小麥花粉管轉(zhuǎn)基因育種方法，包括以下步驟：

（1）采用熱擊法將含目標(biāo)基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行熱激轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后加入培養(yǎng)液進(jìn)行抗性篩選，獲得重組后菌株；

（2）采用玻璃珠懸起菌落法快速提取質(zhì)粒，具體過程為：

首先，將步驟（1）中篩選所得重組菌株接種于含有抗性抗生素的平板培養(yǎng)基上，進(jìn)行培養(yǎng)；

其次，在平板上加入無菌水和滅菌的玻璃珠搖晃，利用玻璃珠懸起菌落，并將含有菌落的無菌水進(jìn)行離心，保留沉淀細(xì)胞；

最后，將沉淀細(xì)胞進(jìn)行裂解，利用氯仿-異戊醇混合液，離心提取質(zhì)粒；

（3）利用花粉管通道法轉(zhuǎn)化受體小麥，具體為：

在小麥開花前，按照常規(guī)雜交育種的方法進(jìn)行整穗、去雄、套袋；在去雄2 ~ 3天后，人工授粉；

在小麥?zhǔn)诜?.5~2h后剪去約三分之一的柱頭，然后在剪切后的柱頭上滴加步驟（2）中所提取的質(zhì)粒；每個(gè)柱頭的上質(zhì)粒的滴加量具體可設(shè)計(jì)為：100 μg/mL、10μL；

優(yōu)選情況下，在柱頭上初次滴加質(zhì)粒后1h重復(fù)滴加一次；

滴加質(zhì)粒后，套袋，做好標(biāo)記，繼續(xù)培育，自然結(jié)實(shí)后收獲小麥種子，對所收獲的小麥的種子進(jìn)一步培育、篩選獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株。

本發(fā)明所提供的小麥花粉管轉(zhuǎn)基因方法，通過對質(zhì)粒提取方法的優(yōu)化，大大提高了獲得大量質(zhì)粒的效率，從而為花粉管通道法在小花農(nóng)作物如小麥中的大規(guī)模應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。相較于現(xiàn)有的花粉管通道法在小麥轉(zhuǎn)基因育種中的應(yīng)用，本發(fā)明中質(zhì)粒提取便捷、快速，成本低廉，且省工省時(shí)，能夠較好提高工作效率，因而對于小麥新品種的培育具有較好地促進(jìn)作用。

附圖說明

圖1為100mg/L的潮霉素涂抹篩選，上圖中是表現(xiàn)潮霉素抗性，下圖中是沒有表現(xiàn)潮霉素抗性；

圖2 為轉(zhuǎn)化植株Tri101基因PCR鑒定；其中泳道 M : DNA Marker DL2000；泳道1-13: 樣品；泳道14: pCAMBIA1301S空載體對照；泳道15: 陽性對照；泳道16: 陰性對照；泳道17: 空白對照（水）；

圖3為轉(zhuǎn)化植株GUS染色鑒定，其中A為陽性植株，B為陰性植株。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋說明。介紹具體實(shí)施例前，對本發(fā)明中涉及的部分物料及試驗(yàn)設(shè)備情況簡要介紹說明如下。

生物材料：

大腸桿菌JM109購于TaKaRa公司；

質(zhì)粒pCAMBIA1301S，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室涂金星教授贈予；該質(zhì)粒載體含有35S啟動子元件、潮霉素抗性元件和GUS基因表達(dá)元件，可用于對陽性植株的篩選和鑒定；

豫麥18、鄭麥366，均為商品化小麥品種；

實(shí)驗(yàn)試劑：

溶液I，每升溶液中的組份為：1M Tris-HCL（pH=8.0）、50mL，0.5M EDTA、20mL，其余為ddH₂O，pH=7.5，高溫滅菌；

溶液II，0.4M 的NaOH的ddH₂O溶液與質(zhì)量濃度2%的SDS的ddH₂O溶液的等體積混合液；0.4M 的NaOH的ddH₂O溶液可由8g NaOH 溶于500mL的ddH₂O中配制而成，質(zhì)量濃度2%的SDS的ddH₂O溶液可由10g SDS溶于500mL的ddH₂O中配制而成；需要強(qiáng)調(diào)的是，溶液II需現(xiàn)配現(xiàn)用；

