本發(fā)明涉及一株新篩選的紅細菌，該菌株能夠通過生物脫硫作用利用硫化物作為電子供體獲取能量，實現(xiàn)硫化物的去除，適用于含硫化物的廢水、天然氣及沼氣脫硫。屬于生物與環(huán)保技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

由于硫化氫氣體具有毒性，臭雞蛋氣味以及對金屬設(shè)備具有腐蝕性，所以國家環(huán)保部規(guī)定廢氣中硫化物須達到符合商業(yè)銷售和安全輸送及使用規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)方可排放。因此，在工程實施的過程中，必須采取安全有效的措施控制硫化物向周邊環(huán)境中的釋放，一般采取的方法為物理法、化學(xué)法和生物法。

傳統(tǒng)的脫硫工藝常使用化學(xué)法來脫除硫化物，但由于需要不斷地消耗脫硫劑，運行成本較高。而生物脫硫技術(shù)主要依靠能夠自我繁殖的微生物來催化脫硫，脫硫劑可以自我再生，運行成本較低，具有廣闊的應(yīng)用前景。

生物脫硫的核心是脫硫微生物。目前文獻報道的大多數(shù)菌株都適用于專一性的脫除有機硫，但單一性的脫除硫化物(H₂S)的菌株雖有報道，但大多存在一些問題，例如菌株的營養(yǎng)類型單一。如一株那不勒斯硫桿菌及其在生物脫硫中的應(yīng)用(申請?zhí)枺?01410179292.X)，該菌在一定條件下，對還原態(tài)的硫化物、單質(zhì)硫及硫代硫酸鹽有較強的氧化能力，但該菌處理硫代硫酸鹽廢水的時候需要24h才能可實現(xiàn)99％的去除，相比本發(fā)明涉及的一株脫硫紅細菌要略顯不足。

因此迫切需要一些高效低成本、脫硫效果迅速的微生物脫硫菌株來改進生物脫硫工藝。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有脫硫菌株存在的問題和不足，提供一株高效快速脫硫菌株及其應(yīng)用，該菌株能夠通過生物脫硫作用利用硫化物作為電子供體獲取能量，實現(xiàn)硫化物的去除，適用于含硫化物的廢水、天然氣及沼氣脫硫。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供了一株硫氧化細菌，紅細菌(Rhodobacter sp.)DS-17，于2016年06月16日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101)，保藏編號為：CGMCC No.12631。

本發(fā)明提供的紅細菌(Rhodobacter sp.)DS-17從成都市長安垃圾填埋場滲濾液中篩選得到，篩選方法為：采用硫代硫酸鈉培養(yǎng)基富集馴化7天，然后取馴化液利用硫化鈉培養(yǎng)基進行平板分離，3～4天后菌落生成，挑取單菌落接入硫化鈉培養(yǎng)基培養(yǎng)，重復(fù)4次以上獲得純菌。該菌命名為DS-17，革蘭氏染色為陰性，細胞形態(tài)為桿狀，長2.0～6.0μm，寬0.8～1.2μm。菌落顏色為淡黃色，其生理特點為：該菌生長pH為5.0～8.5，最適pH為7.0，生長溫度為20～35℃，最適溫度為30℃。該菌營養(yǎng)類型為兼性營養(yǎng)型，能利用牛肉膏、蛋白胨和酵母粉等有機碳源進行異養(yǎng)快速生長，也能利用二氧化碳為唯一碳源進行自養(yǎng)生長；在以二氧化碳為唯一碳源進行自養(yǎng)生長時，該菌能夠利用氧氣將硫化物氧化為單質(zhì)硫或硫酸鹽。

2HS^-+O₂→2S+2OH^-

HS^-+2O₂→SO₄^2-+H⁺

本發(fā)明的另一目的提供了紅細菌菌株DS-17在生物脫硫中的應(yīng)用，脫硫效果驗證顯示，該菌株在自養(yǎng)條件下4.5h內(nèi)實現(xiàn)了99.85％的硫化物去除，58.06％的單質(zhì)硫轉(zhuǎn)化率。

本發(fā)明提供了在菌株篩選和培養(yǎng)過程中使用到的培養(yǎng)基，其培養(yǎng)基配方均為在篩菌過程中優(yōu)化得到的：(1)硫化鈉培養(yǎng)基，用于菌株篩選和脫硫效果實驗，其配方為：Na₂S.9H₂O 10.0g，KH₂PO₄ 1.0g，K₂HPO₄ 1.0g，NH₄Cl 0.2g，MgCl₂ 0.2g，NaHCO₃ 1.0g，微量元素溶液1ml，維生素溶液1ml。用1mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH至中性。(2)硫代硫酸鈉培養(yǎng)基，用于富培養(yǎng)集，培養(yǎng)基配方為：Na₂S₂O₃.5H₂O 10.0g，KH₂PO₄ 1.0g，K₂HPO₄ 1.0g，NH₄Cl 0.2g，MgCl₂ 0.2g，NaHCO₃ 1.0g，微量元素溶液1ml，維生素溶液1ml。用1mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至中性。(3)有機碳源異養(yǎng)培養(yǎng)基，用于擴大培養(yǎng)和驗證該菌的營養(yǎng)類型：牛肉膏5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、氯化鈉5.0g/L，pH 7.0～7.2。

