（一）技術領域
本發(fā)明涉及一種乳酸菌，特別涉及一種乳酸菌雜交菌種及其制備方法。
（二）
背景技術：
市場上發(fā)酵酸奶所用乳酸菌有多種，保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌等，主要用其中的2種、3種或4種菌種通過合適比例的添加來發(fā)酵酸奶，這些乳酸菌生長特點各異，都需要厭氧高溫培養(yǎng)。所以，對菌種的保藏、繁育是乳酸菌生產(chǎn)廠家比較繁重的一項工作。另外，在酸奶發(fā)酵生產(chǎn)過程中，不同菌種配比的不同對最終酸奶的風味、口感影響很大，配比一旦出現(xiàn)問題，會直接導致酸奶風味、口感的不穩(wěn)定，影響市場銷售和聲譽。
要解決這些問題，可以對多種乳酸菌進行雜交，使多種菌的優(yōu)良性狀融合于一株菌上，這樣，就可以省卻很多菌種保藏的工作，也可以使得用這種雜合菌發(fā)酵所得的酸奶長期保持穩(wěn)定的優(yōu)良特性。
關于乳酸菌的雜交，張莉滟等做過雙歧桿菌與乳桿菌原生質(zhì)體的融合及篩選,改良了雙歧桿菌嚴格厭氧的特性，陳軍等做過產(chǎn)粘瑞士乳桿菌與保加利亞乳桿菌的融合實驗，獲得了表觀粘度優(yōu)于親本的融合菌株。但通過融合后能夠兼?zhèn)溆H株優(yōu)點，提高發(fā)酵酸奶品質(zhì)，簡化酸奶制作流程的融合菌株卻缺乏報道。
本專利就是針對這個問題，對生產(chǎn)中常用的保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌進行了原生質(zhì)體電融合，獲得了子代穩(wěn)定的融合菌株，用其發(fā)酵酸奶，品質(zhì)優(yōu)于親本。
（三）
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明為了彌補現(xiàn)有技術的不足，提供了一種乳酸菌雜交菌種及其制備方法，使多種乳酸菌的優(yōu)良性狀融合于一株菌上，這樣，就可以省卻很多菌種保藏的工作，也可以使得用這種雜合菌發(fā)酵所得的酸奶長期保持穩(wěn)定的優(yōu)良特性。
本發(fā)明是通過如下技術方案實現(xiàn)的：
一種乳酸菌雜交菌種，其特殊之處在于：利用保加利亞乳桿菌菌種、嗜熱鏈球菌菌種通過電融合得到乳酸菌雜交菌種。
所述的乳酸菌雜交菌種，編號cgmccno：12911，保藏單位為cgmcc-中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏時間為2016年08月29日，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，郵編100101。
所述的乳酸菌雜交菌種的制備方法，包括以下步驟：
a)菌種活化：保藏的保加利亞乳桿菌菌種、嗜熱鏈球菌菌種活化備用；
b)原生質(zhì)體制備：（1）取培養(yǎng)至對數(shù)期的菌液，冰水??；（2）取3-5ml菌液于離心管中，離心，棄上清；（3）加3-5ml生理鹽水，搖勻，離心，棄上清；（4）加3-5ml原生質(zhì)體穩(wěn)定液，搖勻，離心，棄上清，該步驟重復n次；（5）加4-6ml過濾酶液，32-42℃水浴，離心，棄上清；（6）加3-5ml原生質(zhì)體穩(wěn)定液，搖勻，離心，棄上清，該步驟重復n次；（7）加3-5ml原生質(zhì)體穩(wěn)定液，制成原生質(zhì)體懸液，備用，
c)原生質(zhì)體融合：（1）電擊杯無菌處理；（2）取保加利亞乳桿菌，嗜熱鏈球菌紫外誘變致死率剛好在100%的菌株懸液按1:0.8-1.2混合均勻，無菌操作；（3）設置好電擊參數(shù)進行電融合；（4）將電擊融合的菌懸液傾注倒平板，36-46℃下培養(yǎng)，觀察、分離純化出融合菌種。