溶液III，每升溶液的制備方法為：在600mL的ddH₂O中依次加入129.69g的KAc和100mL冰乙酸，溶解并混合均勻后，乙酸調(diào)節(jié)pH=4.8，然后用ddH₂O定容至1L，pH=4.8；

LB培養(yǎng)液：10 g 胰蛋白胨，5 g酵母提取物，10 g NaCl，雙蒸水定容至1000mL（LB平板培養(yǎng)基另外加入15g 瓊脂），高壓滅菌后4℃保存。

實(shí)施例

禾谷鐮刀菌Tri101基因可以編碼一種單端孢酶烯3-O-乙酰轉(zhuǎn)移酶，這種酶可通過加乙?；男问絹斫到獬嗝共《舅兀瑥亩档托←湷嗝共〉陌l(fā)病率。本實(shí)施例以重組有禾谷鐮刀菌Tri101基因的植物表達(dá)載體（重組質(zhì)粒pCAMBIA1301S-Tri101）的大量質(zhì)粒提取和花粉管通道法轉(zhuǎn)化小麥操作為例，對本申請所述小麥花粉管轉(zhuǎn)基因育種方法進(jìn)行了具體介紹。詳細(xì)過程說明如下。

（一）首先，將欲轉(zhuǎn)化基因（目的基因 Tri101基因）片段整合進(jìn)入質(zhì)?；蚪M中，然后，采用熱擊法將含目標(biāo)基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行熱激轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后加入培養(yǎng)液進(jìn)行抗性篩選，以獲得重組菌株。具體過程為：

（1）首先，設(shè)計(jì)引物對，并利用PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得Tri101基因；

根據(jù)Tri101基因序列設(shè)計(jì)如下引物對（引物由上海生工生物工程股份有限公司合成）：

Z-Tri101-F：5′-TCTAGAATGGCTTTCAAGATACAGCT-3′

（5’端TCTAGA序列為引入的XbaI酶切位點(diǎn)），

Z-Tri101-R：5′-GGATCCCTAACCAACGTACTGCGCAT-3′（5’端GGATCC序列為引入的BamHI酶切位點(diǎn)）；

25μL PCR擴(kuò)增體系：

10×Buffer（Mg²⁺ free），2.5 μL；

MgCl₂（25mM），2.5 μL；

dNTP（10mM），0.4 μL；

Z-Tri101-F（10μM），1 μL；

Z-Tri101-R（10μM），1 μL；

rTaq DNA聚合酶（0.5U/μL），0.2 μL

Tri101基因DNA（10ng/μL），6 μL；

ddH₂O，11.4 μL；

擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min, 進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，10℃保持。

PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用DNA凝膠回收試劑盒回收目的DNA片段。

（2）酶切，連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒，具體為：

用XbaI、BamHI雙酶切回收后目的DNA片段，回收約1500 bp左右的片段，與經(jīng)同樣酶切的表達(dá)載體pCAMBIA1301S并回收的酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，在T4連接酶的作用下于16℃過夜連接；

酶切體系設(shè)計(jì)如下：

10×Fast Digest buffer，6μL；

pCAMBIA1301S質(zhì)粒（或PCR擴(kuò)增產(chǎn)物），2μg、20μL；

XbaI，1U/L 、2μL；

BamHI，1U/L 、2μL；

ddH₂O，30 μL；

連接體系設(shè)計(jì)如下：

10×T4 DNA 連接緩沖液，1μL；

Tri101基因片段，7μL；

pCAMBIA1301S載體，1μL；

T4 DNA 連接酶，1μL。

（3）熱擊轉(zhuǎn)化：采用熱擊法將上述連接產(chǎn)物（含有目標(biāo)基因的重組表達(dá)質(zhì)粒）轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，具體轉(zhuǎn)化過程為：