本發(fā)明提供了上述菌株的16SrDNA鑒定結(jié)果。經(jīng)過16SrDNA鑒定及BLAST比對，DS-17與紅細菌屬的同源性達到了99％，因此鑒定該菌株為紅細菌(Rhodobacter sp.)DS-17。本發(fā)明提供的紅細菌(Rhodobacter sp.DS-17)的16SrDNA基因序列如SEQ ID No.1所示：

GCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAACGTACCCTTTGGTACGGAATAGCCCCGGGAAACTGGGAGTAATACCGTATGGTGTCTTCGGACTAAAGATTTATCGCCAAAGGATCGGCCCGCGTTGGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGCCGACGATCCATAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTAGACAATGGGCGCAAGCCTGATCTAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCAGCTGGGAAGATAATGACGGTACCAGCAGAAGAAGCCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGATTGAAAAGTTGGGGGTGAAATCCCGGGGCTCAACCTCGGAACTGCCTTCAAAACTATCAGTCTGGAGTTCGAGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCTCGATACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCCAGTCGTCGGGCAGCATGCTGTTCGGTGACACACCTAACGGATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAACCCTTGACATGGTGATCGTAGTTTCCAGAGATGGATTCGTCAGTTCGGCTGGATCACACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTCGGTTAAGTCCGGCAACGAGCGCAACCCACGTCCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAGGGAAACTGCCGATGATAAGTCGGAGGAAGGTGTGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTAGTGACAATGGGATAATCCCCAAAAGCTATCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGTAACAGCATGACGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGGTCTACCCGAAGGTGGTGCGCTA

本發(fā)明涉及的生物材料相關(guān)保藏信息為：

保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所；保藏日期：2016年06月16日；保藏編號：CGMCC No.12631；命名為：紅細菌(Rhodobacter sp.)DS-17。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：

(1)本發(fā)明涉及的紅細菌的營養(yǎng)類型為兼性營養(yǎng)型，在異養(yǎng)條件下實現(xiàn)菌體的快速繁殖，在自養(yǎng)條件下實現(xiàn)高效脫硫。利用有機碳源異養(yǎng)培養(yǎng)基對菌株進行擴大培養(yǎng)獲得高密度菌體，用于實現(xiàn)生物脫硫工程的快速啟動。

(2)本發(fā)明涉及的紅細菌的脫硫速率較快，自養(yǎng)條件下，4.5h硫化物去除率可達到99.85％，能夠在去除過程中將硫化物轉(zhuǎn)化為可回收的單質(zhì)硫，硫轉(zhuǎn)化率為58.06％；

(3)本發(fā)明涉及的紅細菌能夠耐受較高濃度的硫化物，自養(yǎng)脫硫條件下耐受的硫(S^2-)濃度高達1079.13mg/L。

(4)符合生物安全法規(guī)，本發(fā)明涉及的紅細菌菌株從被高硫化物長期脅迫的選擇環(huán)境中篩選得到，不會對周圍環(huán)境和生態(tài)平衡造成危害。

附圖說明

圖1本發(fā)明紅細菌DS-17在掃描電子顯微鏡下的細胞形態(tài)。

圖2本發(fā)明涉及的紅細菌DS-17的在異養(yǎng)和自養(yǎng)條件下培養(yǎng)的生長曲線，其中：(a)紅細菌DS-17在自養(yǎng)條件下的生長曲線，(b)紅細菌DS-17在異養(yǎng)條件下的生長曲線。

圖3本發(fā)明紅細菌DS-17在脫硫效果實驗過程中各因素的變化情況，其中：(a)硫化物去除率的變化，(b)單質(zhì)硫濃度變化情況。

圖4本發(fā)明紅細菌DS-17脫硫形成的單質(zhì)硫在掃描電鏡(SEM)下的形態(tài)。

具體實施方式

以下結(jié)合實施例詳細說明本發(fā)明。實施方案方便于更好的理解本發(fā)明，但并非對本發(fā)明的限制。

實施例中涉及到的培養(yǎng)基配方為：

(1)硫化鈉培養(yǎng)基，配方為：Na₂S.9H₂O 10.0g，KH₂PO₄ 1.0g，K₂HPO₄ 1.0g，NH₄Cl 0.2g，MgCl₂ 0.2g，NaHCO₃ 1.0g，微量元素溶液1ml，維生素溶液1ml。用1mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH至中性。