所述的乳酸菌雜交菌種的制備方法，優(yōu)選方案：
a)菌種活化：保藏的保加利亞乳桿菌菌種、嗜熱鏈球菌菌種活化若干次備用，活化條件為：36-46℃厭氧培養(yǎng)24-72h；
b)原生質(zhì)體制備：（1）取培養(yǎng)至對數(shù)期的菌液，冰水浴10-30min；（2）取3-5ml菌液于離心管中，1500-4500r/min離心5-15min，棄上清；（3）加3-5ml生理鹽水，搖勻，1500-4500r/min離心5-15min，棄上清；（4）加3-5ml原生質(zhì)體穩(wěn)定液，搖勻，1500-4500r/min離心5-15min，棄上清，該步驟重復n次；（5）加4-6ml過濾酶液，32-42℃水浴10-30min，2000-6000r/min離心5-15min，棄上清；（6）加3-5ml原生質(zhì)體穩(wěn)定液，搖勻，2000-6000r/min離心5-15min，棄上清，該步驟重復n次；（7）加3-5ml原生質(zhì)體穩(wěn)定液，制成原生質(zhì)體懸液，備用，
c)原生質(zhì)體融合：（1）電擊杯/0.1cm無菌處理；（2）取保加利亞乳桿菌，嗜熱鏈球菌紫外誘變致死率剛好在100%的菌株懸液按1:0.8-1.2混合均勻，無菌操作加入電擊杯0.2-0.4ml；（3）設置好電擊參數(shù)進行電融合，電壓：2-3kv，脈沖次數(shù)：1次，電擊時間：1-3ms；（4）將電擊融合的菌懸液傾注倒平板，36-46℃無氧條件下培養(yǎng)16-32h，觀察、分離純化出融合菌種。
所述的乳酸菌雜交菌種的制備方法，更有方案：
a)菌種活化：保藏菌種活化3次備用，活化條件為：36-46℃厭氧培養(yǎng)24-72h；
b)原生質(zhì)體制備：（1）取培養(yǎng)至對數(shù)期的菌液，冰水浴20min；（2）取4ml菌液于離心管中，3000r/min離心10min，棄上清；（3）加4ml生理鹽水，搖勻，3000r/min離心10min，棄上清；（4）加４ml原生質(zhì)體穩(wěn)定液，搖勻，3000r/min離心10min，棄上清，再重復該步驟一次；（5）加5ml過濾酶液，37℃水浴20min，4000r/min離心10min，棄上清；（6）加４ml原生質(zhì)體穩(wěn)定液，搖勻，4000r/min離心10min，棄上清，再重復該步驟一次；（7）加４ml原生質(zhì)體穩(wěn)定液，制成原生質(zhì)體懸液，備用，
c)原生質(zhì)體融合：（1）電擊杯/0.１cm無菌處理；（2）取保加利亞乳桿菌，嗜熱鏈球菌紫外誘變致死率剛好在100%的菌株懸液按1:1混合均勻，無菌操作加入電擊杯0.3ml；（3）設置好電擊參數(shù)進行電融合，電壓：2.5kv，脈沖次數(shù)：1次，電擊時間：2ms；（4）將電擊融合的菌懸液傾注倒平板，42℃無氧條件下培養(yǎng)24h，觀察、分離純化出融合菌種。
其中，
原生質(zhì)體穩(wěn)定液：甘露醇與磷酸鹽緩沖液/pbs混合液，其中，甘露醇濃度為0.7-0.9mol/l，甘露醇濃度優(yōu)選0.8mol/l，
酶液：80-120mg溶菌酶20000u/mg+20ml磷酸鹽緩沖液/pbs，微孔濾膜過濾后備用，優(yōu)選，100mg溶菌酶20000u/mg+20ml0.2mol/l的磷酸鹽緩沖液/pbs，用0.22μm的微孔濾膜過濾后備用。
磷酸鹽緩沖液/pbs：磷酸鹽緩沖液/pbs：565-935ml0.2mol/lnah2po4+65-435ml0.2mol/lna2hpo4，ph5.7-6.7，優(yōu)選，磷酸鹽緩沖液/pbs：877ml0.2mol/lnah2po4+123ml0.2mol/lna2hpo4，ph6。