取2μL 含目標(biāo)基因表達(dá)質(zhì)粒加入100 μL感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰上放置10 min；

42℃水浴鍋中熱擊細(xì)胞50 s，迅速放置冰上90 s，然后室溫放置10 min；

向管中加入100 μL預(yù)熱至37℃的LB培養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)1 h（140 r/min振蕩培養(yǎng)），同時(shí)將LB平板置于37℃溫育30 min，然后加入44 μL IPTG/X-gal（4 μL IPTG和40 μL X-gal）均勻涂布于LB平板表面放置片刻，使之吸附滲透；

將37℃培養(yǎng)1 h后的細(xì)胞/SOC培養(yǎng)液加到涂好IPTG/X-gal的LB平板表面放置片刻使之吸附；最后將平板置于37℃培養(yǎng)12~16 h。

培養(yǎng)結(jié)束后，提取質(zhì)粒，送生工生物工程（上海）股份有限公司對重組后的質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序正確的陽性克隆命名為pCAMBIA1301S-Tri101。

（二）采用玻璃珠懸起菌落法快速提取質(zhì)粒

（1）制備細(xì)胞，具體為：

挑取上述鑒定正確的重組表達(dá)載體pCAMBIA1301-Tri101單菌落接種于含有抗性抗生素的液體培養(yǎng)基中，擴(kuò)大培養(yǎng)（具體為，首先接種于2mL含有LB/Kan(Kan的濃度為0.1mg/mL)培養(yǎng)液中，37℃培養(yǎng)3~4h后，于50mL的離心管中擴(kuò)大培養(yǎng)4~6h）；

吸取擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌液涂布于含有抗性抗生素的固體培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)過夜（具體為，吸取擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌液50μL或按4倍稀釋成200μL涂布于新的LB/ Kan平板培養(yǎng)基上（平板直徑15cm，Kan的濃度為0.1mg/mL），37℃過夜培養(yǎng)（12~16h））；

在平板上加入無菌水和滅菌的玻璃珠搖晃，利用玻璃珠懸起菌落（具體為，在上述長滿菌落（過夜培養(yǎng)后，平板培養(yǎng)基中菌落基本可長滿至整個(gè)平板）的培養(yǎng)基中加入4mL滅菌水然后放入滅菌的玻璃珠搖晃）；

待培養(yǎng)基中無菌落殘留時(shí)，用移液槍將含有菌落的無菌水吸出，置于離心管中，離心棄上清，保留沉淀（具體為，分別置于4個(gè)2mL的離心管中，12000 g離心5 min，棄去上清，保留沉淀）；

（2）裂解細(xì)胞，具體為：

在步驟（1）中離心后沉淀中加入600μL溶液I，在震蕩器上劇烈震蕩重懸菌體，靜置5min；

然后加入600μL溶液II，輕輕顛倒數(shù)次，徹底混勻，至溶液變清亮為止，混勻過程中應(yīng)確保離心管的整個(gè)內(nèi)壁與溶液II 充分接觸，混勻后冰上放置5 min；

最后加入600μL溶液III，輕輕顛倒數(shù)次，混勻過程中看到絮狀物時(shí)輕彈離心管使之均勻，同時(shí)，混勻過程中注意使溶液III在粘稠的細(xì)胞裂解物中分散均勻，混合均勻后冰上放置5min；

（3）提取質(zhì)粒，具體為：

將步驟（2）中冰上放置后溶液離心（具體為，4℃、12000 g離心10 min），棄沉淀，取上清液于新的2mL離心管中，加入等體積量的氯仿-異戊醇混合液，混合均勻，放置20min；所述氯仿-異戊醇混合液中，以體積比計(jì)，氯仿：異戊醇=24：1；