(2)硫代硫酸鈉培養(yǎng)基，配方為：Na₂S₂O₃.5H₂O 10.0g，KH₂PO₄ 1.0g，K₂HPO₄ 1.0g，NH₄Cl 0.2g，MgCl₂ 0.2g，NaHCO₃ 1.0g，微量元素溶液1ml，維生素溶液1ml。用1mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至中性。

(3)有機碳源異養(yǎng)培養(yǎng)基，配方為：牛肉膏5.0g/L、蛋白胨10.0g/L、氯化鈉5.0g/L，pH 7.0～7.2。

實施例1：菌株篩選

取成都市長安垃圾填埋場(位于成都市龍泉驛區(qū)洛帶鎮(zhèn)萬興鄉(xiāng))滲濾液適量，按20％的接種量加入含5L硫代硫酸鈉培養(yǎng)基的反應(yīng)器中，在pH＝7.0，0.5L/min，30℃的條件下富集培養(yǎng)7天，采用硫化鈉培養(yǎng)基進行平板分離，3～4天后菌落生成，挑取單菌落接入平板中培養(yǎng)，重復(fù)劃線分離4次以上獲得純菌。

實施例2：菌株鑒定

將菌株按照相同的接種量接種于硫代硫酸鈉液體培養(yǎng)基中，置于不同溫度的搖床中(20℃、25℃、30℃、40℃)培養(yǎng)30h，確定該菌株最適生長溫度為30℃；采取初始pH別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在最適生長溫度下培養(yǎng)30h，確定最適生長pH為7.0。

將分離純化的菌株在掃描電子顯微鏡(SEM)下觀察，如圖1所示，該菌形態(tài)為桿狀，長2.0～6.0μm，寬0.8～1.2μm，無鞭毛；革蘭氏鑒定為陰性。

采用細菌全基因組快速抽提試劑盒，提取純菌株的全基因組，通過選用細菌16SrDNA通用引物27F和1492R進行PCR，然后測序分析。測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對，鑒定該菌株為紅細菌，命名為Rhodobacter sp.DS-17，即為本發(fā)明的保藏菌株紅細菌CGMCC No.12631(Rhodobacter sp.DS-17)。

對紅細菌菌株DS-17進行生長曲線研究，分別選用硫代硫酸鈉培養(yǎng)基進行自養(yǎng)培養(yǎng)和有機碳源異養(yǎng)培養(yǎng)基進行異養(yǎng)培養(yǎng)，結(jié)果如附圖2(a)、(b)所示：(a)紅細菌DS-17可以在硫代硫酸鈉培養(yǎng)基中生長，培養(yǎng)30h后菌液OD值達到0.32；(b)紅細菌DS-17在能夠在有機碳源異養(yǎng)培養(yǎng)基中快速生長，培養(yǎng)30h后，菌液OD值達到1.13，遠高于在無機環(huán)境中培養(yǎng)的結(jié)果。這說明該菌的營養(yǎng)類型為兼性營養(yǎng)型；在工程應(yīng)用中可以使用有機碳源異養(yǎng)培養(yǎng)基快速獲得高密度菌體。

實施例3：脫硫瓶試

將200ml硫化鈉培養(yǎng)基溶液(600mg/L S^2-)在紫外下滅菌30min，無菌條件下裝入已滅菌的500ml三角瓶中，然后加入50ml接種培養(yǎng)30h后的紅細菌菌液，用好氧塞塞住瓶口，置于搖床中振蕩(30℃、200r/min)，測定初始硫化物濃度為504mg/L；所述硫化鈉培養(yǎng)基配方為：Na₂S.9H₂O 10.0g，KH₂PO₄ 1.0g，K₂HPO₄ 1.0g，NH₄Cl 0.2g，MgCl₂ 0.2g，NaHCO₃ 1.0g，微量元素溶液1ml，維生素溶液1ml，用1mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH至中性。

對照組加入等量的無菌水，每個實驗組設(shè)置三個重復(fù)，每隔30分鐘取樣測定硫化物濃度、單質(zhì)硫濃度，取平均值。在4.5小時后，硫化物濃度幾近于零，其測定計算結(jié)果如附圖3(a)、(b)所示。實驗組硫化鈉溶液中添加該脫硫菌后，其硫化物去除效果明顯，達到99.85％；單質(zhì)硫累積濃度最高可達到293.01mg/L，相應(yīng)的轉(zhuǎn)化率達到58.06％。對照組中硫化物的去除是由于搖瓶振蕩促進了硫化物的逸出，但從單質(zhì)硫轉(zhuǎn)化率可以看出，硫化物的去除只是單純的物理性移除，并不是生物轉(zhuǎn)化去除。