菌種活化過程中，通過再生固體培養(yǎng)基培養(yǎng)。
原生質(zhì)體融合過程步驟（4）中，將電擊融合的菌懸液先混入再生半固體培養(yǎng)基內(nèi)，然后再傾注倒平板至再生固體培養(yǎng)基上，觀察、分離純化出融合菌種，培養(yǎng)溫度均為36-46℃，
其中，
再生固體培養(yǎng)基（1500ml）：葡萄糖7-8g，酵母浸粉7-8g，胰蛋白胨7-8g，l-cys鹽酸鹽0.4-0.8g，乳糖6-7.5g，乙酸鈉14-16g，瓊脂22-23g，kh2po43-4.2g，cacl2·2h2o5.5-6.5g，mgcl2·6h2o27-28g，ph6-7；
再生半固體培養(yǎng)基（1500ml）：葡萄糖7-8g，酵母浸粉7-8g，胰蛋白胨7-8g，l-cys鹽酸鹽0.4-0.8g，乳糖6-7.5g，乙酸鈉14-16g，瓊脂11-16.5g，kh2po43-4.2g，cacl2·2h2o5.5-6.5g，mgcl2·6h2o27-28g，ph6-7。
一種乳酸菌雜交菌種制備酸奶的方法，包括以下步驟：將融合菌種接種至裝有無菌純奶的錐形瓶中，36-46℃培養(yǎng)16-32h制備酸奶。
一種酸奶酸度的測定方法，包括以下步驟：取10ml酸乳，用20ml蒸餾水稀釋。加入0.5%的中性酚酞指示劑0.5ml，以0.1mol/lnaoh溶液滴定至粉紅色（30s內(nèi)不變色），將所消耗的naoh毫升數(shù)乘以10，即為酸奶的酸度，所述酸奶的酸度用吉爾涅爾度°t表示。
本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明對生產(chǎn)中常用的保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌進行了原生質(zhì)體電融合，獲得了子代穩(wěn)定的融合菌株，品質(zhì)優(yōu)于親本，簡化了菌種保藏流程，將其用于發(fā)酵酸奶，大大改善了酸奶風味，簡化了酸奶生產(chǎn)流程，而且保證了酸奶長期風味穩(wěn)定。
（四）具體實施方式
實施例1
1.菌種：保藏的保加利亞乳桿菌菌種、嗜熱鏈球菌菌種。
2.試劑
磷酸鹽緩沖液/pbs(0.2mol/l)：877ml0.2mol/lnah2po4+123ml0.2mol/lna2hpo4，ph6。
原生質(zhì)體穩(wěn)定液：含0.8mol/l甘露醇的0.2mol/l的磷酸鹽緩沖液/pbs。
酶液（5mg/ml）：100mg溶菌酶（20000u/mg）+20ml0.2mol/l的磷酸鹽緩沖液/pbs，用0.22μm的微孔濾膜過濾后備用。
蒙牛純牛奶：制作酸奶用。
3.儀器設備：mjx智能霉菌培養(yǎng)箱（mjx型，寧波江南儀器廠），全溫振動器（hzq-y型，哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司）、高速臺式離心機（tgl-16c，上海安亭科學儀器廠）、電穿孔儀genepulser（bio-rad型，伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司）、電擊杯（0.1cm）高壓蒸汽滅菌器（mls-3780，三洋電機株式會社）、雙人垂直超凈工作臺（vj-vs-2型，無錫一凈凈化設備有限公司）、電子精密天平（cav4102c型，奧豪斯中國地區(qū)）、紫外可見分光光度計（tu-1810，）、移液槍（brandtransferpetted-1000、d-5000型，普蘭德（上海）貿(mào)易有限公司）、ph計（phs-3c型，上海精密科學儀器有限公司）。
4.培養(yǎng)基