將放置后混合液離心（具體為，4℃、12000 g離心10 min），取上清液置于預(yù)先加有無水乙醇的新的2mL離心管中，離心（具體為，4℃、12000 g離心10 min），棄上清，對離心后沉淀物再用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇漂洗兩次后，即為所提取的質(zhì)粒；

離心管中預(yù)先加入的無水乙醇的量為上清液2倍體積的量，所加入無水乙醇為-20℃預(yù)冷的無水乙醇；

所提取的質(zhì)粒在干燥后，溶于1mL TE緩沖液中，測量濃度后稀釋溶解為濃度100 μg/mL， -80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（三）利用花粉管通道法轉(zhuǎn)化受體小麥

具體為：

以河南地區(qū)為例，10月初，將豫麥18和鄭麥366種植在試驗(yàn)田內(nèi)（試驗(yàn)田位于原陽縣），按照正常田間管理；

在小麥開花前，按照常規(guī)雜交育種的方法進(jìn)行整穗、去雄、套袋；在去雄2 ~ 3天后，人工授粉；

在小麥?zhǔn)诜?h后剪去約三分之一的柱頭，然后在剪切后的柱頭上滴加步驟（二）中所提取的質(zhì)粒；每個(gè)柱頭的上質(zhì)粒的滴加量為10μL、100 μg/mL；

在柱頭上初次滴加質(zhì)粒后1h重復(fù)滴加一次；

滴加質(zhì)粒后，套袋，做好標(biāo)記，繼續(xù)培育，自然結(jié)實(shí)后收獲小麥種子。

對所收獲的小麥的種子進(jìn)一步培育、篩選獲得相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株。

（四）小麥陽性單株的鑒定和篩選

對所收獲的小麥種子進(jìn)行陽性單株的鑒定和篩選，主要包括初步的潮霉素抗性篩選、后續(xù)的PCR鑒定以及GUS染色鑒定，鑒定過程中設(shè)置未進(jìn)行花粉管轉(zhuǎn)化的小麥種子豫麥18（CK）和鄭麥366（CK）作為對照。

小麥種植過程中，培育條件為：

光周期為16 小時(shí)光照和8 小時(shí)黑暗，光照強(qiáng)度500μmol/m²/s，

苗期光照時(shí)溫度為20℃、黑暗時(shí)溫度為15℃；

孕穗及灌漿期光照時(shí)溫度為30℃、黑暗時(shí)溫度為20℃。

具體篩選過程和結(jié)果如下：

（1）潮霉素抗性初步篩選

對移栽溫室3周的小麥幼苗，用100mg/L的潮霉素涂抹其第四片葉子，涂抹后繼續(xù)正常培育。一周后，觀察涂抹過潮霉素幼苗葉片的變化。

非轉(zhuǎn)基因單株其涂抹過潮霉素葉片部分開始逐漸黃化，兩周（14天）后黃化面積達(dá)到80%以上；轉(zhuǎn)基因陽性單株涂抹過潮霉素葉片會一直保持綠色生長。

對所有葉片顏色保持綠色的小麥幼苗（初步認(rèn)為其對潮霉素具有抗性）掛牌標(biāo)記。

鑒定結(jié)果如圖1所示，初步表明利用本方法可以將外源DNA轉(zhuǎn)化受體小麥中。

（2）目標(biāo)基因PCR鑒定

對步驟（1）中初步篩選得到的轉(zhuǎn)基因小麥進(jìn)行葉片DNA提取，然后進(jìn)行目標(biāo)基因Tri101 PCR擴(kuò)增鑒定。

PCR擴(kuò)增設(shè)置空載體（質(zhì)粒pCAMBIA1301S）對照和空白對照（水）。

PCR擴(kuò)增引物序列、擴(kuò)增體系及PCR反應(yīng)程序參考前述步驟（一）中Tri101基因的獲得過程。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