實施例4：脫硫罐試

將5L硫化鈉培養(yǎng)基溶液(設(shè)計初始濃度為1200mg/L S^2-，實測S^2-濃度為1079.13mg/L)裝入已滅菌的8L的反應(yīng)器中(反應(yīng)器中添加有軟性填料，用以微生物掛膜)，然后加入500ml接種培養(yǎng)30h后的紅細菌菌液，用空氣泵曝氣，曝氣速率為0.4L/min，保持環(huán)境溫度為28℃～30℃，每天定時定量添加硫代硫酸鈉培養(yǎng)基，在此條件下馴化7天，使微生物能夠在填料上附著，然后進行去除硫化物的驗證試驗；在實現(xiàn)菌體在反應(yīng)器中掛膜成功后，往反應(yīng)器中添加1000ml通過紫外滅菌的硫化鈉培養(yǎng)基溶液；對照組加入等量的無菌水，每個實驗組設(shè)置三個重復(fù)，每隔30分鐘取樣測定硫化物濃度、單質(zhì)硫濃度，取其平均值。在3h后，其測定計算結(jié)果如下表1所示。

表1紅細菌罐試脫硫效果

由上表可知，在實驗組實現(xiàn)掛膜后的反應(yīng)器中，加入硫化鈉溶液3小時后，硫化物濃度比對照組去除率明顯要高，單質(zhì)硫產(chǎn)率明顯要高，其中硫化物去除率可達到99.95％，實際單質(zhì)硫轉(zhuǎn)化率可達到49.39％。與實例3相比，成功掛膜的反應(yīng)器中，該菌株對硫化物的去除速率更快，效率更高，可實施用于脫硫應(yīng)用。對照組中硫化物的去除是由于空氣吹脫導(dǎo)致硫化物的逸出，但從單質(zhì)硫轉(zhuǎn)化率可以看出，硫化物的去除只是單純的物理性移除，并不是生物轉(zhuǎn)化去除。

實施例5：生物硫顆粒觀察

對紅細菌DS-17處理后廢水中的單質(zhì)硫聚合形成的生物硫顆粒進行了掃描電子顯微鏡觀察，結(jié)果如附圖4所示：廢水中的生物硫顆粒形態(tài)大小不一，顆粒表面有微孔。

序列表

<110>中國科學(xué)院成都生物研究所

<120>一株脫硫紅細菌及其應(yīng)用

<160>1

<210>1

<211>1282

<212>DNA

<213>紅細菌（Rhodobacter sp.）

<400>1

gcggacgggt gagtaacgcg tgggaacgta ccctttggta cggaatagcc ccgggaaact 60

gggagtaata ccgtatggtg tcttcggact aaagatttat cgccaaagga tcggcccgcg 120

ttggattagg tagttggtgg ggtaatggcc taccaagccg acgatccata gctggtttga 180

gaggatgatc agccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt 240

ggggaatctt agacaatggg cgcaagcctg atctagccat gccgcgtgag tgatgaaggc 300

cctagggttg taaagctctt tcagctggga agataatgac ggtaccagca gaagaagccc 360

cggctaactc cgtgccagca gccgcggtaa tacggagggg gctagcgttg ttcggaatta 420

ctgggcgtaa agcgcgcgta ggcggattga aaagttgggg gtgaaatccc ggggctcaac 480

ctcggaactg ccttcaaaac tatcagtctg gagttcgaga gaggtgagtg gaattccgag 540

tgtagaggtg aaattcgtag atattcggag gaacaccagt ggcgaaggcg gctcactggc 600

tcgatactga cgctgaggtg cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag 660

tccacgccgt aaacgatgaa tgccagtcgt cgggcagcat gctgttcggt gacacaccta 720

acggattaag cattccgcct ggggagtacg gccgcaaggt taaaactcaa aggaattgac 780

gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcgc agaaccttac 840

caacccttga catggtgatc gtagtttcca gagatggatt cgtcagttcg gctggatcac 900

acacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttcggtt aagtccggca 960

acgagcgcaa cccacgtcct tagttgccag cattcagttg ggcactctag ggaaactgcc 1020

gatgataagt cggaggaagg tgtggatgac gtcaagtcct catggccctt acgggttggg 1080

ctacacacgt gctacaatgg tagtgacaat gggataatcc ccaaaagcta tctcagttcg 1140

gattggggtc tgcaactcga ccccatgaag tcggaatcgc tagtaatcgc gtaacagcat 1200

gacgcggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat gggagttggg 1260

tctacccgaa ggtggtgcgc ta 1282