（1）再生固體培養(yǎng)基（1500ml）葡萄糖7.5g，酵母浸粉7.5g，胰蛋白胨7.5g，l-cys鹽酸鹽0.6g，乳糖6.75g，乙酸鈉15g，瓊脂22.5g，kh2po43.75g，cacl2·2h2o5.67g，mgcl2·6h2o27.5g，ph6.5。
（2）再生半固體培養(yǎng)基：除瓊脂減半外，其他成分同培養(yǎng)基（１），ph6.5。
（3）雙層再生培養(yǎng)基：將菌液混入再生半固體培養(yǎng)基內(nèi)，傾注倒平板至再生固體培養(yǎng)基上。
5.方法
5.1菌種活化：保藏菌種活化3次，備用，活化條件：42℃厭氧培養(yǎng)48h，通過再生固體培養(yǎng)基培養(yǎng)。
5.2原生質(zhì)體制備方法：（1）取培養(yǎng)至對數(shù)期的菌液，冰水浴20min。（2）取4ml菌液于離心管中，離心（3000r/min）10min，棄上清。（3）加4ml生理鹽水，搖勻，3000r/min離心10min，棄上清，其中，生理鹽水為0.9%的氯化鈉水溶液。（4）加４ml原生質(zhì)體穩(wěn)定液，搖勻，3000r/min離心10min，棄上清。（該步驟再重復一次）。（5）加5ml過濾酶液，37℃水浴20min，4000r/min離心10min，棄上清。（6）加４ml原生質(zhì)體穩(wěn)定液，搖勻，4000r/min離心10min，棄上清。（該步驟再重復一次）。（7）加４ml原生質(zhì)體穩(wěn)定液，制成原生質(zhì)體懸液，備用。
5.3原生質(zhì)體融合：（1）電擊杯/0.１cm無菌處理。（2）加入菌懸液，將不同乳酸菌的原生質(zhì)體懸液濃度調(diào)到1×106個/ml進行混菌融合（取保加利亞乳桿菌，嗜熱鏈球菌紫外誘變致死率剛好在100%的菌株懸液按1:1混合均勻，無菌操作加入電擊杯0.3ml。）（3）設置好電擊參數(shù)進行電融合（電壓：2.5kv；脈沖次數(shù)：1次；電擊時間：2ms。）（4）將電擊融合的菌懸液先混入再生半固體培養(yǎng)基內(nèi)，然后再傾注倒平板至再生固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察、分離純化出融合菌種，培養(yǎng)條件均為：42℃無氧條件下培養(yǎng)24h。
5.4酸奶的制作
（1）分別將定量的親本菌種和融合菌種（菌懸液濃度為1×106個/ml，接種量為10%，）接種至裝有無菌純奶的錐形瓶中，42℃培養(yǎng)24h。從酸、澀、風味、酸度、ph值5個方面來比較酸奶風味。
（2）酸奶酸度的測定：酸奶的酸度用吉爾涅爾度（°t）表示。
方法：取10ml酸乳，用20ml蒸餾水稀釋。加入0.5%的中性酚酞指示劑0.5ml，以0.1mol/lnaoh溶液滴定至粉紅色（30s內(nèi)不變色），將所消耗的naoh毫升數(shù)乘以10，即為酸奶的酸度。
（3）ph值測定：用ph計測定酸奶的ph值。
（4）對制作好的酸奶進行感官評定。
表1：感官評定標準
6.結(jié)果
6.1融合菌大小
二菌融合菌株呈鏈狀，桿球混合鏈狀，直徑0.5-0.8μm，長2-6μm，寬0.4-0.7μm。
表2親本菌株與融合菌大小比較
6.2.發(fā)酵酸奶結(jié)果
表3：親本菌株與融合菌發(fā)酵酸奶結(jié)果
6.3對融合菌株及親本菌株進行測序鑒定
結(jié)果如下：
（1）融合菌株（fusantxu1lactobacillussp.）的16sdna序列
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（2）親本菌株保加利亞乳桿菌的16sdna序列
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（3）親本菌株嗜熱鏈球菌的16sdna序列