相關(guān)結(jié)果如圖2所示，含有Tri101基因的轉(zhuǎn)基因植株可擴(kuò)增出約1500bp的條帶，而空載體對照、陰性對照和空白對照（水）均無目的條帶。

（3）GUS染色鑒定

將PCR鑒定陽性的轉(zhuǎn)基因小麥幼苗葉片浸泡在GUS染液中，37℃染色過夜；然后用70%乙醇脫色2~3次，直至陰性對照材料呈白色。

顯微鏡下觀察，結(jié)果如圖3所示，圖中有顯著藍(lán)色著色的位置即為GUS表達(dá)位點(diǎn)。結(jié)果表明，GUS基因在小麥植株內(nèi)表達(dá)。利用本發(fā)明改進(jìn)后的花粉管介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法可以使外源DNA片段Tri101成功轉(zhuǎn)入受體植株中。

轉(zhuǎn)化頻率和轉(zhuǎn)化效率統(tǒng)計(jì)

統(tǒng)計(jì)各小麥品種的轉(zhuǎn)化效率，結(jié)果如下表所示。其中：轉(zhuǎn)化效率=（獲得T₀ 代PCR陽性植株/成活植株）×100%；

。

上表結(jié)果表明，利用花粉管介導(dǎo)的小麥轉(zhuǎn)基因方法，在豫麥18和鄭麥366為受體的小麥品種中均能得到陽性植株，其轉(zhuǎn)化率分別為0.97%和1.15%。

就基因轉(zhuǎn)化頻率而言，利用現(xiàn)有常規(guī)基因槍轉(zhuǎn)基因方法中，其轉(zhuǎn)化頻率因作為品種及基因形狀差別，轉(zhuǎn)化頻率差別較大，但也普遍低于1.0%。例如，王海風(fēng)等利用基因槍介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法成功的把ZmalI基因?qū)胄←溨仓曛校溆没驑屴Z擊了約3000個(gè)幼胚，獲得再生植株59株，通過PCR檢測鑒定16株為陽性苗，轉(zhuǎn)化率為0.53%（基因槍法介導(dǎo)轉(zhuǎn)ZmalI基因小麥植株的獲得和鑒定.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2011 (8)：90-94）；周鵬等利用基因槍法轟擊約1680個(gè)小偃22幼胚愈傷組織，成功得到轉(zhuǎn)bar基因的陽性植株6株和轉(zhuǎn)KN2基因的陽性植株4株，其轉(zhuǎn)化率分別為0.36%和0.24%（基因槍法介導(dǎo)KN2基因小麥植株的獲得和鑒定.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，42(1)：83-88）；權(quán)軍利等利用高效蔗糖高滲基因槍轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)將HAL1基因成功導(dǎo)入黃淮麥區(qū)3個(gè)優(yōu)良品種（系）小偃一號、千斤早和9848，轉(zhuǎn)化效率平均達(dá)到0.90%左右（普通小麥基因槍轉(zhuǎn)化高效受體系統(tǒng)的建立. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，35(7)：117-122）。

從上述對比可以看出，本申請所提供的轉(zhuǎn)基因操作方法，在不考慮基因本身及作物品種差別時(shí)，基因轉(zhuǎn)化頻率相對較高。同時(shí)，相較于現(xiàn)有基因槍操作方法的較高操作成本而言，本發(fā)明通過改進(jìn)質(zhì)粒提取操作方法，優(yōu)化操作流程，在較好降低操作成本的同時(shí)，省工省時(shí)省力，較好提高了工作效率。加上花粉管介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因操作方法在規(guī)?；r(nóng)作物遺傳育種中的天然優(yōu)勢，使得本申請?jiān)谛←溞缕贩N培育中具有較好地應(yīng)用價(jià)值。