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通過序列比對，融合菌株與兩親本菌株的16sdna序列存在較大差異。
通過繪制發(fā)育樹分析，融合菌株與兩個親本菌株相差甚大。說明親本菌株發(fā)生了融合，產(chǎn)生了雜交的乳酸菌。
實施例2
1.菌種：保藏的保加利亞乳桿菌菌種、嗜熱鏈球菌菌種。
2.試劑
磷酸鹽緩沖液/pbs：935ml0.2mol/lnah2po4+65ml0.2mol/lna2hpo4，ph5.7。
原生質(zhì)體穩(wěn)定液：甘露醇與磷酸鹽緩沖液/pbs混合液，甘露醇含0.7mol/l。
酶液（4.5mg/ml）：90mg溶菌酶（20000u/mg）+20ml磷酸鹽緩沖液/pbs，用0.22μm的微孔濾膜過濾后備用。
蒙牛純牛奶：制作酸奶用。
3.儀器設備：mjx智能霉菌培養(yǎng)箱（mjx型，寧波江南儀器廠），全溫振動器（hzq-y型，哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司）、高速臺式離心機（tgl-16c，上海安亭科學儀器廠）、電穿孔儀genepulser（bio-rad型，伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司）、電擊杯（0.1cm）高壓蒸汽滅菌器（mls-3780，三洋電機株式會社）、雙人垂直超凈工作臺（vj-vs-2型，無錫一凈凈化設備有限公司）、電子精密天平（cav4102c型，奧豪斯中國地區(qū)）、紫外可見分光光度計（tu-1810，）、移液槍（brandtransferpetted-1000、d-5000型，普蘭德（上海）貿(mào)易有限公司）,ph計（phs-3c型，上海精密科學儀器有限公司）。
4.培養(yǎng)基
（1）再生固體培養(yǎng)基（1500ml）葡萄糖7g，酵母浸粉8g，胰蛋白胨7g，l-cys鹽酸鹽0.8g，乳糖6g，乙酸鈉16g，瓊脂22g，kh2po44.2g，cacl2·2h2o5.5g，mgcl2·6h2o28g，ph6。
（2）再生半固體培養(yǎng)基：除瓊脂減半外，其他成分同培養(yǎng)基（１），ph6。
（3）雙層再生培養(yǎng)基：將菌液混入再生半固體培養(yǎng)基內(nèi)，傾注倒平板至再生固體培養(yǎng)基上。
5.方法
5.1菌種活化：保藏菌種活化3次，備用，活化條件：36℃厭氧培養(yǎng)72h，通過再生固體培養(yǎng)基培養(yǎng)。
5.2原生質(zhì)體制備方法：（1）取培養(yǎng)至對數(shù)期的菌液，冰水浴10min。（2）取3ml菌液于離心管中，離心（4500r/min）15min，棄上清。（3）加3ml生理鹽水，搖勻，4500r/min離心15min，棄上清。（4）加3ml原生質(zhì)體穩(wěn)定液，搖勻，1500r/min離心15min，棄上清。（該步驟再重復一次）。（5）加4ml過濾酶液，42℃水浴10min，2000r/min離心15min，棄上清。（6）加3ml原生質(zhì)體穩(wěn)定液，搖勻，6000r/min離心5min，棄上清。（該步驟再重復一次）。（7）加3ml原生質(zhì)體穩(wěn)定液，制成原生質(zhì)體懸液，備用。
5.3原生質(zhì)體融合：（1）電擊杯/0.１cm無菌處理。（2）加入菌懸液，將不同乳酸菌的原生質(zhì)體懸液濃度調(diào)到1×106個/ml進行混菌融合（取保加利亞乳桿菌，嗜熱鏈球菌紫外誘變致死率剛好在100%的菌株懸液按1:0.8混合均勻，無菌操作加入電擊杯0.2ml。）（3）設置好電擊參數(shù)進行電融合（電壓：3kv；脈沖次數(shù)：1次；電擊時間：3ms。）（4）將電擊融合的菌懸液先混入再生半固體培養(yǎng)基內(nèi)，然后再傾注倒平板至再生固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察、分離純化出融合菌種，培養(yǎng)條件均為：36℃無氧條件下培養(yǎng)32h。
5.4酸奶的制作
（1）分別將定量的親本菌種和融合菌種（菌懸液濃度為1×106個/ml，接種量為10%，）接種至裝有無菌純奶的錐形瓶中，36℃培養(yǎng)32h。從酸、澀、風味、酸度、ph值5個方面來比較酸奶風味。
（2）酸奶酸度的測定：酸奶的酸度用吉爾涅爾度（°t）表示。
方法：取10ml酸乳，用20ml蒸餾水稀釋。加入0.5%的中性酚酞指示劑0.5ml，以0.1mol/lnaoh溶液滴定至粉紅色（30s內(nèi)不變色），將所消耗的naoh毫升數(shù)乘以10，即為酸奶的酸度。
（3）ph值測定：用ph計測定酸奶的ph值。
（4）對制作好的酸奶進行感官評定，如表1所述。
實施例3
1.菌種：保藏的保加利亞乳桿菌菌種、嗜熱鏈球菌菌種。
2.試劑
磷酸鹽緩沖液/pbs：565ml0.2mol/lnah2po4+435ml0.2mol/lna2hpo4，ph6.7。
原生質(zhì)體穩(wěn)定液：甘露醇與磷酸鹽緩沖液/pbs混合液，含甘露醇0.9mol/l。
酶液（5.5mg/ml）：110mg溶菌酶（20000u/mg）+20ml磷酸鹽緩沖液/pbs，用0.22μm的微孔濾膜過濾后備用。
蒙牛純牛奶：制作酸奶用。
3.儀器設備：mjx智能霉菌培養(yǎng)箱（mjx型，寧波江南儀器廠），全溫振動器（hzq-y型，哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司）、高速臺式離心機（tgl-16c，上海安亭科學儀器廠）、電穿孔儀genepulser（bio-rad型，伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司）、電擊杯（0.1cm）高壓蒸汽滅菌器（mls-3780，三洋電機株式會社）、雙人垂直超凈工作臺（vj-vs-2型，無錫一凈凈化設備有限公司）、電子精密天平（cav4102c型，奧豪斯中國地區(qū)）、紫外可見分光光度計（tu-1810，）、移液槍（brandtransferpetted-1000、d-5000型，普蘭德（上海）貿(mào)易有限公司）、ph計（phs-3c型，上海精密科學儀器有限公司）。
4.培養(yǎng)基
（1）再生固體培養(yǎng)基（1500ml）葡萄糖8g，酵母浸粉7g，胰蛋白胨8g，l-cys鹽酸鹽0.4g，乳糖7.5g，乙酸鈉14g，瓊脂23g，kh2po43g，cacl2·2h2o6.5g，mgcl2·6h2o27g，ph7。
（2）再生半固體培養(yǎng)基：除瓊脂減半外，其他成分同培養(yǎng)基（１），ph7。
（3）雙層再生培養(yǎng)基：將菌液混入再生半固體培養(yǎng)基內(nèi)，傾注倒平板至再生固體培養(yǎng)基上。
5.方法
5.1菌種活化：保藏菌種活化3次，備用，活化條件：46℃厭氧培養(yǎng)24h，通過再生固體培養(yǎng)基培養(yǎng)。
5.2原生質(zhì)體制備方法：（1）取培養(yǎng)至對數(shù)期的菌液，冰水浴30min。（2）取5ml菌液于離心管中，離心（1500r/min）5min，棄上清。（3）加5ml生理鹽水，搖勻，1500r/min離心5min，棄上清。（4）加5ml原生質(zhì)體穩(wěn)定液，搖勻，4500r/min離心5min，棄上清。（該步驟再重復一次）。（5）加6ml過濾酶液，32℃水浴30min，6000r/min離心5min，棄上清。（6）加5ml原生質(zhì)體穩(wěn)定液，搖勻，2000r/min離心15min，棄上清。（該步驟再重復一次）。（7）加5ml原生質(zhì)體穩(wěn)定液，制成原生質(zhì)體懸液，備用。
5.3原生質(zhì)體融合：（1）電擊杯/0.１cm無菌處理。（2）加入菌懸液，將不同乳酸菌的原生質(zhì)體懸液濃度調(diào)到1×106個/ml進行混菌融合（取保加利亞乳桿菌，嗜熱鏈球菌紫外誘變致死率剛好在100%的菌株懸液按1:1.2混合均勻，無菌操作加入電擊杯0.4ml。）（3）設置好電擊參數(shù)進行電融合（電壓：2kv；脈沖次數(shù)：1次；電擊時間：1ms。）（4）將電擊融合的菌懸液先混入再生半固體培養(yǎng)基內(nèi)，然后再傾注倒平板至再生固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察、分離純化出融合菌種，培養(yǎng)條件均為：46℃無氧條件下培養(yǎng)16h。
5.4酸奶的制作
（1）分別將定量的親本菌種和融合菌種（菌懸液濃度為1×106個/ml，接種量為10%，）接種至裝有無菌純奶的錐形瓶中，46℃培養(yǎng)16h。從酸、澀、風味、酸度、ph值5個方面來比較酸奶風味。
（2）酸奶酸度的測定：酸奶的酸度用吉爾涅爾度（°t）表示。
方法：取10ml酸乳，用20ml蒸餾水稀釋。加入0.5%的中性酚酞指示劑0.5ml，以0.1mol/lnaoh溶液滴定至粉紅色（30s內(nèi)不變色），將所消耗的naoh毫升數(shù)乘以10，即為酸奶的酸度。
（3）ph值測定：用ph計測定酸奶的ph值。
（4）對制作好的酸奶進行感官評定，如表1所述。
實施例4
磷酸鹽緩沖液/pbs：815ml0.2mol/lnah2po4+185ml0.2mol/lna2hpo4，ph6.2。
原生質(zhì)體穩(wěn)定液：甘露醇與磷酸鹽緩沖液/pbs混合液，其含甘露醇0.8mol/l。
酶液（4mg/ml）：80mg溶菌酶（20000u/mg）+20ml磷酸鹽緩沖液/pbs，用0.22μm的微孔濾膜過濾后備用。
實施例5
磷酸鹽緩沖液/pbs：900ml0.2mol/lnah2po4+100ml0.2mol/lna2hpo4，ph5.9。
原生質(zhì)體穩(wěn)定液：甘露醇與磷酸鹽緩沖液/pbs混合液，其含甘露醇0.82mol/l。
酶液（5mg/ml）：100mg溶菌酶（20000u/mg）+20ml磷酸鹽緩沖液/pbs，用0.22μm的微孔濾膜過濾后備用。
實施例6
磷酸鹽緩沖液/pbs：735ml0.2mol/lnah2po4+265ml0.2mol/lna2hpo4，ph6.4。
原生質(zhì)體穩(wěn)定液：甘露醇與磷酸鹽緩沖液/pbs混合液，其含甘露醇0.78mol/l。
酶液（5mg/ml）：100mg溶菌酶（20000u/mg）+20ml磷酸鹽緩沖液/pbs，用0.22μm的微孔濾膜過濾后備用。
實施例7
磷酸鹽緩沖液/pbs：900ml0.2mol/lnah2po4+100ml0.2mol/lna2hpo4，ph5.9。
原生質(zhì)體穩(wěn)定液：甘露醇與磷酸鹽緩沖液/pbs混合液，其含甘露醇0.78mol/l。
酶液（6mg/ml）：120mg溶菌酶（20000u/mg）+20ml磷酸鹽緩沖液/pbs，用0.22μm的微孔濾膜過濾后備用。
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<110>菏澤學院
<120>一種乳酸菌雜交菌種及其制備方法
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